RACE技术

RACE技术RACE技术编辑近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术、基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法大多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。目录 1RACE技术的历史 2技术原理 ...

RACE技术编辑近年来随着生物技术的不断发展，出现了许多克隆新基因的方法和手段，如图谱克隆技术、转座子标签技术、mRNA差异显示技术、基因组减法技术以及cDNA文库筛选技术等。但上述方法大多具有实验周期长、技术步骤烦琐且工作量大等特点。cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)是一种基于PCR从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5'和3'末端的有效方法，以其简单、快速、廉价等优势而受到越来越多的重视。目录 1RACE技术的历史 2技术原理 3目前遇到的问题及解决方法 1RACE技术的历史经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA 5' 和3' 端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、特异性差的缺点(Frohm等，1995:Schaefer，l995: Chen，1998: Bespalova等，1998: Matz等11999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进: 改进之一是利用锁定引物(lock docking primer)合成第一链cDNA，即在oligo(dT)引物的3' 端引入两个简并的核苷酸[5'-Oligo(dT)16-30MN-3'，M=A/G/C;N=A/G/C/T]，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响; 改进之二是在5' 端加尾时，采用poly(C)，而不是poly(A); 改进之三是采用RNase H-莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温(60?~70?)有效地逆转录mRNA，从而消除了5' 端由于高CC含量导致的mRNA 二级结构对逆转录的影响; 改进之四是采用热启动PCR (hot start PCR)技术和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反应的特异性。随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMARTTM RACE技术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应，结果发现使用MarathonTM所得到的片断总是比采用SMARTTM RACE 试剂盒到所得到的片断短。其原因在于MarathonTM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5' 末端。所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTM RACE试剂盒。以下就国内目前应用最广的SMARTTM RACE试剂盒为例，简要概述RACE技术的原理和操作过程。 2技术原理 SMARTTM 3'-RACE原理利用mRNA的3' 末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。然后用一个基因特异引物GSP1(gene specific primer，GSP)作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer，UPM)作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3' 末端的DNA片段扩增出来。(见下图) SMARTTM 5'-RACE原理先利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5' 末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oligo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(见下图)。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer，UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer，GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。 3目前遇到的问题及解决方法实验中发现，做RACE反应实验实际操作中仍存在不少困难。因此，对RACE反应条件进行反复摸索是十分必要的。这是因为: 1. 在5'-RACE包含了有3个连续的酶反应步骤(反转录、同聚物加尾和PCR扩增)，每一步都可能导致失败; 2. 扩增DNA末端的特异性完全依赖锚定引物及扩增DNA模板样品的不均一性，因而特异性一般很低，常呈现不清晰的成片条带或截短的产物背景。因此，使用RACE技术扩增得到的特异末端片段，所获得的重组克隆最好能够全部测序，以排除RACE实验结果中扩增产物假阳性和假阴性，最终有可能获得新基因的全序列。随着RACE的不断改进和完善，优化条件下PCR扩增效率和忠实性的提高及PCR产物克隆技术的迅速发展，RACE必将在基因克隆及基因表达研究中发挥越来越大的作用。 RACE的另一种代表方法-Self-Ligation法反转录(RT)反应------Hybrid RNA的分解------单链cDNA的自身连接------PCR扩增5'未知区域------目的DNA片段的切胶回收------DNA序列测定

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