叶绿体色素的提取、分离,测定叶绿素a、b含量

实验四、叶绿体色素的提取、分离及叶绿素a、b含量的测定刘家富（40508014）05生科（一）一、实验原理脂溶性叶绿体色素提取：可用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。分离：（1）叶绿体色素的分离v纸层析法〉因吸附剂对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各种成分在两相（固定相和流动相）间具有不同的分配系数，所以移动速度不同，经过一定时间后，可将各种色素分开。纸层析是以滤纸纤维为固定相，而以有机溶剂作为流动相。由于样品中各物质有不同的分配系数，移动速度因此而不同，从而达到分离的目的。（2）叶绿素与类胡萝卜素的分离＜皂化反应＞叶绿素是一种二羧酸——叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇与叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开。叶绿素a、b含量的测定：根据朗伯—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其溶液浓度c和液层厚度L成正比即A=fCL®为吸光系数）因此，根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其吸光度，用公式即可计算出提取液中各色素含量。测定663nm和645nm两个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b在对应波长下的吸光系数即可求出叶绿素a、b含量。其校正过的公式为:C=12.7A663—2.69A645Ca:叶绿素a浓度,mg/LaCb=22.9A645—4.68A663Cb:叶绿素b浓度,mg/LCT=Ca+CbCT:叶绿素总浓度,mg/L二、仪器药品剪刀、漏斗、烧杯、分光光度计、分液漏斗、铁架台、移液管、吸耳球、试管、毛细管、平底大试管、石英砂、碳酸钙、丙酮、乙醚、四氯化碳、无水硫酸钠、30%KOH-甲醇溶液、天平、研钵、滤纸三、操作步骤叶绿体色素的提取取去中脉叶片（2g左右），剪碎后加入少量石英砂、碳酸钙、纯丙酮5ml后放入研钵研磨成匀浆成深绿色提取液，之后用漏斗过滤。叶绿体色素的分离（纸层析法）⑴制备：长条滤纸（宽2*20cm）,将其一端剪去两侧，中间留一0.5*1.5cm的窄条。⑵点样：用毛细滴管吸取叶绿素溶液在窄条的上方点样（少量多次）,在平底试管中加推动剂3-5mL（四氯化碳+少量无水硫酸钠），把长条滤纸一端挂在橡胶塞下的大头针上，调节长度使纸条下端的窄条浸入推动剂中，注意色素点不可浸入。⑶观察：等到推动剂扩散至滤纸条上沿约2cm时,取出滤纸，铅笔标明推动剂边缘，观察分离后色素带的分布。叶绿素的理化性质⑴荧光现象观察取上述色素丙酮提取液少许于试管中，观察在反射光和透射光一侧提取液的颜色有无不同。⑵铜代反应取上述色素丙酮提取液少许于试管中，逐滴加入浓盐酸，直至溶液出现褐绿色；此时再加入醋酸铜晶体少许，慢慢加热溶液。仔细观察，记录实验现象并解释原因。叶绿素和类胡萝卜素的分离（皂化作用取色素提取液（约10ml）放入加了10ml乙醚分液漏斗中，再加入20ml蒸馏水摇动。静置一会，溶液分两层，上层为色素＋乙醚（用蒸馏水冲洗1~2次），下层为丙酮+水（弃去）。然后再加入5ml30%KOH甲醇溶液用力摇动静置10分钟后加入5ml蒸馏水摇动静置分离，溶液分为两层。叶绿素d和b含量的测定（分光光度法）⑴称取新鲜叶片（避开叶脉）0.5g，加纯丙酮3ml和少许碳酸钙、石英沙研磨成匀浆，转入离心管，用适量80%丙酮洗涤研钵，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清液用80%丙酮定容至10ml。⑵取上述色素提取液1ml，加80%丙酮4ml，混匀后转入比色皿，以80%丙酮为参比，分别测定663nm、645nm处的光密度值。照公式计算色素提取液中叶绿素a/b以及a+b的浓度；再根据稀释倍数分别计算每克鲜重叶片中色素的含量。波长吸光度645nmA645=?Ca=12.7A663—2.69A645Cb=22.9A645—4.68A663CT=Ca+Cb663nmA663=?=8.02A663+20.21A645叶绿素含量（mg/g）=（CTX提取液体积X稀释倍数）F样品鲜重或干重四、注意事项层析时应尽量不使滤纸条边缘贴壁液漏斗的正规操作机溶剂的使用必须注意安全！光光度计的正规操作五、实验结果及分析（1）纸层析法的结果在本实验中，纸层析法没有达到分离的结果，只出现了两条带——绿色和黄色，也不能分清楚这到底是哪条带（色素）询问了其他组，也未得到预想的结果，就连周四组也未有相应的结果，均以失败告终。经过仔细分析，可能实验结果有问题（分析及对策见最后的讨论）（2）叶绿体的荧光现象在反射光侧观察到了血红色，透射光下为绿色分析：由于叶绿素在光照下可产生暗红色的荧光。实验所观察到的血红色即为荧光现象。（3）铜代反应加入浓盐酸后产生褐绿色，加醋酸铜晶体，慢慢加热，又产生鲜亮的绿色。分析：1、加入浓盐酸，叶绿素的镁可被氢离子取代，从而变为褐绿色。2、加入铜以后，去镁叶绿素经过铜的取代之后变为了铜代叶绿素。3、实验结果所观察到的鲜亮的绿色即为铜代叶绿素。（4）皂化反应最后得到上层溶液为:黄色素，下层溶液为：叶绿素。分析：1、首先利用乙醚将叶绿体色素溶解（没有水分）；2、由于叶绿素是一种二羧酸-叶绿酸与甲醇褐叶绿醇形成的复杂酯，当加入KOH发生皂化反应而生成醇和叶绿酸的盐；3、盐能溶于水，当加入5mL水后，乙醚处于上层（包括黄色素），而下层即为反应生成盐类溶于水中，为绿色；4、故上层的黄色层为类胡萝卜素+乙醚，下层的绿色层为叶绿素经过反应之后的叶绿酸和醇的盐溶液。（5）叶绿素a、b含量的测定得到的结果为：波长吸光值645A645=0.119663A663=0.344Ca=12.7A663-2.69A645=4.05469mg/LCb=22.9A645-4.68A663=1.1083mg/LCT=Ca+Cb=&02A663+20.21A645=5.163mg/L叶绿素含量（mg/L）=（CTX提取液体积X稀释倍数）*样品鲜重=（5.163X10/1000X5）十0.5=0.5163mg/g分析：1.能够利用该公式获得相应的叶绿素的含量；2.菠菜的叶绿素a、b的含量高；3．与真实的有偏差，可能室内光线太强，叶绿素有破坏。讨论：（1）纸层析法的问题：失败分析：1.在实验过程中2g的菠菜加入了15mL的丙酮，这样的色素浓度不高；2．在浓度不高的前提下，层析法又只是在滤纸片上点上一点，重复多次，显然该点所具有的色素很少；3.在剪纸方面相成的“凸”形，这样无形的给推动剂设置了一道不可逾越的“坎”，使得ccl4的推动能力下降，多个小组的ccl4均不能到达上沿1.5—2.0cm处；滤纸过长，推动剂推动上去很困难。修改意见：针对浓度低，可以在第二次加入5ml丙酮；针对点一点太少。可以划一条线（该线需直）；针对有“坎”，可以将“凸”改为三角形的缺口，只是顶端不是完全尖状；针对滤纸过长，可以将20cm换为15cm。（参考高中人教版生物教材）（2）怀疑：经过实验，证明了色素的荧光现象，铜代反应，叶绿素的皂化反应。但是本实验根本不能证明荧光现象是叶绿素的，铜代反应也是叶绿素的，因为我们使用的丙酮提取液，其包括类胡萝卜素。补充意见：皂化反应实现了叶绿素和类胡萝卜素的分离，故可以补充如下：将皂化反应得到的上层黄色层（乙醚+类胡萝卜素）用来重复本实验的“荧光现象观察”，“铜代反应”步骤。若没有观察到“荧光现象”，“铜代反应”，方可证明本实验的结果是叶绿素的作用现象，而不是类胡萝卜素的现象。