卡那霉素所致小鼠耳蜗细胞凋亡途径的研究

卡那霉素所致小鼠耳蜗细胞凋亡途径的研究 卡那霉素所致小鼠耳蜗细胞凋亡途径的研 究 广东医学2011年1月第32卷第1期 GuangdongMedicalJournalJan.2011,Vo1.32,No.1 298l一2991. [4]MARRSJ,ZUBALBA.Oneologynu~inginanewera:optimi— zingtreatmentwithbevacizumab[J].ClinJOncolNuts,200913 (5):564—572. [5]LAGUILLIERC,HBIBIAT.CelldeathinNF—kappaB—de- pendenttumourcelllinesasaresultofNF—kappaBtrappingby linker—nmdifiedhairpindecoyoligonucleotide[J].FEBSLett, 2007,581(6):1143—1150. ? 31? [6]PARRYTJ,BROSIUSR.Drug—elutingstents:sirolinmsand paclitaxeldifferentiallyaffectculturedcellsandinjureda~efies [J].EurJPharmaeol,2005,524(1/3):19—29. [7]StriethS,EichhornME.Paclitaxelencapsulatedincationiclipo- somesincreasestumormicrovesselleakinessandimprovesthera— peuticefficacyincombinationwithCisplatin[J].ClinCancer Res,2008,14(14):4603—4611. (收稿日期:2010—06—20编辑:祝华) 卡那霉素所致小鼠耳蜗细胞凋亡途径的研究冰 5-ff'J,汤浩,王爱梅 辽宁医学院生理教研室(辽宁锦州121001);2中国医科大学生理教研室(辽宁沈阳 110001) 【摘要】目的探讨卡那霉素所致小鼠耳毒性的细胞凋亡机制.方法采用小鼠耳毒 性模型,结合形态学 和听力学研究方法,研究卡那霉素所致小鼠耳毒性的凋亡机制.结果小鼠的听觉功能呈时间依赖性的损害;耳 蜗内细胞凋亡是小鼠听觉功能损害的机制之一,caspase一3,Bcl一2,Bax等细胞凋亡信号转导途径都不同程度地 参与了这个过程.结论卡那霉素所致小鼠听觉损害的机制之一是耳蜗内细胞经多种途径最终发生凋亡的 结果. 【关键词】卡那霉素;耳毒性;耳蜗;凋亡 氨基甙类抗生素(AminoglycosidesAntibiotics, AmAn)广谱,高效,价格低廉,不易产生耐药性,曾被广 泛用于治疗革兰阴性菌感染的疾病.但氨基糖甙类抗 生素可引起严重耳蜗毒性,前庭功能紊乱甚至肾毒性 等不良反应,这也严重限制这类药物的应用.然而,在 肠球状菌,绿脓杆菌感染疾病以及肺结核的治疗中, AmAn仍然占据着主导地位.因此,对于AmAn的耳 毒性研究一直没有停止过.2008年9月至2010年5 月本研究以建立小鼠AmAn耳毒性模型为基础,观察 在AmAn耳毒性作用过程中,耳蜗内组织细胞的损伤 情况及特点;研究AmAn耳毒性引起的以细胞凋亡为 主要途径的耳蜗内组织细胞损伤过程及特点. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1实验动物BALB/c小鼠:50只,雄性,4周龄,体 重15,l7g(中国医科大学实验动物中心提供). 1.2实验药品及试剂Kanamycinsulphate(Ameres— CO,k0408,25g/bottle);DAB染色试剂盒(Uhravision onedetectionsystem,HRPpolymer&DABplus,Ther— nlO,CA);TUNEL试剂盒(InSituCellDeathDetection Kit,Fluorescent,Roche,catl1684795910);抗体 caspase,3(SantaCruz.sc7148).Bcl一2(SantaCruz. sc492),Bax(B一9,sc7480):Phalloidinconjugated— FITC(sigmaP5282),Gel/mountanti—fadingmedium (M01gelmount一20mL,Biomeda,CA). 1.3实验方法 1.3.1小鼠耳毒性模型的建立将雄性BALB/c小 鼠50只,分成5组:对照组及给药7,10,14,21d组,每 辽宁省教育厅科技计划项目(编号:L2010267) 组l0只.按750mg/kg的剂量,皮下注射给药,每天 两次,间8h 1.3.2实验动物的听觉功能检测腹腔注射2%戊 巴比妥钠(90mg/kg)麻醉小鼠后,俯卧位固定,安放听 觉检测(ABR)电极:记录电极置于颅顶正中的皮下,参 考电极置于被测耳的乳突部皮下,地线置于对侧耳的 乳突部皮下.选用INTELuGENTHEARINGSYSTEMS (USA)中的Smart—EP功能选项,分别以8,l6,24kHz 频率tone—burst(短纯音)作为刺激声,给予刺激,刺激 速率为39.10次/s,刺激持续时问为5cycles,记录分析 时间为16.0ms,能分辨出I或?波波型的最低刺激强度确 定为阈值,并重复两次.测试前校正仪器的准确性…. 1.3.3耳蜗基底膜免疫荧光染色将小鼠断颈处死, 迅速取出耳蜗放入冰冷的PBS中,用4%PFA灌流固 定,打开蜗壳,分离取出基底膜,置于载玻片上,再滴加 4%PFA室温下固定1h;PBS洗5minX3;Triton x一100透化1.5h;PBS洗5minX3;5%正常山羊血清 室温封闭2h;PBS洗5minX3;加Phalloidin—FITC反 应液室温下避光反应1h;PBS洗5rain×3;将基底膜 平整地铺于载玻片上,滴加抗荧光淬灭的封片剂,封 片,于激光共聚焦显微镜下观察. 1.3.4小鼠耳蜗石蜡切片的免疫组织化学检测将 小鼠断颈处死,迅速取出耳蜗放入冰冷的PBS(磷酸盐 缓冲液)中,耳蜗内灌注4%PFA(多聚甲醛)固定,然 后将耳蜗置入4%PFA中,4cc固定24h.PBS冲洗后, 再置入4%EDTA中脱钙5d,每天更换脱钙液1次,至 蜗壳的骨壁完全脱钙,去除多余的部分.将处理好的耳 蜗放入全自动脱水透明机(ThermoScientific)中,进行脱 水透明浸蜡处理过夜,石蜡包埋,切片(厚度5,8m). ? 32?广东医学2011年1月第32卷第1期 GuangdongMedicalJournalJan.20l1,Vo1.32,No.1 石蜡切片正常脱蜡至水,PBS洗5rain×3;于 0.1%柠檬酸盐缓冲液中,350W微波抗原修复5,10 min,然后冷却至室温;PBS"洗5minX3;使用试剂盒中 溶液1(Uhravisiononedetectionsystem,HRPpolymer& DABplus,Thermo,CA)进行内源性过氧化物酶阻断 3;滴加试剂盒中溶液2,室 10,15rain;PBS洗5min× 温反应5min;加一抗(caspase一3,Bcl一2,Bax),4? 过夜;室温下复温30min;PBS洗5min×3;加溶液3, 室温下反应5,15min;PBS洗5rain×3;苏术素复染 1—2min;流水冲洗20min;盐酸酒精分化10S;流水冲 洗10min;梯度酒精脱水,二甲苯透明,封片. 1.3.5TUNEL实验研究将小鼠耳蜗石蜡切片常规 脱蜡至水,350W微波抗原修复5min,并逐渐冷却至 室温,PBS洗5min×3,于样本上滴加TUNEL反应混 合液(enzymesolution与labelsolution1:10混合),于湿 盒中37qC避光孵育60min,PBS洗5rain×3,Hoe— chest33342复染10min,PBS洗5rain×3,滴加抗淬灭 的封片剂,封片,在荧光显微镜下观察. 1.4统计学方法使用Prism5.0统计软件,对听觉 脑干反应(ABR)不同频率的阈值进行one—way ANOVA分析. 2结果 2.1听觉功能检测(听觉脑干反应检测,ABR)卡那 霉素耳毒性作用导致实验小鼠ABR阈值上升,听觉功 能下降(见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1).随着用药时间的延长(7,l4,21d), 听觉阈值上移幅度显着性增加;卡那霉素的耳毒性作 用对于不同频率的听觉阈值影响不同;高频听力与低 频听力比较,听力损害发生早,程度大(21d>14d>7 d),呈时间依赖性. 表1不同频率的脑千反应昕觉阈值(?s)dBSPL 频率对照组第7天第l4天第2l灭 8kHz0.83?3.591.67?7.78 l6kHz1.00?2.62607?738 24kHz0.83?2.57l2.50?6.77 与对照组比较$P<0.05,P<0.O1 2.2耳蜗基底膜免疫荧光染色耳蜗基底膜染色显 示(见图1),基底膜上外毛细胞受卡那霉素影响显着, 图1一a显示正常基底膜外毛细胞,排列整齐,纤毛正 常,呈"V"形;图1一b显示用药14d组小鼠基底膜染 色,外毛细胞损害明显,纤毛紊乱(不再呈规则的"V" 形)或缺失(外毛细胞顶端无纤毛),甚至有的外毛细 胞已经缺失,基底膜表皮板出现"瘢痕". a:正常对照组;l,:用药组 图1耳蜗基底膜铺片的Phalloidin—FITC染色(箭头所指为外毛细胞) 一一 一一 骥, \ ,.===t逸 a:正常对照组;b:第7大;c:第14天;d:第21天 图3耳毒性模型小鼠耳蜗石蜡切片caspase一3蛋白表达(×400, 箭头所指为ca~pase一3蛋白表达的阳性细胞) 2.3.3Bax/Bcl一2检测耳蜗基底膜,螺旋神经节等 处的细胞现了明显的强阳性染色,甚至前庭膜上也 出现了阳性染色.但在不同的用药时间组(第7,l4, 21天)之间比较,Bax/Bcl,2的表达与用药时间没有 显着的正相关性. 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 卡那霉素引的耳蜗内组织细胞 凋亡,Bax/Bcl一2介导的细胞凋亡信号转导途径参与 了这一过程,但不是主要的唯一的凋亡途径.见 图4,5 如勰 O98 ?+一? 朋 踮 ?? 广东医学2011年1月第32卷第1期 GuangdongMedicalJournalJan.2011,Vo1.32,No.1 离? a:正常对照组;b:第7天;c:第14天;d:第21天 图4耳毒性模型小鼠耳蜗石蜡切片Bax蛋白表达(X400,箭头所 指为Bax蛋白表达阳性的细胞) , ?‰一 啜喀 0蠢 --? a . 一 一一 \ ' , , a:正常对照组;b:第7天;e:第14天;d:第21天 图5耳毒性模型小鼠耳蜗石蜡切片Bel一2蛋白表达【×400,箭头 所指为Bcl一2蛋白表达阳性的细胞) 3讨论 氨基甙类药物卡那霉素可以引起小鼠的耳毒性, 表现为小鼠听觉阈值的升高,听觉功能的下降;小鼠听 觉功能的损害与用药时间呈正相关性.实验结果表 明,小鼠在高频段(16,24kHz)的听觉功能较低频段(8 kHz)先受到卡那霉素的影响,听觉阈值呈时间依赖性 地升高.耳蜗基底膜的荧光染色显示,卡那霉素导致 基底膜外毛细胞的损伤,引起基底膜结构的破坏. 那么导致外毛细胞损害乃至耳蜗内其他组织细胞损伤 的机制又如何呢?有研究认为,这是一个多冈素参与 的,经过多种途径的损伤VLN,其中也包括细胞凋 亡途径.TUNEL检测结果显示,在卡那霉素作用过 程中,耳蜗内组织细胞出现凋亡信号,且与用药时间呈 正相关性,这说明卡那霉素的耳毒性作用机制是引起 耳蜗内组织细胞凋亡.而经典的凋亡调控因子 caspase一3的检测却表明,caspase一3的表达较弱,且 ? 33? 并不与用药时间之间存在明显的正相关性,说明卡那 霉素所致的耳毒性导致耳蜗内组织细胞的凋亡, caspase一3很少甚至可能没有参与这个过程.Bax/Bcl 一 2凋亡因子检测结果显示,在卡那霉素所致小鼠耳 毒性过程中,这些细胞凋亡信号均呈强阳性反应,这说 明这些细胞凋亡信号转导途径都参与了卡那霉素的耳 毒性过程,它们的表达在用药较短时问情况下(第7, 14天)呈一定的时间依赖性,但随着用药时间延长(第 21天),就不再具有正相关性.这也许提示在卡那霉 素耳毒性的早期,耳蜗内组织细胞损伤可能主要是通 过这些凋亡途径,而到晚期时则有其他损伤机制的参 与.换而言之,卡那霉素可以通过多途径的凋亡信号 转导途径引起小鼠耳蜗内组织细胞的凋亡,也可以通 过其他损伤机制的作用,并最终导致耳蜗内组织细胞 的损伤.结果显示,受到影响的耳蜗内组织细胞如 基底膜细胞(包括外毛细胞),血管纹细胞,螺旋神经 节细胞等…,这些组织细胞的损伤可引起听觉信号 的转导发生障碍,小鼠的听觉功能因此呈现显着性的 下降.除此之外,无论caspase一3还是Bax/Bcl一2,这 些凋亡因子的表达并不能很好地解释小鼠的听觉功能 损害与用药时间之问的正相关性,说明在卡那霉素所 致的小鼠耳毒性过程中,这些已知的经典凋亡途径并 不是介导耳蜗内细胞凋亡的主要途径,或者说可能不 是单独参与而是相互协同,也许还伴有其他细胞损伤 机制的参与,共同调控耳蜗内细胞的凋亡过程.因此, 对于卡那霉索引起耳蜗内细胞凋亡的耳毒性机制还需 进一步的研究来阐释. 参考文献 [1]于利,汤浩.CBA,BALB/c,C57,昆明系小鼠及豚鼠的正常听 觉脑干反应特性的观察[J].中国应用生理学杂志,2008,24 (3):315—318. [2]ABRASHKINKA,IZUMIKAWAM,MIYAZAWAT,eta1.The fateofouterhaircellsafteracousticorototoxieinsults[J].Hear Res,2006,218(1/2):20—29. [3]POIRRIERAL,VANDENACKERVEKENP,KIMTS,eta1. Ototoxicdrugs:differenceinsensitivitybetweenmiceandguinea pigs[J].ToxicolLett,2010,193(1):41,49. [4]MURILLOCUESTAS,CONTRERASJ,CEDIELR,eta1.Compari? sonofdifferentaminoglycosidem~tibiotietreatmentstorefineototoxiei— tystudiesinadultmice[J].LabAnim,2010,44(2):124—131. [5]GUTHRIEOW.Aminoglyeosideinducedototoxieity[J1.Toxicol— ogy,2008,249(2/3):91—96. [6]RYBAKLP,RAMKUMARV.Ototoxicity[J].KidneyInt, 2007,72(8):931—935. f7]TALEBM,BRANDONCS,LEEFS,eta1.Hsp70inhibitsami— noglycoside—inducedheatinglossandcochlearhaircelldeath [J1.CellStressChaperones,2009,14(4):427—437. [8]JIANGH,SHASH,FORGEA,eta1.Caspase—independent pathwaysofhaircelldeathinducedbykanamycininvivo[J].Cell DeathDiffer,2006,13(1):20—30. [9]杨俊慧,刘兆华.卡那霉素耳慢性中毒后豚鼠耳蜗细胞凋亡 的观察[J].中国眼耳鼻喉科杂志,2004,4(2):91—93. [1O]李婷钰,王苹,杜波,等.卡那霉素对离体培养大鼠耳蜗毛细胞损 害的实验研究[J].巾国老年学杂志,2010,30(I):56—58. (收稿日期:2010—06—15编辑:祝华) 0……蛊