转基因抗草甘膦大豆安全性评价及对环境影响的检测

转基因抗草甘膦大豆安全性评价及对环境影响的 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 ? 36 ? 江苏农业科学 2003年第 6期 文章编号 : 1002 - 13022003 06 - 0036 - 05 转基因抗草甘膦大豆安全性评价及对环境影响的检测 1 2 3 1 1 2 陈 新 , 王长永 , 朱成松 , 严继勇 , 高 兵 , 周军英 1.江苏省农业科学院蔬菜研究所 ,江苏南京 210014 ; 2.国家环境保护总局南京环境科学研究所 , 江苏南京 210018 ; 3.复旦大学遗传研究所 ,上海 摘要 : 杂草防治是大豆种植中的重要问题。美国、 阿根廷等国家主要是通过种植抗草甘膦大豆 ,进而喷施草 甘膦来消灭杂草。转基因抗草甘膦大豆在我国目前尚没有推广种植。为了保护野生大豆资源的多样性 ,研究抗 草甘膦大豆的基因检测 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ,对环境尤其是豆类近缘作物的基因漂移愈来愈重要。本试验对从阿根廷引进的抗 草甘膦大豆在田间种植后对大豆及其近缘种漂移可能性及检测方法进行了研究 ,并在南京点检测到发生基因漂 移的野生大豆 1株。这说明大豆与野生大豆发生基因漂移是可能的 ,同时也提示引种抗草甘膦大豆应有足够的 安全控制 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 ,以免发生基因漂移而逸生为超级杂草。 关键词 : 抗草甘膦大豆 ; 野生大豆 ; 基因漂移 中图分类号 : S565110318 文献标识码 : A 大约17倍的 EPSPS ,对草甘膦的抗性提高8倍。 由 1 国内外转基因抗草甘膦大豆研究利用概况 CaMV 启动子控制下的矮牵牛的 EPSPS及转移肽 35S 在作物栽培中 ,杂草的防治一直是一个重要环 基因转化到矮牵牛的细胞中 ,获得的转化愈伤组织 节。以大豆为例 ,我国大豆田草害面积平均达 80 % 中的 EPSPS的表达量增加了 20~40 倍 ,由转化愈伤 2 左右 ,中等以上草害面积在 50 %以上。全国每年因 组织再生的转基因植株田间试验表明 ,喷洒 3. 6gP m 草害损失大豆 15 亿~20 亿 kg ,约占总产量的 10 % 的除草剂 Roundup ,对照植株 14d 后死亡 ,而过量产 生 EPSPS的转基因植株却能生长到成熟。Monsonto ~15 %。因此 ,通过化学方法来控制杂草已成为现 [1 ,2 ] 公司的 Kishore 等人从生长在添加草甘膦培养基的 代农业不可缺少的一部分 。草甘膦 Glyphosate , 大肠杆菌中分离得一个对草甘膦具有相当强抗性的 英文又名 Roundup是一种施于叶片的、 广谱性的、 EPSPS突变体 ? ? ?SM? 1 ,其对除草剂的抗性提高了 非选择性的有机磷类除草剂。其作用的机理是特异 80 000倍 ,其产生抗性的原因是其 1 个氨基酸序列 抑制植物和细菌中莽草酸羟基乙烯转移酶 EPSPS [4 ] 发生了改变 。现在编码突变 SPSPS的基因已被克 的活性 ,使其氨基酸合成受阻进而死亡。由于所有 隆 ,并被转入至大豆等植物中。目前 ,转基因抗草甘 植物都需 EPSPS来催化氨基酸的合成 ,所以施用草 膦大豆 Roundup Ready Soybean ,以下简称为 RRS 已 甘膦后 ,所有植物包括作物均被杀死。抗草甘膦大 进行商品化生产。据报道 ,截至 2001 年 6 月 ,转基 豆基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 的主要方法 ,就是采用修饰除草剂作用 因抗草甘膦大豆的使用面积已占美国大豆总种植面 的靶蛋白 ,使其对除草剂不敏感 ,即促进 EPSPS过量 [2 ] [3 ] 积的 70 %左右 ,占阿根廷大豆种植面积的 95 %以 产生或用编码点突变的靶蛋白基因 。Rogers 等 [5 ,6 ] 上 ,占巴西大豆种植面积的 30 %以上 。 发现含有 aroA 基因 编码 EPSPS 的大肠杆菌 E. 国外关于抗草甘膦大豆方面的研究 ,多集中于其 coli细胞对于草甘膦具有抗性 ,这种细胞产生了 基因的导入及对人畜食用后的安全性方面 ,而对于抗 草甘膦大豆的环境安全性方面的研究 ,在目前还是空 收稿日期 :2003 - 04 - 10 [5 ,7] 白 。国内的研究 ,目前仅局限于基因导入及分子 基金项目 :国家环境保护总局研究课题“转基因植物安全性评价及环 检测方面 ,对环境安全性方面的研究未见报道。随着 境影响检测”课题编号 :2001002 部分内容。 作者简介 :陈 新1970 - ,江苏射阳人 ,硕士 ,助理研究员 ,主要从 转基 因抗除草剂作物的使用 ,除了给人们带来巨大的 事大豆及绿豆遗传育种研究。Tel : 025 84390266 ; E - mail : 利益外 ,也不可避免地带来一些潜在的问题。 jasschenxin @sina. com。 1. 1 转基因抗除草剂作物的安全性及其检测 致谢 :本研究抗草甘膦基因引物由张宝龙提供 ,PCR检测由张旭帮助 1999年 5 月 ,美国的研究人员发表报告 ,称发 完成 ,在此一并致以谢忱 !陈 新等 :转基因抗草甘膦大豆安全性评价及 对环境影响的检测 ? 37 ? 现有些黑脉金斑蝶死于经过基因改选的玉米花粉。 因可以被其野生亲缘种 所俘获。如果某些亲缘植物 此报告一经发表 ,立即引起轩然大波。欧盟成员国 具有高繁殖力和高传播 特性的话 ,那么转移到植物 在舆论的压力下 ,已取消原定于从美国进口总值约 中的基因就会给野生亲缘种提供一些选择上的优 [8 ] 2亿美元的玉米 。尽管黑脉金斑蝶的报告 ,其它 势 ,进而导致产生新的杂草类型 ,使除草剂对已俘获 [9 ,12 ] 科学家重复试验未得到同样的结果 ,而且到目前为 了抗除草剂基因的杂草不再具备除草性能 。 止 ,据 45 个国家对 60 多种转基因作物做过的 2. 5 ASEAN研究认为 ,抗草甘膦大豆花粉的传播距离为 [10 ] 万次安全试验均证明转基因作物是安全的 ,但转基 7m左右 ;陈新等研究发现 ,抗草甘膦大豆与普通 [13 ] 因作物的安全问题仍是目前人类关注的焦点问题之 大豆杂交 ,可以正常结实 ,并可漂移至野生大豆 。 一。中国政府对转基因作物的安全性极为关注 ,并 可见 ,转基因植物大规模种植可能会给植物群落带 制定了有关法规。但由于我们目前未开展转基因抗 来极大的负面影响。 除草剂 草甘膦 方面的研究 ,也没有建立对国外进 鉴于转基因抗除草剂作物存在上述三种潜在的 口的植物是否为转基因抗除草剂商品进行检测的体 影响 ,我们以 RRS为材料 ,开展有关方面的研究 ,希 系 ,因而导致大量未经过安全检测的转基因抗除草 望为转基因抗除草剂作物在我国的科学利用提供技 剂商品如大豆、 油菜籽以普通商品的形式进入中国。 术基础。 潘良文等认为 ,进口大豆及其制品有可能会在 30 年 2 研究材料与方法 甚至更长时间以后对人类的身体健康等方面产生影 [1 ] 响 。60年前 ,DDT一度被称为“化学为美好生活 本试验大豆品种为苏豆 3 号、 徐豆 8 号 ,抗草甘 提供的美好产品” ,如今 ,93 %的美国人的身体脂肪 膦大豆为从阿根廷引进的 ARG04 ,野生大豆为江苏省 中贮藏有 DDT。所以建立一套转基因抗除草剂作物 农业科学院蔬菜研究所保存的 970124及 970123 ,绿豆 [9 ,10 ] 的检测体系已成为当务之急 。 品种为苏绿 1 号。所有分子生物学试验均在江苏省 1. 2 对农业资源多样性的影响 农业科学院农业生物遗传生理研究所实验室进行。 估计目前全世界有 30 000 余种陆生植物 ,但大 2. 1 草甘膦对豆类作物致死的喷施浓度试验 田栽培的仅 150 余种 ,其中 90 %作为食物来源。可 为找到最适合野生大豆、 绿豆、 栽培大豆的草甘 见现代农业在种植良种提高产量的同时 ,已不知不 膦致死剂量 ,于 2002 年 5 月 18 日在江苏省农业科 觉地淘汰、 丢弃了大量所谓“低劣”的原始品种、 品 学院经济作物研究所试验田里进行本试验。试验所 2 系 ,造成农业遗传多样性的极大损失。如生产上大 用草甘膦为 10 %水剂 , 设 4 个剂量 : 700mlP 667m 、 2 2 2 面积使用转基因抗除草剂作物 ,根据进化论观点 ,由 1 000mlP 667m 、 1 500mlP 667m 、 2 000mlP 667m ,3 次重 于生物共进化 ,如果转基因作物能在不良生境下 喷 复。各品种 苏豆 3 号、 野生大豆、 绿豆 种植 6 行 , 草甘膦 生长 ,那么必然会引起一些杂草很快地发展 行长 4m ,行距 35cm、 株距 4cm ,5 月 28 日苏豆 3 号、 其在不良生境的适应能力。一些杂草因不适应生境 绿豆全部出苗 ,而野生大豆于 6 月 20 日才全部出 而遭淘汰 ,因此转基因抗除草剂作物的大面积使用 苗。苏豆 3号、 绿豆于 6月 10 日 3 叶 1 心期喷施除 必然会加剧植物资源遗传的均一性和贫化。如 Ber2 草剂 ,野生大豆于 7 月 20 日喷施除草剂 ,除草剂喷 [11 ] berich等研究认为 ,抗草甘膦大豆种植后 ,已形成 于叶片表面 ,观察各豆类作物 100株的死亡情况。 一种优势大豆品种 ,限制了其它普通栽培大豆的发 2. 2 抗草甘膦基因逃逸规律的研究 展。中国南方尤其是江苏省的大豆品种资源丰富 , 抗草甘膦基因逃逸规律的研究采用同心圆 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 且复种指数高 ,季风气候明显 ,沿海地区杂草种类繁 法 图 1 ,在大豆花期配制杂交组合 ,研究 RRS与野 多 ,也是野生大豆的主要出产地之一 ,基因漂移概率 较高。所以 ,研究转基因抗除草剂作物对遗传多样 性的影响也是值得人们关注的问题之一。 1. 3 对环境生态平衡的影响 转基因作物的逃逸显然会对自然植物群落产生 严重的影响。这是因为转基因抗除草剂作物同生活 生近缘种如野生大豆、 绿豆、 赤豆等杂交的可能性。 习性相近的野生亲缘种杂交 ,作物中的抗除草剂基? 38 ? 江苏农业科学 2003年第 6期 具体方法为 :在同心圆周围按一定距离种植如图 1 栽培大豆 ,最差的为绿豆。这可能是由于野生大豆 所示的各种豆类作物各 50 行 ,注意使它们花期相 经过长期的自然选择 ,对不利条件产生了较强抗性 2 遇 ,可采用分期播种调节花期 ;花期配制杂交组合 , 的缘故。但当草甘膦 喷施浓度达 1 000mlP 667m 时 , 所有豆类作物植株全部死亡 ,因此可把 10 %草甘膦 成熟后收获各种豆类作物种子。第二年种植这些种 2 水剂 1 000mlP 667m 于各种豆类作物 3叶期喷施 作 子 ,在苗期喷施正常剂量草甘膦 ,调查植株死亡情 况 ;对被怀疑为抗草甘膦的植株取其叶片进行 PCR 为所有豆类作物植株的 致死浓度。 检测。第三年重复该试验 ,对两年的试验进行分析 表 1 不同草甘膦喷施剂量对豆类植株生长的影响 总结 ,归纳出抗草甘膦大豆的基因逃逸规律。 10 %草甘膦水剂用 同时研究 RRS花粉传播的方式、 距离及其影响 绿豆 大豆 野生大豆 2 量mlP 667m 因子。 100株中 96株死 100株中 65株死 700 全部死亡 亡 ,4株黄化 亡 ,35株黄化 2. 3 抗草甘膦大豆对豆田杂草种群结构的影响 1 000 全部死亡 全部死亡 全部死亡 在江苏省南京市和徐州市两点分别种植抗与不 1 500 全部死亡 全部死亡 全部死亡 抗草甘膦的大豆 ,其中抗草甘膦的为 4个小区 ,大豆 2 000 全部死亡 全部死亡 全部死亡 3叶期对田间杂草进行调查。然后对种植 RRS大豆 田喷施不同剂量的草甘膦 ,喷药后 30d 调查杂草群 3. 2 抗草甘膦基因的逃逸规律 落变化情况。第二年、 第三年重复该试验 ,并在第三 2002年 8~9月 ,在江苏省农业科学院蔬菜研究 年大豆收获前对田间所有杂草喷施草甘膦 ,验证杂 所试验地内 ,对抗草甘膦大豆与野生大豆 970124、 栽 草是否已俘获抗草甘膦基因。总结 3年杂草变化情 培大豆苏豆 3 号、 绿豆苏绿 1 号各配制杂交花朵 况 ,分析种植抗草甘膦大豆后豆田杂草变化情况。 1 000朵 ,苏豆 3 号杂交存活率为 18. 6 % ,野生大豆 2. 4 抗草甘膦豆类分子检测 970124存活率为 14. 23 % ,苏绿 1 号杂交成功率 [1 ] EPSPS基因的检测参考潘良文等的方法 。具 为 0。 体步骤为 : 1根据 Gene bank 发布的抗草甘膦大豆 一般来说 ,豆类作物花粉传播媒介为风和昆虫。 基因序列 ,考虑到研究人员对该序列可能的修饰 ,设 本试验不同小区试验 ,漂移植株及怀疑漂移植株均 计并合成多对 PCR 引物 ; 2 根据合成的引物对引 出现于不治虫的小区 ,而治虫小区均未发现花粉漂 进的抗草甘膦大豆材料进行 PCR 检测 ; 3 确证扩 移现象 ,这说明花粉漂移由虫媒引起的可能性较大。 增出的片断是来源于转基因大豆中的 EPSPS基因 ; 3. 3 抗草甘膦大豆对豆田杂草种群结构的影响 4 根据 CaMV 启动子序列设计 1 对引物 ,对转与 35S 南京及徐州两试点试验结果表明 ,草甘膦对多 非转基因大豆进行 PCR 检测 ; 5 根据 NOS终止子 年生宿根性杂草防治效果较差。两年试验后 ,狗牙 序列设计 1 对引物 ,对转与非转基因大豆进行 PCR 根、 芦苇等宿根性杂草在第二年杂草数量发生的平 检测 ; 6 PCR产物的测序 ,检测 GMO的含量 ; 7 对 均频率分别比第一年提高 34. 3 %和 38. 6 % ,鲜重增 转基因大豆与近缘种的杂交后代进行 PCR检测。 加125. 8 %和 253. 8 % , 而其余禾本科和双子叶杂草 2. 5 安全控制措施 数量及鲜重均比对照减少或增加不显著。所以一般 试验前 ,向国家农业部申请有关本试验的执行。 认为 ,长期种植抗草甘膦大豆会使豆田多年生及宿 试验结束后 2002 年秋收后 ,统一用大剂量草甘膦 根性杂草数量及鲜重发生较大频率的增加 ,给杂草 喷施 3点试验及周围 50m范围内的杂草及作物 ,对 防治工作增加难度。 未死的植物全部拔光并进行检测 ,以防基因漂移。 3. 4 抗草甘膦豆类分子检测结果 3. 4. 1 2001年各漂移试点种子种植后喷施草甘膦 结果与分析 3 的情况 3. 1 草甘膦对豆类作物的致死浓度 3. 4. 1. 1 南京点 从 2001 年 4 月 10 日起 ,在江苏 从表 1 可看出 ,当草甘膦的有效剂量达 70 省农业科学院经济作物研究所试验田内将 2000 年 2 2 mlP 667m , 即 10 %草甘膦 700mlP 667m 时 ,绿豆植株 南京点收获的苏豆 3号、 绿豆、 野生大豆等种子按收 全部死亡 ,大豆 96 株死亡 ,野生大豆只有 65 株死 获顺序重新进行了种植 ,其中苏豆 3 号种植 217 行 , 亡。这说明对草甘膦的抗性 ,野生大豆最强 ,其次为 绿豆种植 146 行 , 野生大豆种植 190 行。各品种行陈 新等 :转基因抗草甘膦大豆安全性评价及对环境影响的检测 ? 39 ? 数不同的主要原因是 :苏豆 3号为 2个方向 ,但每方 们已获得 CP4 - EPSPS基因的序列 ,根据该基因序 向收获的 50行种子基本上可种 1 行 ,种子量较多 ; 列设计 1对引物 P 与 P ,并已检测出抗草甘膦大豆 1 2 绿豆由于 2000 年收获种子较多 ,共有 46 行有存活 中 EPSPS基因 , P : CCTTCATGTTCGGCGGTCTCG; P : 1 2 植株 ;野生大豆则有 90行有存活植株。喷施草甘膦 CATCGAGCCGATCATGACGC。 后植株存活情况见表 2。 2002年 6~9月 ,在江苏省农业科学院农业生物 遗传生理研究所分子实验室内 ,对怀疑为基因漂移 表 2 南京点怀疑为基因漂移种子种植后喷施草甘膦的存活情况 的种子在田间种植后 ,取其 3 叶期叶片进行 DNA的 出苗数量 喷施草甘膦后存活 存活的行数 品种名称 提取、 PCR 的检测。结果共发现有 1 株野生大豆 株 苗株数 株 序列号 970124 PCR 检测为阳性 ,估计栽培大豆的花粉漂 苏豆 3号 43 572 258 北 4、 南 12等 绿 豆 30 594 0 移方式为风传或虫媒 ,野生大豆的花粉漂移方式为 野生大豆 18 317 73 东 8、 东 12等 虫媒。PCR检测图片见图 2。 3. 4. 1. 2 大丰点 于 4 月 15 日将大丰点所收获漂 移种子种植于江苏省农业科学院经济作物研究所试 验田内。大丰点由于 2000 年种植时管理措施未跟 上 ,收获种子数量少于南京点。种植后的出苗情况 见表 3。 表 3 大丰点怀疑为基因漂移种子种植后喷施草甘膦的存活情况 品种 出苗数 种植行 喷施草甘磷后 存活的行数 名称 株 数行 存活苗株数 株 序列号 苏豆 3号 37 124 200 107 北 2、 北 4、 南 3 绿 豆 24 733 121 0 野生大豆 10 354 112 12 东 1、 东 4 注 :7、 11 为抗草甘膦大豆 ,10 为抗草甘膦野生大豆 ,1、 2、 3、 6 为 怀疑含漂移基因的大豆 ,4、 5分别为赤豆、 绿豆 ,8、 9 为怀疑含漂移 基 3. 4. 1. 3 徐州点 徐州点的大豆及其它豆类作物 因的野生大豆。 种子于 2002 年 8 月 10 日播种 ,于 9 月 7 日喷施 2 10 %草甘膦水剂 1 000mlP 667m ,喷施后 10d调查 ,结 从图 2可看出 ,7、 11 都有阳性带 ,基本肯定为 果见表 4。 抗草甘膦大豆或其漂移株。对 PCR 阳性野生大豆 再进行田间检测 ,喷施正常剂量 4倍的草甘膦水剂 , 表 4 徐州点怀疑为基因漂移种子种植后喷施草甘膦的存活情况 野生大豆生长正常。对怀疑为含漂移基因的大豆及 品种 出苗数 种植行 喷施草甘膦后 存活的行数 野生大豆的植株种子再进行种植后喷施试验及 PCR 名称 株 数行 存活苗株数 株 序列号 检测 ,除 8号野生大豆为阳性外 ,其余植株种子种植 徐豆 8号 23 156 214 12 北 2、 北 3 绿 豆 24 712 158 0 后叶片检测均不呈阳性。其中 7、 11 均来自相同一 野生大豆 14 697 109 8 西 1、 东 2 株野生大豆。 从表 2、 表 3、 表 4 可看出 ,喷施草甘膦后 ,绿豆 4 结论 无 1株成活 ,大豆和野生大豆喷施后都有存活植株 , 本研究认为 ,国外抗草甘膦大豆对我国栽培大 最远漂移距离为 6m ,漂移的主要媒介应为昆虫。因 豆、 野生大豆的花粉漂移是有可能的 ,这就要求我们 为从杂交的结果来看 ,栽培大豆与野生大豆的杂交 在种植抗草甘膦大豆时要慎之又慎。中国作为野生 成功率只有 1 % ,本身就很低 ,野生大豆花粉风媒传 大豆的起源国 ,丰富的野生大豆资源是我们祖先遗 播的可能性很小。 留下来的宝贵财富 ,如一旦发生基因漂移 ,野生大豆 3. 4. 2 对怀疑为基因漂移的种子进行抗草甘膦基 将会变成超级杂草 ,这不但是对我国野生大豆资源 因检测 首先进行 PCR 引物的合成。据报道 ,抗草 的重大破坏 ,也将成为严重的社会问题。所以本试 甘膦大豆中转入的 EPSPS基因来源于 CP4株系。我