琼脂糖凝胶电泳

DNA琼脂糖凝胶电泳 一、 基本原理 当把一个带净电荷(q)的颗粒放入电场，便有一个电场力(F)作用于其上。F的大小取决于颗粒静电荷量及其所处的电场强度(E)，它们之间的关系可以表示成：F=E×q。 由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。此颗粒在泳动的过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f*v)阻挡。当这两种力相等时，颗粒则以速度(v)向前泳动：v=F/f,其中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的粘度，即f=6πγη, γ为颗粒半径，η为介质粘度。该公式指球形颗粒所受的阻力。代入F＝E×q得到: v=E×q/6πγη.从这个公式可以看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质粘度成反比。 带电颗粒在电场中泳动的速度常用泳动度(m)或者迁移率以下列公式表示： m＝μ/E=d*l/V*t d为带电颗粒泳动的距离(cm)，l为支持物的有效长度(cm)，t为通电时间(s)，V为加在支持物两端的电压。 在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的泳动度。它是胶体颗粒的一个物理常数，可用其鉴定蛋白质、核酸等物质的纯度，还可以用其来研究蛋白质、核酸等物质的一些理化性质。影响泳动度的因子有颗粒的性质、电场强度、溶液的性质等。 二、 琼脂糖凝胶电泳 通常情况下，核酸类物质的分离、鉴定是采用琼脂糖凝胶(做支持物)电泳法进行的。用琼脂糖分离线性DNA时，其迁移率与该物质分子质量的关系密切，而与结构和碱基组成无关。这也是采用凝胶电泳法测定核酸分子质量的依据所在。此方法除了可以分离线性DNA外，还可以分离、分析细菌质粒的闭环DNA和开环DNA，以及分子质量不等的RNA片段。一般实验室采用的琼脂糖凝胶的浓度为0.3%——2%。不同的凝胶浓度，可以分离不同长度的DNA片段。具体见表格： 琼脂糖凝胶 /% m/V 分离线性DNA片段的范围 /kb 0.3 50---60 0.6 1----20 0.7 0.8---10 0.9 0.5---7.0 1.2 0.4----6.0 1.5 0.3---3.0 2.0 0.1---2.0     琼脂糖凝胶电泳常用的缓冲液：   缓冲液 pH 1.50mmol/L Tris-NaH2PO4 -1--5mmol/L EDTA 7.5---8.0 2.50mmol/L NaH2PO4- Na2HPO4-1--5mmol/L EDTA 7.5---8.0 3.50mmol/L Tris-乙酸-1--5mmol/L EDTA 7.5---8.0 4.50mmol/L 乙酸钠-乙酸-1--5mmol/L EDTA 7.5---8.0 5.89mmol/L Tris-H3BO3-1--5mmol/L EDTA 8.3       琼脂糖凝胶电泳常用的样品缓冲液(示踪染料)：0.25%溴酚蓝-0.25%二甲苯青FF-30%甘油水溶液，并且这两种指示剂在琼脂糖凝胶中的迁移率不同，可以指示一定片段长度的DNA迁移率(具体见下表)。 琼脂糖凝胶浓度 溴酚蓝 二甲苯青 0.6% 1kb / 1.0% 0.6kb 2kb 1.4% 0.2kb 1.6kb 2.0% 0.15kb /       核酸分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 (Marker)：DNA电泳一定要用DNA Marker或者是已知大小的正对照DNA来估计片段的大小。应该选择在目标片段大小附近Ladder 较密的Marker，这样对于目标片段大小的估计才比较准确。 核酸电泳染色剂：核酸电泳以后，需要经过染色才能显现带型，最常用的染色剂是溴化乙锭(EB)，其次是银染法。 1、 溴化乙锭(ethidium bromide): 一种荧光染料，可以嵌入核酸的双链碱基对之间，在紫外光线的激发下，发出红色荧光。 2、 银染法：染色液中的银离子可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使银离子还原成银颗粒，可以将核酸带染成黑色。灵敏度比EB高，但是DNA不易回收。 琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下： 1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存. 琼脂糖凝胶电泳 一,实验原理 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA 片段的常用技术.把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中,并置于静电场上.由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基,因此在电场中向正极移动.在一定的电场强度下,DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应.具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样,因而可依据DNA分子的大小来使其分离.凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的DNA, 也可以分离相对分子质量相同,而构型不同的DNA分子.在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测.相对分子质量标准参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准.在凝胶中加入少量溴化乙锭(ethidium bromide, EB),其分子可插入DNA的碱基之间,形成一种络合物,在254～365nm波长紫外光照射下,呈桔红色荧光,因此也可对分离的DNA进行检测. 一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA片段.本实验介绍琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法. 琼脂糖凝胶浓度（%） 线状DNA分子分离范围（kb） 0.3 5--60 0.6 1--20 0.9 0.5--7 1.2 0.4--6 1.5 0.2--3 2.0 0.1--2 琼脂糖凝胶电泳是用于分离纯化和鉴定核酸的方法，根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖。低熔点琼脂糖的熔点为62--65,溶解后在37下维持液体状态约数小时,主要用于DNA片断的回收、质粒与外源性DNA的快速连接等。 DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速度与琼脂糖浓度、DNA分子量及其构象、电泳缓冲液、电场强度等因素有关，一般说来，DNA片断越大或者琼脂糖浓度越大，其迁移速率越大；而电场强度越高，其迁移速率越大。不同浓度琼脂糖凝胶DNA分离范围见上图表。 二,仪器及试剂 1.仪器及耗材: 水平电泳槽,电泳仪,凝胶成像分析系统,微波炉,微量移液器,透明胶带,点样或parafilm,100 ml或250 ml锥形瓶,量筒,吸头等. 2.试剂及配制: 50×TAE缓冲液的配制:2 mol/L Tris-乙酸,0.05 mol/L EDTA(pH 8.0) 配制1000 ml Tris 242 g 冰乙酸 57.1 ml 0.5 mol/L EDTA 100 ml 加入600 ml去离子水后搅拌溶解,将溶液定容至1 L后.高温高压灭菌,室温保存. 1×TAE缓冲液的配制: 称量20 ml的50×TAE缓冲液,再加入980 ml的去离子水. 溴化乙啶贮存液:10 mg/ml 溴化乙啶 配制:100 ml 称取1 g溴化乙啶,置于100 ml烧杯中,加入80 ml去离子水后搅拌溶解.将溶液定容至100 ml后,转移到棕色瓶中.室温保存. 6×上样缓冲液:0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油. 配制:10 ml 溴酚蓝 25 mg 二甲苯青FF 25 mg 甘油 3 ml 用6×TAE缓冲液定溶至10 ml,分装成1 ml/管.-20℃保存. 其它试剂:DNA样品,DNA Ladder ,琼脂糖, 三,操作步骤 1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液. 2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加 1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止. 3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序). 4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳. (5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min. (6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存. 四,常见问题及注意事项 1.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶. 2.琼脂糖凝胶易于破碎,操作时要轻缓. 3.电泳时应注意电源线路,预防触电. 4.溴化乙淀具有致癌作用,配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套.并在专门的实验室内使用. 5.紫外线对人体有损伤作用,开灯时间不宜太长,注意防护. 6.DNA带形状模糊:DNA加样过多;电压太高;凝胶中有气泡. 7.质粒DNA的存在形式有3种,①共价闭环DNA(cccDNA),常以超螺旋形式存在;②开环DNA(ocDNA),此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂,因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子;③线状DNA,因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带,它们的泳动速度为:cccDNA > 线状DNA > ocDNA. 添加来自TIANGEN的资料: 1,琼脂糖:不同厂家＼不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同,影响DNA的迁移及其荧光背景的强度,应有选择的使用. 2,凝胶的制备:凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致,溶化的凝胶应该及时倒入板中,避免倒入之前凝固结块,倒入板中的凝胶应该避免出现气泡,以免影响电泳结果. 3,电泳缓冲液:为保持电泳所需的离子强度和PH,应经常更新电泳缓冲液. 4,样品加入量:一般情况下,0.5CM宽的梳子可加0.5微克的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片断的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清楚;反之,则应该适当减少加样量,但是上样量过多会造成加样孔超载,从而导致拖尾或扩散,对于较大的DNA此现象更明显. 5,DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品中应该使用同样的缓冲条件以消除这种影响. 6,DNA迁移率取决于琼脂糖的浓度,迁移分子的形状及其大小.采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度.小片断DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,以提高分辨率. 什么是琼脂糖电泳的？其基本知识及操作方法是什么？不同形态的DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的大小如何分布或者改变？ 什么是琼脂糖电泳的？其基本知识及操作方法是什么？不同形态的DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的大小如何分布或者改变？ 以琼脂糖凝胶作为支持介质的电泳称为琼脂糖凝胶电泳。 二、琼脂糖凝胶电泳的准备和操作方法 1 、制备琼脂糖凝胶时注意避免产生气泡 凝胶电泳分为垂直型和水平型，一般垂直型分离效果好于水平型。但水平型可制备低浓度琼脂糖，制胶和加样比较方便，且电泳槽制作简单、价格低廉。 用缓冲液配制所需浓度的琼脂糖凝胶，水浴或微波炉中加热使琼脂糖完全融化，将溶液冷至 55 ℃ ，用少量琼脂糖凝胶将玻璃板或有机玻璃板封边，放置样品梳（梳齿下端离玻璃板 0.5 -1.0mm ）。接着将融化的琼脂糖凝胶溶液不间断地倒在玻璃板上或有机玻璃板模子中（厚度依样品浓度而定，须注意避免气泡混入） , 室温下自然凝固。待完全凝固后小心取出加样器，在电泳槽中加入适量电泳缓冲液，使胶板浸没在电泳缓冲液下约 1mm 处。 2 、样品制备与加样 所加样品应有适当浓度与较小体积，用微量注射器缓慢加入样品，点样时电源必须处于关闭状态。为了指示电泳的距离，避免样品在电泳槽缓冲液中飘浮，常在制备好的样品中加入含有蔗糖或甘油以及指示剂（溴酚蓝、二甲苯青等）的上样缓冲液。另外，样品中含盐量不能太高，否则电泳中会出现区带消失、前沿不齐等现象。样品中 DNA 含量以每条区带的 DNA 不少于 0.1 μ g 为宜， DNA 浓度过高会使电泳区带变宽，泳动距离异常。 样品的用量由加样孔的体积决定，通常为 10-50 μ g 。 3 、电泳 电泳温度视需要而定。对于大分子的分离，宜低温，电压应低（一般不超过 5V/cm ）。普通电泳可在室温进行，电泳的电压为 5-15V/cm 。 4 、染色－以 DNA 电泳为例 常用荧光染料溴化乙锭（ EB ）进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的 DNA 条带。 EB 能插入 DNA 分子中碱基对之间，使 EB 与 DNA 结合（超螺旋 DNA 与 EB 结合能力小于双链闭环，而双链闭环的 DNA 与 EB 结合能力小于线状双链 DNA ）。将以染色的凝胶浸泡在 1mmol/lMgSO 4 溶液中 1 小时，可以降低未结合的 EB 所引起的背景荧光，以提高检测的灵敏度。 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要是依据它们的相对分子量质量及分子构型，同时与凝胶的浓度也有密切关系。 1、核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 （1）DNA分子的大小 在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 （2）琼脂脂糖的浓度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 表 琼脂糖浓度与DNA分离范围 琼脂糖浓度 /%    0.3    0.6    0.7    0.9    1.2    1.5    2.0 线状DNA大小/kb  60-5  20-1  10-0.8  7-0.5  6-0.4  4-0.2  3-0.1 2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：供价闭环DNA（covalently closed circular，cccDNA）>直线DNA>开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm=0），而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前进（Rm>0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流强度、缓冲液离子强度等的影响。 生化及分子生物学试剂 >> λDNA/ HindⅢ Marker（单切Marker) λDNA/ HindⅢ Marker*概述：λDNA/ HindⅢ Marker是由λDNA经Hind Ⅲ完全酶切并经灭活处理制成，浓度为  0.5μg/μL。已含有1xLoading Buffer,可以直接电泳。由8条片断组成：125bp、564bp、2027bp、2322bp、4361bp、6557bp、9416bp和23130bp。上样量0.5～1μg。 *储存：－20℃保存一年以上，4℃保存2～3个 Glycerol 5％ 溴酚兰 0.02％ 二甲苯腈蓝 0.02%   1×Loading Buffer说明： 1×loading Buffer中含有溴酚兰（Bromophenol Blue） 、二甲苯腈蓝FF （Xylene Cyanol FF）两种色素，用以判断DNA片断的电泳情况。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中迁移速率是二甲苯腈蓝FF的2.2倍，这一特性与琼脂糖浓度无关。在0.5XTBE琼脂糖凝胶电泳中溴酚蓝迁移速率约与长300bp的线状双链DNA相同，而二甲苯腈蓝FF约与长4000bp的DNA相同。上述关系在浓度范围 0.5％～1.4％的琼脂糖凝胶中基本不受浓度变化的影响。 *注意事项 1．   电泳时电压不应超过20V/cm，电压过高，会导致电泳缓冲液发热从而影响DNA电泳效果。另外，DNA分子泳动过快，小片段DNA分子可能会跑出凝胶，而导致DNA片段丢失。 2．   对于λDNA cos位点，该位点退火之后，λDNA/ HindⅢ Marker的4361bp片段以及λDNA/ HindⅢ＋EcoR Ⅰ Marker的3530bp片段可能全部或部分消失，为避免由于片段退火而产生DNA代带型的变化，应在点样前放在65℃水浴中加热10min，然后在冰浴中冷却5min。 3．   一般情况下，0.5cm宽的梳子加样量为0.5μg的DNA量，即本产品点样量