CSP3_CSP7和GLPp16_CSP17探针检测尿脱落细胞的用研究(病理学与

CSP3_CSP7和GLPp16_CSP17探针检测尿脱落细胞的用研究(病理学与 ,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,, , ,,,,, , , ,,,,, ,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ,,,,,;,,,,, 课题来源:卫生部课题(,,,,,,,(,(,,,) 专 业 名 称 病理学与病理生理学 学位申请人 许洁 指 导 教 师 赵彤教授 答辩委员会主席 林汉良教授 答辩委员会成员 丁彦青教授 张雅洁教授 钟雪云教授 申 洪教授 论文评阅人 张雅洁教授 朱梅刚教授 ,,, ,年,月,,日 广州 硕士学位论文 ,一四嘲 ， ,,,,,,,,,和,,,,,,,,,,,,探针检测尿 脱落细胞的应用研究 在职硕士生姓名:许洁 指导教师:赵彤教授 摘 要目 的 荧光原位杂交(,,,,,,,;,,;, ，, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,，,，,,)是非同位素探针标记，监测细胞,,,畸变的一种方法。其原理是将荧光素标记的小,,,片段作为探针与染色体或染色质上与之同源的靶序列进行杂交，杂交之后靶序列也就标记上荧光物质，在荧光显微镜下可以被激发出荧光，根据荧光信号鉴定每个细胞中靶序列的拷贝数，确定探针的位置，继而对染色体数目和结构是否异常进行 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。膀胱肿瘤是泌尿生殖系统最常见的肿瘤，全世界每年约新增病例,,万例。在我国男性泌尿生殖系统肿瘤中，膀胱肿瘤的发病率和死亡率均占首位，其死亡率是男性十大恶性肿瘤的第九位。膀胱肿瘤的分期和分级是影响膀胱肿瘤患者术后复发的危险因素，分期分级越高，复发的概率越高。因此，膀胱肿瘤患者早发现、早诊断、早治疗对于降低膀胱肿瘤患者术后复发有着重要的关系。传统上，膀胱镜检查、病变部位活检和尿脱落细胞学检查一直是诊断膀胱肿瘤的金 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ，但膀胱镜检查属于创伤性检查，患者痛苦且有导致尿路感染的可能性，难以发现早期病变;尿脱落细胞学的检测虽然特异性高，但敏感性低，尤其是对低分级肿瘤的敏感性更低，而且该方法较为主观且假阴性率较高，影响临床的诊断。令人兴奋的是，国外采用,，,,检测膀胱肿瘤患者尿脱落细胞染色体的改变，不但用于膀胱肿瘤的诊断，而且还发现,号、,号、,,号染色体非整倍性改变及,号染色体,,,位点的缺失与膀胱肿瘤的发生、发展及 中文摘要预后有密切关系。新近国内有些大医院也陆续开展了该项检测。为此，本研究采用,，,,技术，观测了,,例疑似膀胱肿瘤患者尿液脱落细胞的染色体畸变改变，并与常规脱落细胞学检测和病理组织病理学分级进行了比较，评价,，,,对尿脱落细胞检测意义，探究,，,,检测与膀胱肿瘤进展及侵袭的关系。方法,(正常阈值的建立 采集,,例正常人尿液标本，按照,，,,检测实验方法，每组探针观察,,,个细胞，统计出现不同类型异常情况细胞数目的百分比，建立正常阈值范围，检测值大于阈值,舟,,,)，判定为阳性结果;小于阈值，判定为阴性结果。,(标本的收集和前处理 收集,,,,年,月(,,月，,,例疑似膀胱肿瘤的血尿患者的晨尿标本，其中男性,,例，平均年龄,,(,,士,,(,,(,?,)岁;女性,例，平均年龄,,(,,士,,(,,(,?,)岁。每例患者连续,,留取清晨新鲜中段尿液,,,,,，,,内送检;尿液经前处理后滴片于玻片上，,,?环境中老化玻片,, ,,,,。本实验对前处理进行了预实验，摸索出合适本实验室的最佳实验条件。,(探针的选择与判别 用,组,,,探针，一组,,,,,,,,,分别杂交于,号和,号染色体的着丝粒区域，,,,,荧光信号为绿色(,，,,)，,,,,荧光信号为橘红色(,,,,,,,,);另一组,,,,,,,,, ,,,，,,,,,,杂交于,号染色体长臂(,？,,)，荧光信 号为橘红色;,,,,,杂交于,,号染色体的着丝粒区域，荧光信号为绿色。间期细胞单个细胞核中，橘红色信号与绿色信号各显示,个为正常细胞，出现无信号为完全缺失，单信号为部分缺失，,个以上信号点为扩增，与阈值相比较，确定结果的阳阴性。选择杂交信号均匀的区域和信号清晰可辩的细胞进行信号计数。检测值大于阈值(,，,,,)，判定为阳性结果;小于阈值，判定为阴性结果;等于阈值，须增加观测样本细胞的数量，如病人,,, ,，,,检测结果中只有一个信号点的间期细胞比例大于,(,,即阈值(,,)，则判断该病人是,,,基因缺失的阳性病人; ? 硕士学位论文又如病人,,, ,，,,检测结果中只有一个信号点的间期细胞比例小于,(,,即阈值(,,)，则判断该病人是没有,,,缺失的阴性病人。以此类推。,(临床标本检测与应用 本研究检测了,,例疑似膀胱肿瘤的血尿患者尿液脱落细胞，计数,,,个细胞，分别使用,组探针进行检测。同时行常规尿脱落细胞学检查，患者留晨尿，收集后常规送细胞学病理检测，连续送检,,;患者行活检病理或术后病理检查，由两名或以上专业的病理科医生共同阅片诊断。,(统计学方法运用与处理 采用,,,,,,(,统计分析软件，计数资料使用，检验，配对计数资料使用,;,,,,,检验进行统计分析，,,,(,,，有统计学意义，比较,，,,检测技术与常规尿脱落细胞学检测的敏感性和特异性的差别，同时统计分析,，,,检测膀胱肿瘤的敏感性和特异性与肿瘤病理分期之间的关系，统计分析,号、,号、,号和,,号染色体的畸变与肿瘤的肌层浸润的相关性。结果,(建立正常阈值 正常阈值范围为,号染色体阈值(,,(,,,,”,”,,,,)、,号染色体阈值 (,,(,,,,,,,,,)、,,号染色体阈值(,,(,,,,,,,,,)、,,,基因阈值 (,,(,,,,,,,,,);异常阈值为,号染色体阈值(单体,(,,,,，三体或以上,(,,,,)、,号染色体阈值(单体,(,,,,，三体或以上,(,,,,)、,,号染色体阈值(单体,(,,,,，三体或以上,(,,,,)、,,,基因阈值(单拷贝,(,,,,，三拷贝或以上,(,,,,)(,((临床标本检测 ,,例活检组织中，术后病理诊断膀胱肿瘤,,例(术后复发,例);非肌层浸润性膀胱肿瘤(氏(,,),,例，肌层浸润性膀胱肿瘤(?,),,例;剩余,例中，未见肿瘤有,例、膀胱炎,例、尿道肉阜,例、肾结核,例。,,例疑似膀胱肿瘤血尿患者中，尿脱落细胞检测仅,例阳性，组织病理证实,例为肌层 ,,, 中文摘要浸润性膀胱肿瘤(高级别，其中,例为术后复发)，,例为非浸润性低级别膀胱肿瘤;总敏感度为,,(,,,，假阴性率为,,(,,,(,,,,,)，总特异性为,,,,。其中诊断非肌层浸润性的敏感度为,,(,,,，肌层浸润性敏感度为,,(,,,。,，,,检测总敏感度为,,(,,,，总特异度为,,(,,,，总敏感度高于尿细胞学检测 (,,(,,,)，具有统计学意义(,,,,(,,,，,,,,,(,,,),总特异度略低于尿细胞学检测 (,,,,)，差别无统计学意义;具有诊断肌层浸润敏感度(,,(,,,)高于非肌层浸润性的敏感度(,,(,,,)，二者分别高于尿细胞学检测(尿细胞学检测有肌层浸润的膀胱肿瘤敏感度为,,(,,,，非肌层浸润膀胱肿瘤敏感度为,,(,,,)，在诊断肌层浸润的膀胱肿瘤两种检测方法有统计学差异(,,,,(,,,)? 采用,号、,号、,号和,,号染色体探针对,,例疑似膀胱肿瘤的血尿患者的尿脱落细胞进行检测，结果显示,号、,号、,号和,,号染色体的畸变率分别为,,(, ,,、,,(,,,、,,(,,,和,,(,,,，,号和,,号染色体的畸变与肿瘤的浸润有相关性，畸变程度与肿瘤浸润深度呈正相关性((,,,,,,列联系数,,(,,,，,,,(,,,;,,,,,,列联系数,,(,,,，,,,(,,,),,,,(,,,，,,,(,,,;,,,,(,,,产,(,,)。,和,号染色体的畸变率在肌层浸润性肿瘤和非肌层浸润性肿瘤之间的差别均不具有统计学意义(,,,,,,(,,,，,,,,(,,,;,,,,(,,,，,,,(,,,)。,(方法学上的改进 本研究对,，,,检测尿脱落细胞染色体的方法进行了,个方面的改进:(,)取晨起初次尿液，延长尿液在膀胱的停留时间，提高脱落细胞的收集量;(,)同时，采用对细胞吸附力更好的玻璃离心管，提高了实验细胞的总量;(,),,于尿液中的肿瘤细胞比较脆弱，适当减少实验步骤有利于保护目的细胞;(,)同时，由于上皮细胞对胶原酶有耐受作用，所以胶原酶,消化成团细胞的效果并不明显，本实验证明，此步骤是可以完全省略;(,)对于肉眼血尿比较明显的标本，适当提高冰醋酸的比例有助于红细胞的裂解，使背景清晰，同时提高冰醋酸的浓度还有助于染色体的伸展，利于探针的结合，也有助于细胞的膨胀，从而减少染色体的丢失。 ，,进展和侵袭的标志物。 ,(留取清晨初次尿液标本，采用玻璃离心管离心，一定程度上解决了尿液标本细胞收集困难的问题;免去胶原酶消化步骤，减少实验步骤有利于对肿瘤细胞的保存，降低假阴性率;对于肉眼血尿明显的标本适当提高冰醋酸含量，不仅降低背景着色，同时有利于染色体的散开，利于探针与目的片段的结合。关键词荧光原位杂交膀胱肿瘤染色体畸变尿脱落细胞血尿 , ,,,,,, ,,,,:,, ,,, ，,,,,,;,,,:,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,;,,;, ,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,,，,,),, , ,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,; ,,,,,,,,,,,, ,,;,,,？,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ;,,, ,,,(,,, ,,,,;,,,, ,, ,，,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,,,,;,,, ,,,,,,, ,,,,,, ,, ,,,,, ,,,,,,,,诵,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,？,,,;, ,,;,,,, ,, ;,,,,,,,,, ,, ;,,,,,,,,,，,,,,,,, ,,,,,, ,,？,,,;, ,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,,;,,;,(,,,; ,,,,,,,;,,;, ;,, ,, ,,,,,,,,,, , ,,,,,,,;,,, ,,;,,,;,,,(,,,, ,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,, ,,？,,,;, ,,, ,,, ,,,,,,,,;,,, ,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,;;,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,;,,, ,,,,,,，,,, ,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,, ,, ;,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,;,,,, ;,, ,, ,,,,,,,,,(,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,, ;,,,,,,, ,,;,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,, ,,;,,,,,, ;,,,, ,,,,,,,,, ,,;, ,,,,(,,,, ,,, ,, 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,,,,,,,, ,, ;,,,,,,,,, , ,,, , , ,,,,,,, ,, ,, 硕士学位论文,,, ,,,,, ,,,,,,,,，,,, ,,, ,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,(,,,,,,,,(,, ,，,,,(,,,;,,,,,,,,,(,,,，,,,(,,,)(,,, ,,,,,,,,;,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,, ;,,,,,,,,, , ,,, , ,,, ,,, ,,,,,,,;,,,(,,,,(,,,，,,,(,,,;,,,,(,,,，,,,(,,,),(,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,，,, ,,,,;,,,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ;,,,, ;,,,,,,,,, ,,,,,,，, ,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,;,,,,, ,,,,(,,,,,,,,,, ;,,,, ;,,,,;,,,, ？,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,,,, ,,,,,,, ,, ,,?,, ,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,, ,,,,,,,(,,,,,,,,,，,, ,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,, ,,,,, ;,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,, ,,,,, ,,,,,, ,, ,,, ;,,,,;,, ,,,,;,,,,,,,,,,,,, ,,,;,,,,,, ,,,, ,,,,,;, ,,,,,,, ;,,,, ,,, ,, ,,,,, ;,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,,,(,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, , ;,,, ;,,,,,,,,,,, ,,,,;, ,, ,,, ,,,,,,, ,,;,,,, ,,,,,,,,,,,, ;,,,, ;,,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,;, ,,,,(,,,,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,,, ,,,, ,,;,,,,,,,,, ,,,,,,,(,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, 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果……………………………………………………………………………………………………, , ,讨 论……………………………………………………………………………………………………,, ,结 论……………………………………………………………………………………………………,,参考文献……………………………………………………………………。,,中英文缩略词 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf ……………………………………………………………,,，,,;, 录………………………………………………………………………………………。,,全文小结………………………………………………………………………,,致,射………………………………………………………………………………………((,,学位论文原创性声明…………………………………………………………。,,统计合格证明……………………………………………………………………((,, 硕士学位论文 第一章前言 膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其高发年龄为,,(,,岁，男女患病比为,:,，其中，男性占,,,以上，,,,(,,,患者有无痛性肉眼血尿，常表现为间歇性，容易给患者造成“好转”或“治愈”的假象。,,,以上为尿路上皮癌 (,,,,,,,,,,,,, ;,,, ;,,;,,,,,，,,,)，其中,,,为表浅性，,,,为浸润性，早期诊断较困难。,,的患者确诊时已经发生转移，膀胱肿瘤诊治后，,,,以上复发，,,,的复发肿瘤恶性程度较之前增加【,硼，因此，如何对膀胱肿瘤做出早期诊断和有效预防膀胱肿瘤复发已经成为目前迫切解决的主要问题。 目前，膀胱肿瘤临床诊断普遍使用膀胱镜检查和尿细胞形态学两种手段，细胞形态学检测虽说特异性较高，但对于膀胱肿瘤诊断的敏感性偏低，用于诊断膀胱肿瘤和监测复发膀胱肿瘤效果并不理想;膀胱镜则为有创检测，病人痛苦，难以接受，且对于肉眼见不到的肿瘤的诊断也存在一定的困难。除此之外，从尿液中检测与膀胱肿瘤发生相关的抗原，如尿核基质蛋白,,(,,;,,,, ,,,,,,,,,,,,, ,,，,,,,,)、膀胱肿瘤抗原(,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,，,,,)、纤维素和纤维蛋白降解产物(,,,,,,)、组织多肽抗原(,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,，,,,)等，虽然敏感性高于细胞形态学观察，但是这些方法容易受到血尿、尿路感染、膀胱灌注治疗的影响而出现假阳性结果，特异性较尿细胞形态学检测低，不能作为可靠的诊断指标【,捌。 膀胱肿瘤的发生与发展是一个多阶段多、步骤的过程，在肿瘤的每一个发展阶段都有不同的分子遗传学的改变，这些基因型异常的长期积累最终导致恶性表型的结果。膀胱肿瘤的细胞遗传学研究表明，在膀胱肿瘤中易发生随机性的染色体改变，包括染色体数目和结构的畸变【,堋。近,,年，随着对膀胱癌遗传学改变的深入研究，人们发现,号染色体部分(如,,,位点)或全部丢失是最常见遗传学改变，且这一改变与膀胱癌 的早期发生密切相关。此外，膀胱癌的发展与染色体不稳定性也紧密相连，特别是与,号、,号及,,号染色体的非整倍 第一章前言性密切相关。目前的临床研究显示，对尿液或膀胱冲洗液中细胞进行以上遗传 学改变的检测对膀胱癌的早期诊断及病程监测有很大的价值，其灵敏度高于细胞形态学检测，特异性则与细胞形态学检测相当。检测以上遗传学改变标准方法为,，,,技术。故在欧美等国家，由于尿液检测的非创伤性及非痛苦性，,，,,技术已成为排除血尿病人患膀胱癌的最有效的方法之一。近年来，有报道尿脱落细胞荧光原位杂交技术(,,,,,,,;,,;, ，, ,,,, ,,,,,,,,,,,,,，,，,,)代替膀胱镜以及尿细胞学检查，具有无创性，敏感性和特异性高的优点，是诊断及监测膀胱肿瘤复发较为理想的手段【?。,(,膀胱肿瘤的遗传学改变 染色体畸变是许多肿瘤的共同特征，包括染色体结构和数目的异常。,,;,,,等,,，通过比较基因组杂交(;,,,,,,,,,, ,,,,,,; ,,,,,,,,,,,,,，,,,)对膀胱肿瘤的细胞遗传学研究表明，染色体的不稳定性与膀胱肿瘤的高危进展有关。在膀胱肿瘤，常见的染色体异常发生在,，,，,,号染色体数目异常，及,号染色体,区,带结构的缺失:,,,,年，,,,,,,,,等，加,根据以往膀胱肿瘤的研究结果，选择了畸变率较高的,个染色体着丝粒和一个区带探针即,、,、,、,、,,、,,、,,、,,、,和,,,,，对,,例膀胱肿瘤患者和,例正常志愿者的尿脱落细胞进行荧光原位杂交研究，分析单个探针和组合探针敏感性的差异，结果显示四探针即,、,、,,染色体着丝粒和,,,,特异位点的敏感性最高;,,,,,,纠,,,对,,例膀胱上皮细胞癌的石蜡组织切片进行,，,,研究，结果,，,，,,号染色体多倍体分别占,,,，,,(,,，,,,;,,，,,;;,等,,,,对,,例膀胱肿瘤的,，,,研究表明，,,号染色体的畸变率为,,,，多倍体为,,,;,,,,,等研究认为，,号染色体上至少存在,各与膀胱肿瘤发生相关的抑癌基因位点，即,,,,(,,，,？,,区带，,,,,的纯合性缺失率为,,(,,(,,,，目前已知的,,,抑癌基因定位于,,,,区带，与细胞周期的调控有关,,,,。,(, ,，,,在膀胱肿瘤诊断中的应用,(,(, ,，,,技术的原理 , 硕士学位论文 ,，,,技术是,,世纪,,年代末，,,,,,,～?,等在原有的放射性原位杂交技术基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术，是监测细胞,,,含量畸变的一种方法，与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有安全快速，灵敏度高，检测信号强，杂交特异性高，能同时显示多种颜色等优点，不仅能显示中期分裂相，而且能显示间期核(其原理是将荧光素标记的小,,,片段作为探针，按照碱基互补的原则，与染色体或染色质上与之同源的靶序列进行特异性的杂交结合，杂交后在荧光显微镜下可以被激发出荧光，根据荧光信...