紫外线诱变高产黄原胶菌株

紫外线诱变高产黄原胶菌株 摘要:文章探索黄单胞菌的紫外线诱变和紫外线-亚硝酸钠复合诱变条件;经紫外线照射时间为40S，照射距离为40cm的低照射剂量诱变，再进行亚硝酸钠复合诱变，获得一株正变菌株46-7菌株，该46-7菌株摇瓶发酵的黄原胶产量达到2.33g/L，比出发菌株增产5.9%。 关键词:黄原胶;黄单胞菌;诱变;紫外线;亚硝酸钠 中图分类号:TS261.15 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-11-0043-3 黄原胶是野油菜黄单孢菌以碳水化合物为主要原料，经好氧发酵生物工程技术发酵生产的一种用途广泛的细菌胞外多糖，在化工、食品、医药、纺织、采油和化妆品等领域中广泛应用，是目前世界上生产规模最大且用途极为广泛的微生物多糖[1]。紫外线是一种使用最早、沿用最久且应用效果明显的微生物诱变剂，其诱变频率高，迄今仍然是微生物育种中最常用和有效的诱变剂之一。本论文旨在通过对黄单胞菌的紫外线诱变及紫外线-亚硝酸钠复合诱变，筛选获得黄原胶产量较高和质量较好的菌株，为产黄原胶菌株的进一步研究和应用提供参考。 1 实验材料及方法 1.1 菌株 本实验室保存的Xcc8004野油菜黄单胞菌菌株。本实验室从各地采集的野油菜黄单胞菌野生菌株cam26-cam47。 1.2 培养基 ，琼脂粉1.5g， 1.2.1 NYGA培养基(100ML) 酵母浸膏0.3g，牛肉浸膏0.5g，蔗糖2gpH7.0 1.2.2 NYGB培养基(100ML) 酵母浸膏0.3g，牛肉浸膏0.5g，蔗糖2g，pH7.0 1.3 出发菌株的筛选 将菌株活化，接入装有10ml灭菌NYGB培养基的指形瓶中，28?，200rpm摇床培养16小时。取菌液稀释到10-5、10-6、10-7三个浓度，用移液枪分别吸取100微升，均匀涂布在NYGA培养基平板上，每个浓度涂两个平板。28?恒温培养箱中培养5天，观察平板上单菌落的形态，用游标卡尺测量单菌落的直径，从每个平板中选出最大的1个单菌落，测量其直径、记录、保藏。对来自同一个菌株的菌落所得各新菌株，在同一平板上点板，培养5天，观察、测量单菌落的直径，从中选出菌落直径最大的菌株，作为该野生菌株的标准菌株。将不同野生菌株的标准菌株在同一平板上点板，培养5天，观察平板上单菌落的形态、测量单菌落的直径，进行菌株间对比，确定诱变出发菌株。 1.4 不同强度的紫外线诱变 分别吸取培养16小时的菌液2ml置于三个无菌平皿中，开盖，不同距离，15W紫外灯下照射40S。诱变后的菌液10-5、10-6、10-7稀释涂平板，各涂两个平板，28?恒温培养3天，观察平板上单菌落的形态、计菌落数，从每个平板中选出较大的若干个单菌落，测量其直径、记录、编号保藏。 1.5 不同时间的紫外线诱变 分别吸取培养16小时的菌液2ml置于三个无菌平皿中，开盖，用15W的紫外灯在40cm距离下分别照射不同时间。诱变后处理同上。 1.6 紫外线-亚硝酸钠复合诱变 取培养16小时的2ml菌液放入灭菌指形瓶中，用醋酸溶液调节pH到4.5，加入等体积的0.07mol/L的亚硝酸钠溶液，在28?水浴中处理120S，调节pH到7.0，再置于无菌平皿中、开盖，在15W紫外灯下40cm距离处照射40S。诱变后处理同上。 诱变所得菌株的初筛:从每一个诱变处理的6个平板中，观察各个平板中菌落形状较大、菌落比较饱满光滑的菌落，选择较大的几个菌落测量其直径大小，挑选出菌落直径最大的1个菌株，点平板;将6个平板中各平板的直径最大菌落的菌株都点接在同一个NYGA平板上，28?培养5天，从该平板中选出直径最大菌落的1个菌株，培养、编号保存。 诱变所得菌株的复筛:将初筛得到的菌株分批进行复筛，一批取7-8个菌株点接在同一个NYGA平板上，28?培养5天，观察、测量各菌落直径，进行比较。选取直径最大的2个菌落的菌株，培养、保存。对各批复筛所得菌株按上述方法进行二次复筛、三次复筛、多次复筛;直至选出几株直径较大菌落的菌株。 1.7 侯选菌株的发酵培养 1.7.1 种子液摇瓶培养 从所选菌落中挑取少量菌苔于含10mlNYGB培养基的指形瓶中，28?，200rpm摇床培养16h。 1.7.2 摇瓶发酵 取经过夜培养的菌液2.5ml接入含100mlNYGB培养基的三角瓶中，28?，180rpm摇床培养4天。 1.8 黄原胶的提取 用移液枪吸取20ml发酵液置于50ml离心管中，在4?，10000rpm条件下离心30min。将离心后的上清液倒入烧杯中，加入3-7倍体积的95%乙醇，用玻璃棒搅拌，在搅拌过程中上清液会产生絮状凝聚物，带絮状物聚集完后取出放在干净的平皿上。剩余的液体通过滤纸过滤，将上清液中剩余的沉淀过滤出来，把滤纸上的絮状物转移到平皿上。用乙醇多次洗涤絮状物，然后把装有絮状物的平皿放入40?烘箱中烘干，当平皿的重量不变时，把干燥的黄原胶粉末刮下，称量其重量。 2实验结果与分析 2.1 出发菌株的筛选 出发菌株的选择是决定诱变效果的重要环节,长期育种的经验证明,在诱变处理前下功夫选择一株好的出发菌株是很重要的[2]。本实验将22株野生黄单胞菌菌株分别进行平板涂布筛选，测量长出的单菌落直径，每个平板上选出直径最大的菌落点板培养，五天后观察生长情况，经多批、多次反复点板培养对比，将各菌株最大单菌落的直径列于表1。 表1 黄单胞菌各菌株最大单菌落的直径(mm) 菌株 最大直径 菌株 最大直径 菌株 最大直径 菌株 最大直径 cam26 2.76 cam32 9.3 cam38 7.86 cam44 13.3 cam27 5.54 cam33 10.46 cam39 8.54 cam45 14.6 cam28 13.94 cam34 6.72 cam40 12.86 cam46 14.16 cam29 9.1 cam35 6.2 cam41 8.52 cam47 10.6 cam30 11.48 cam36 5.56 cam42 13.24 cam31 4.08 cam37 9.22 cam43 10.4 诱变的出发菌株的选择，主要考虑生长速度快(意味着发酵生产成本低)，菌胶团大(意味着黄原胶产量高)两方面。从表1可见，cam45菌株菌落直径最大，cam46菌株菌落直径第二大;在观察菌落形态时发现，cam46菌株菌落的菌胶团比cam45菌株菌落的菌胶团大一些;考虑到cam46菌株与cam45菌株菌落直径相差不大，而cam46菌株的菌胶团较大;故选择cam46号菌株作为诱变育种的出发菌株。 2.2 不同照射时间下黄单胞菌的紫外线诱变 取cam46菌株作为出发菌株，进行诱变育种。本实验采用紫外线照射的方法进行诱变育种，由于紫外线的穿透能力不强，不能穿透培养皿的皿盖，故诱变时须打开培养皿在紫外灯下照射，照射距离为40cm，各试验组分别照射40S，80S，120S，诱变后结果见表2。根 据前人的研究经验，紫外线照射的致死率在70%左右时,产生正突变的几率较高,有利于进一步筛选[3]，故选择致死率为69.6%的照射时间80S为最佳紫外线照射时间。 表2 不同照射时间的致死率 处理时间(S) 存活菌落数(个/ml) 存活率(%) 致死率(%) 40 5.33×108 38.6 61.4 80 4.20×108 30.4 69.6 120 2.47×108 17.9 82.1 对照组 1.38×109 100 0 2.3 不同照射强度下黄单胞菌的紫外线诱变 紫外线照射强度与照射距离的平方成正比关系，本实验直接用不同的照射距离来代表不同的照射强度。取cam46菌株培养后，打开培养皿在紫外灯下分别照射80S，设置的照射距离为20cm、30cm、40cm，诱变后结果见表3。 表3 不同照射距离的致死率 距离(cm) 存活菌落数(个/ml) 存活率(%) 致死率(%) 20 2.39×108 20.3 79.7 30 3.41×108 28.9 71.1 40 3.94×108 33.4 66.6 对照组 1.18×109 100 0 2.4 黄单胞菌的紫外线-亚硝酸钠复合诱变育种 亚硝酸钠诱变作用PH为4.5，终止反应时PH为6.8 [4]，进行紫外线-亚硝酸钠复合诱变复合诱变时，先对菌种进行亚硝酸钠诱变，亚硝酸钠处理时间120S，然后将PH调至7.0终止反应，再取2ml亚硝酸钠处理后菌液进行紫外诱变，紫外线照射时间40S，距离40cm，复合诱变后结果见4。 表4 紫外线-亚硝酸钠复合诱变致死率 组别 存活菌落数(个/ml) 存活率(%) 致死率(%) 试验组 1.77×108 22.1 77.9 对照组 8.01×108 100 0 2.5 诱变菌株的对比 取各批次诱变所得菌落直径最大的7株菌株重新编号为46-1、46-2、46-3、46-4、46-5、46-6、46-7(平板上简写为:1、2、3、4、5、6、7)，点在同一个平板上，以便于菌株间的对比，培养三天后生长情况如图1。 图1 诱变所得菌株初次点板对比 根据图1的菌株生长情况，淘汰生长速度慢、菌落明显偏小的46-5菌株，取其他菌株同时进行摇瓶发酵，测定其黄原胶产量。 2.6 黄原胶发酵与产率的计算 取46-1、46-2、46-3、46-4、46-6、46-7菌株和Xcc8004标准菌株及46号出发菌株一起发酵，经16小时液体种子培养后，在每100mlNYGB培养基中接种2.5ml种子培养基，28?，180rpm条件下在摇床中培养四天。 取20ml发酵液置于离心管中，10000rpm离心30min，除去沉淀后，上清液加入3-7倍体积的95%乙醇，用玻璃棒搅拌，等絮状沉淀不再增多后，把玻璃棒上的沉淀取下放在干净的培养皿中，发酵液通过滤纸过滤，将沉淀出来的黄原胶用乙醇洗涤后放入烘箱中烘干至恒重，称量其干重。Xcc8004及诱变育种所得菌株产胶率见表5。 表5 各菌株黄原胶产量 菌株 产胶量(g/L) 菌株 产胶量(g/L) Xcc8004 0.4 46-3 2.01 Cam46 2.2 46-4 2.05 46-1 1.5 46-6 1 46-2 1.03 46-7 2.33 从上表中可以看出，黄原胶产量最高的46-7菌株产量为2.33g/L，比出发菌株黄原胶产量增加了0.13g/L，增产幅度为5.9%;与本室保存的Xcc8004标准菌株相比，46-7菌株的黄原胶产量提高了4.8倍。 3 小结和讨论 本文以本实验室从野外分离出的一批黄单胞菌菌株为原始菌株，采用多次平板涂布方法分离出生长较快的菌株，再经过多次复筛，最终选择生长较快且透明圈较大的cam46号菌株作为诱变的出发菌株。论文采用紫外线诱变和紫外线-亚硝酸钠复合诱变，通过不同照射时间、不同照射距离来改变紫外线照射的强度和剂量，并用紫外线和亚硝酸钠同时作用的方法提高黄单胞菌的突变率。 黄单胞菌对紫外线较敏感，当紫外线照射强度较大和照射时间较长时，出现的负突变率较高;高剂量的紫外线会严重损伤黄单胞菌，使黄单胞菌出现明显的负突变现象，许多黄单胞菌的黄原胶产量大幅度下降，本实验中黄原胶产量大幅度下降的三株黄单胞菌菌株(占测定总菌株数的50%)均是出自紫外线照射强度较大和照射时间较长的试验组;其中下降最多且黄原胶产量仅为出发菌株45%的46-6菌株的就出于照射时间最长的120S试验组。因此，紫外线诱变的照射剂量、照射强度还是较低一些好，照射时间还是较短一些好。本实验在紫外线照射时间为40S，照射距离40cm的低照射剂量情况下获得了一株正变菌株46-7菌株。 从最后发酵结果来看，紫外线复合诱变的效果比单纯紫外线诱变的效果好，唯一获得的一株正变菌株46-7菌株是通过紫外线-亚硝酸钠复合诱变得到的，其黄原胶产量达到2.33g/L，比出发菌株Cam46菌株黄原胶产量增产5.9%。实验证明，可以将紫外线诱变作为黄单胞菌改造的重要手段，采用紫外线-亚硝酸钠复合诱变的效果比紫外线单因素诱变好。 参考文献 [1] 陈超,王君高,周喜燕,等.黄原胶发酵条件优化研究[J].中国酿造,2009,(4):121-123. [2] 张超,等.大剂量紫外诱变选育ε-聚赖氨酸高产菌[J].生物加工过程,2007,5(3):64-68. [3] 郭继平,马莺.紫外诱变选育米曲霉高产蛋白酶菌株[J].微生物学通报,2007,34(2):246-250. [4] 梁亮,等.紫外线与亚硝酸钠复合诱变选育L-组氨酸产生菌[J].微生物学,2008，28(2):27-29. 作者简介:白先放，广西大学生命科学与技术学院副教授。 通讯作者:谢庆武，广西大学生命科学与技术学院研究生导师。