【WORD论文原稿】双嵌段磷酸胆碱共聚物中和 AS-ODN 及其

【WORD论文原稿】双嵌段磷酸胆碱共聚物中和 AS-ODN 及其 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 与论文网:www.docin.com/week114 双嵌段磷酸胆碱共聚物中和 AS-ODN 及其 细胞转染 孙甜甜 (中国矿业大学材料学院，江苏 徐州 221116) 5 摘要:目的: 探讨载体 MPC30-DEA70 能否有效的转染针对人 c-myc 基因的反义寡核苷酸 (c-myc AS-ODN)，以及 MPC30-DEA70/ c-myc AS-ODN 复合物能否抑制 Hela 细胞增殖。方 法: 将载体 MPC30-DEA70 与 c-myc AS-ODN 生成+/-电荷比值为 0:1，0.5:1，1:1，3:1， 5:1 和 10:1 的复合物，应用激光共聚焦显微镜观察 MPC30-DEA70 分子在细胞内的转运机 制，同时应用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT) 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 载体对 Hela 细胞增殖的抑制性。 10 结果:载体 MPC30-DEA70 能够转入细胞，围绕在细胞核周围，少部分进入细胞。结论: 新型 阳离子磷酸胆碱聚合物 MPC30-DEA70 可以有效负载和运输反义寡核苷酸 c-myc AS-ODN，抑 制 Hela 细胞增殖，是一种安全有效的非病毒类转基因载体。 关键词:基因转染;MTT ;细胞转染 中图分类号:Q 15 AS-ODN Complexation with Phosporylcholine Diblock Copolymers and Its Effect on Cell Transfection Sun Tiantian (School of Materials Science and Engineering, China University of Mining and Technology, 20 JiangSu XuZhou 221116) Abstract: MPC30-DEA70/c-myc AS-ODN complexes were formed at different N/P ratios (cationic/anionic) conditions. The complexes were studied using fluorescent microscopy and MTT assay. The results showed that MPC30-DEA70/AS-ODN polyplexes were formed through electrostatic self-assembly, significantly with the increasing of N/P ratios. The complexes could be transfered into 25 the Hela cells and the transfection efficiency were significantly enhanced with the increasing of N/P ratios as well. These results indicate that this novel cationic phosphorylcholine copolymer can load and transport human c-myc antisense oligodoxynucleotides, which may act as an efficient and safe non-viral gene transfer vector. Keywords:gene delivery; MTT; cell transfection 30 0 引言 随着在细胞分子水平上对疾病发病机制认识的深入，基因治疗已成为目前医学分子生物 学最重要的研究领域之一。基因治疗就是指通过在特定靶细胞中表达细胞自身不表达的基 因，或采用特定方式关闭、抑制异常表达的基因，达到治疗疾病的目的。无论是病毒载体还 [1]35 是非病毒载体都必须通过适当的基因转移技术将外源基因转移至特定细胞内, 但是安全有 [2]效的基因运输载体仍是制约基因治疗发展的瓶颈问题。相对于病毒载体而言，非病毒载体 [3-5] 有许多优势，如生物相容性和安全性。本研究采用新型阳离子磷酸胆碱基聚合物 MPC30-DEA70 作为基因运输的载体，研究其对人类 c-myc 反义寡核苷酸的负载和运输能力， 达到辅助基因治疗的目的。 40 作者简介:孙甜甜，(1984-)，女，硕士研究生，生物纳米材料. E-mail: vs2008suntiantian@163.com - 1 - 标准与论文网:www.docin.com/week114 1 材料和 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 1.1 试剂 1.1.1 细胞株 Hela 细胞 45 1.1.2 基因载体 反义寡核苷酸: c-myc AS-ODN (序列为 5'-AAC,GTT,GAG,GGG,CAT-3'，5'末端加 FAM 标记) 基因药物载体:MPC30-DEA70 1.1.3 其他主要试剂 50 Fetal bonus serun(FBS);0.25%胰酶-0.02%EDTA ;青-链霉素(100×);DMEM(高 糖);ProlongAntifade Kit;DMSO (二甲亚砜);明胶; MTT(四甲基偶氮唑盐);琼脂 糖;DAPI 。 1.1.4 主要仪器 高速低温离心机;恒温培养箱;-80?冰箱;倒置显微镜;激光共聚焦显微镜;流式细 55 胞仪;超净工作台;普通离心机; 恒温水浴加热器;电泳仪;PHS-3 型酸度计;MK3 酶标 仪;磁力搅拌器;CO2 培养箱。 1.2 方法 1.2.1 阳离子磷酸胆碱聚合物的合成制备 参照文献，应用原子转移自由基聚合法(atom transfer radical polymerization，ATRP) [6,7]60 合成基于人工细胞膜材 MPC 的双嵌段磷酸胆碱聚合物 MPC-DEA。称取 10mg 3070 MPC-DEA加到 10ml 0.01mol/L 的 NaH2PO4/Na2HPO4 缓冲液(pH=6.8)中，于磁力搅 3070 拌器上搅拌过夜至完全溶解后，调 pH 值至 6.8，并用孔径 0.22μm 的滤器过滤，置 4?保存。 1.2.2 溶液制备 分别取 0，0.5，1.0，3.0，5.0 和 10.0μl 的 MPC-DEA溶液(1μg/μl)加入到 10.0μl c-myc 3070 65 AS-ODN 溶液(0.1μg/μl)中形成 N/P 比值为 0:1，0.5:1，1:1，3:1，5:1 和 10:1 的 MPC30-DEA70 /c-myc AS-ODN 复合物溶液。室温下平衡 30min 备用。 1.2.3 细胞培养 Hela 细胞采用 DMEM 培养基,含有 10%胎牛血清, 1%青-链霉素,在 37 ?孵箱 5%CO2 条件下培养。 70 1.2.4 细胞转染 在 24 孔细胞培养板中放入载玻片，每孔加 50.0μl 0.2%的明胶，于细胞培养箱中静置 1h， 弃掉多余的明胶并用 PBS 冲洗两次。按照每孔 2×104 个细胞接种于 24 孔细胞培养板， 37 ?，5% CO2 培养 24h 后弃培养基，PBS 冲洗两次，加入基因载体复合物溶液，于 37?，5% CO2 培养 24h 弃培养基，PBS 冲洗两次，每孔加 4%多聚甲醛 50.0μl 固定 10min，弃掉多余 75 的多聚甲醛，PBS 冲洗两次， PI(10μmol/L)染核 20min，或 DAPI 染核 10min，PBS 冲 - 2 - 标准与论文网:www.docin.com/week114 洗两次，封片，待封片液干燥后于激光共聚焦显微镜下观察并拍照。 1.2.5 MTT 法检测 MPC30-DEA70 对 HeLa 细胞毒性的影响 按照每孔 4×103 个细胞接种于 96 孔细胞培养板， 37?，5% CO2 培养 24h，细胞贴壁 后弃培养基，PBS 冲洗两次，加入载体溶液，每孔 200.0μl，每组同时设 5 个复孔，同时设 80 调零组(DMEM 培养液、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、 培养液、MTT、二甲基亚砜)，继续培养 24h，加 20.0μl(5mg/ml)MTT，37?，5% CO2 孵育 4h 弃培养基，每孔加 100.0μl DMSO，于摇床上避光低速震荡 10min 使结晶物充分溶解， 全自动酶标仪 570nm 检测吸光度(OD)。 2 结果 85 2.1 细胞转染 图 1. MPC-DEA载 FAM-c-myc AS-ODN 转染 HeLa 细胞的激光共聚焦显微镜图象。红色代表 PI 染色的 3070 整个细胞，绿色代表 FAM 标记的 c-myc AS-ODN。 90 Figure 1. Images of HeLa cells after transfection with copolymer/ AS-ODN polyplexes.Red color represented the cell by PI stain; green color represented FAM labeled c-myc AS-ODN. 图 1 是载体 MPC-DEA载 FAM 标记的 c-myc AS-ODN 转染 HeLa 细胞 24 h 后激光共 3070 聚焦显微镜下所观察到的影像。在图中可见绿色的 FAM-c-myc AS-ODN 不仅能够进入细胞 95 内，而且大部分围绕在细胞核周围，并且有少部分能进入到细胞核内，提示其有效的核定位。 2.2 MTT 法检测 MPC30-DEA70 对 HeLa 细胞毒性的影响 100 90 80 70 60 cell viabilityl (%) 50 400 10 20 30 40 50 60 polymer concentration (μg/ml) 图 2.载体 MPC-DEA对 HeLa 细胞的细胞毒性。 3070 Figure2. MTT assay for MPC-DEAcytotoxicity in Hela cells after 24h incubation. 3070 100 尽管高分子载体转染效果较好，但往往是以牺牲细胞活性为代价的。为了进一步 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 载 体 MPC-DEA的性能，我们应用 MTT 法进行了细胞毒性实验，如图 2 结果显示，对于 3070 HeLa 细胞，载体 MPC-DEA在一定条件下(浓度小于 25μg/mL，相当与 N/P=5:1 时的 3070 聚合物浓度)的细胞存活率很高，达到 85%以上，只有当聚合物浓度大于 25μg/mL 时细胞活 性才明显减低，说明我们所筛选出的载体 MPC-DEA不具有明显的细胞毒性，但仍要注 3070 105 - 3 - 标准与论文网:www.docin.com/week114 意剂量的控制。 3 结论 本文为了检测磷酸胆碱基聚合物 MPC-DEA对反义寡核苷酸(AS-ODN)是否具有优 3070 良的控制运输能力和满意的转染效率，本实验应用 DNA 凝胶电泳法，荧光显微镜，流式细 胞术和 MTT 法对 MPC-DEA/c-myc AS-ODN 复合物进行了表征。凝胶电泳结果表明 N/P 3070 110 比值越大，载体 MPC-DEA与 c-myc AS-ODN 中和的越多，复合物正电性越强;体外细 3070 胞摄取和流式细胞检测结果表明 MPC-DEA载体能显著提高 HeLa 细胞对 c-myc AS-ODN 3070 的摄入量，对于相同剂量的 c-myc AS-ODN，N/P 比值越大，进入细胞内的 c-myc AS-ODN 量越多;MPC-DEA载体用量过多时，对细胞活力有一定的不良影响，因此为了减少细胞 3070 毒性，实际应用时应注意控制载体用量的合理控制，达到满意的转染效率和细胞增殖抑制率。 以上结果显示新型阳离子磷酸胆碱聚基合物 MPC-DEA可以有效负载和运输反义寡核苷 3070 115 酸，是一种安全有效的非病毒类转基因载体，对于降低医学材料成本、减轻社会负担、改善 国计民生等方面具有非常重要的意义。 [参考文献] (References) 120 [1] THOMAS M.Non-viral gene therapy:Polycation-mediated DNA delivery[J].Microbiol Biotech,2003,94:1-14. [2] DINCER S.Growth inhibition of SK-MEL-30 human melanoma cells by antisense c-myc oligonucleotides delivered by poly(N-isopropylacrylamide)/poly(ethyleneimine)copolymer[J].Tissue Eng Regen Med,2009,4:284-290. 125 [3] CHAN KH.Vascular delivery of c-myc antisense from cationically modified phosphorycholine coated stents[J].bIOMATERIALS,2007,28(12):18-24. [4] WANG XF,REN KF.Delivery of surface-mediated onn-viral gene nanoparticles from ultrathin layer-by-layer mnltilayers[J].Sciense,2010,53;508-513. [5] MA Y,TANGY.Well-Defined Biocompatible Block Copolymers via Atom Transefer Radical Polymerization of 2-Methacryloyloxyethyl Phosphorycholine in Protic Media[J].Macromolecules,2003,36:3475-3484. 130 [6] ZHAO XB,PAN F.Plasmid DNA complexation with phosphorylcholine diblock copolymers and its effect on cell transfection[J].Langmuir,2008,24:6881-6888. - 4 -