QSD 012-污水及污泥中蛔虫卵的检测方法2

QSD 012-污水及污泥中蛔虫卵的检测方法2 污水及污泥中蛔虫卵的检测方法 ——集卵法 批 准 人: 批准日期:2002年6月6日 生效日期:2002年7月6日 有效版本:第 1 版 第 0 次修订 页 次:第 1 页 共 10 页 受控状态: 发放编号: 1 方法原理 本法总的原则是利用碱性溶液与样品充分混合～分离蛔虫卵～然后利用比重的不同～将分散在样品中的蛔虫卵集中起来～再进行检查并计数。所采用的方法一般有二种类型,因蛔虫卵的比重在1.10~1.16之间,。其一是飘浮法:用比重大的饱和氯化钠溶液,比重1.18,将蛔虫卵飘浮在溶液表面～收集 检验,其二是溶液沉淀法:利用比重小的水溶液～将蛔虫卵沉入溶液底～收集检验。 2 主要仪器 2.1 生物显微镜, 2.2 离心机, 2.3 电动振荡器, 2.4 滤膜(Ф35mm. 0.65—0.80um), 2.5 抽滤器, 2.6 大型载玻(4x7.5cm)～等。 3 主要试剂 3.1 饱和氯化钠溶液, 3.2 50%甘油, 3.3 5%氢氧化钠等。 4 方法步骤 4.1 飘浮法: 4.1.1 分离:称取5-10,,或ml,经过处理的样品于容量 50ml清洁铜离心管或塑料离心管中～注入5%氢氧化钠 溶液25-30ml～另加玻璃珠10粒～用适当大小的橡皮 塞子紧塞管口～臵电动振荡机上～振荡10-15min～每 分钟200-300次～静臵15-30min后～再行振荡～如此 重复3-4次～使样品为碱性溶液所浸透～加上玻璃珠的撞击和摩擦～则混合液中的蛔虫卵～不再被粘着在一起。 4.1.2 飘浮:从振荡机上取下离心管～揭去橡皮塞子～用滴管吸取清水～将附着在皮塞上和管口内壁的泥状物～冲入管中～以免一小部分卵的漏检～而后再在离心机上离心 3-5min～每分钟2000-2500转～倒去多余的氢氧化钠溶液～水洗一次～即加清水将沉淀物搅浑后～离心～倒去上面的脏水。随后加入少量饱和氯化钠溶液～用玻璃棒搅成糊状～添加饱和氯化钠溶液～随加随搅～直加到离管口约1cm为止～此时将附在玻棒上的混合液也用一两滴饱和氯化钠溶液～冲入管中～离心3-5min～每分钟2000-2500转～由于蛔虫卵的比重小于饱和氯化钠溶液的比重～因此经离心后～管中的蛔虫卵～就会飘浮在氯化钠溶液的表面。 4.1.3 移臵液膜～用直径小于1cm的金属丝圈～不断将表层液膜移于盛用半杯清水的小烧杯中～约30次后～再次搅拌和离心～适当增加一些饱和氯化钠溶液～如此反复操作3-4次～直到液膜涂片未查见虫卵为止。 4.1.4 抽滤:将烧杯中含卵混悬液～通过漏斗～抽滤于直径35mm～无裂纹和孔眼的微孔滤膜,2.4,上,混合悬液中的蛔虫卵,全部阻留在微孔滤膜上～有时由于样品中蛔 虫卵数量过多～浑浊度大～不易为一张滤膜过滤时～则 可另添一或二张滤膜～再抽滤。 4.1.5 镜检:抽滤完毕～立即用弯头小镊子～将滤膜从漏斗的 滤台上小心取下～平铺于大型载物玻璃片上(2.6)～趁 湿在低倍显微镜下直接检查～最好滴加两滴50%甘油溶 液～这样～蛔虫卵在比较透明而无气泡的视野中～便于 观察和计数。 沉淀法: 4.2 4.2.1 水洗:称取100g(或100ml)样品～放在500ml三角瓶 中～加入5%氢氧化钠溶液100-150ml和三四十粒玻璃 珠～塞以橡皮塞～浸泡半小时后～振摇3-4min～将上 面的液体～倒入大烧杯中～再加等量清水于三角烧杯 中～浸洗三、四次～直到洗出液透明为止。 4.2.2 过滤并用水洗沉淀:将前后收集的洗液～用1-2层纱布 过滤于1000ml锥形量杯中～静臵半小时至一小时后～ 倒去上层液体～如此～约半小时换水一次～直至上层水 澄清为止。 4.2.3 测定体积:用虹吸管慢慢吸去沉淀上面的液体～将沉淀 物倒入刻度量筒中～测量沉淀物的容积。 4.2.4 镜检:将沉淀物搅匀～迅速用1ml玻璃吸管吸取0.05 和0.1ml于载玻片～盖以盖玻片,在低倍镜下检查并计 算出总数。 5 计算结果 5.1 用饱和氯化钠溶液离心飘浮法时～5—20g,或ml,样品 中的蛔虫卵～高度集中在滤膜上～在显微镜下计数时容易 混乱～因此最好能在显微镜的目镜筒内～装上一枚目镜计 数网～利用移动尺有规律的移动～逐渐数完整个滤膜上的 全部蛔虫卵数。 5.2 在用水洗沉淀法时～需要准确测定沉淀物的容积～在用玻 璃吸管吸取沉淀以供镜检时～必须搅拌均匀而后取样～而 且需要观察若干次～而后取其平均数～从而计算1ml沉淀 物的虫卵数～最后乘以沉淀总容积数～即是100g,或 ml,原始样品的虫卵数。 6 蛔虫卵生活力测定法 6.1 直接镜检法:是根据蛔虫卵在发育过程中所出现的各种形 态～以鉴别其死活。首先是鉴别受精卵和未受精卵～其次 是鉴别有生活力和失去生活力,变性卵,的受精卵和含有 幼虫卵的形态。有关形态鉴别要点如下: 6.1.1 未受精蛔虫卵的形态: 多为椭圆形～有时呈三菱形或不规则形～大小平均为80-98×40-60um～一般为黄褐色～有时蛋白质发育不全～有时完全失去蛋白质壳～卵内经常充满大大小小油滴状的卵黄细胞。 6.1.2 受精虫卵的形态: 活的受精蛔虫卵的形态～蛋白质壳为黄褐色～脱去蛋白质 -70×40-50PM～外层的蛋白质壳的为无色透明～平均大小为50 壳也很厚～呈乳状或花纹状突起～卵内有一个球形的卵细胞～卵壳两端和卵细胞之间有半月形的空隙～卵内的卵黄颗粒清晰而致密～死受精蛔虫卵,变性卵,的形态～卵细胞移向一端～致使卵两端呈现有大小不等的半月形空隙。卵内脂肪变性～形成空泡～很像未受精卵～ 卵细胞颗粒减少或消失。卵细胞质浑浊～呈黑色或棕黑色。卵细胞向不定部位呈球状收缩。卵壳的一侧或两侧～一端右两端向内凹陷或破裂。只有蛋白质壳～而缺 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 物。 6.1.3 含有活幼虫卵的形态: 虫体的前后部没有颗粒～中部颗粒清晰而有金属光泽～有立体感～镜检时～注视或轻压～可有轻微蠕动～强压后～有时可挤出幼虫。 6.1.4 含有死幼虫卵的形态: 幼虫体内几乎充满颗粒～且模糊不清～无金属光泽～缺乏立体感～镜检时注视之～久久不见蠕动～稍稍加热或轻压～不 会蠕动～强压时～虽能挤出幼虫～但也不改变其原来的卷曲状态。 以上所列是死活蛔虫卵的一般形态～在镜检中有时会遇到外形发生变化的畸形活卵和各种形态的未受精卵～其它寄生虫卵～以及容易误认为寄生虫卵的异物。 6.2 滤膜培养法: 把上述通过饱和氯化钠溶液离心飘浮后,4.1,收集在滤膜上的蛔虫卵～经过计数后～直接用来培养测定蛔虫卵生活力～称为培养法。 6.2.1 在φ10-12cm的平皿底部平铺一层约1cm的脱脂棉～脱脂棉上铺一张直径与平皿等大的滤纸。加入2-3%甲醛溶液或甲醛生理盐水～以湿透滤纸和脱脂棉。把含卵滤膜平铺在皿中滤纸上～加盖～放在25?1?的恒温箱中培养一个月～经常加清水或2-3%的甲醛溶液～使滤膜保持潮湿状态。 6.2.2 培养一个月后取出滤膜臵于载片上～滴加50%甘油溶液～使其透明后～在低倍镜下查找蛔虫卵～然后在高倍镜下～根据形态～鉴定卵的死活～并加以计数～在载玻片上滴1-2小滴30%安替福尼液～蛔虫卵外面的蛋白质壳很快被溶解掉～内 部构造便于观察。凡含有幼虫的～都认为是活卵～其它阶段的或单细胞的～都判为是死卵。 7 备注 (1) 采样后如不能及时检测,需滴加35%福尔马林(或3%盐酸溶液)进行防腐,加盖后放臵冰霜中。 参考文献 〔1〕 堆肥蛔虫卵集卵法,GB7959-87 附录B, 〔2〕 《实用医学检验学》 上海科学技术出版社 2000.4