毛细管电泳测定阿片肽方法的探索

毛细管电泳测定阿片肽方法的探索 项目完成人员:董标 董方霆 梁月琴 吴胜明 杨征* 项目完成单位:军事医学科学院国家生物医学分析中心 *中国人民解放军第307医院 摘 要 阿片肽是一类具有广泛作用的神经肽，放射免疫分析(RIA)是目前测定生物体内微量阿片肽的一种灵敏方法，但也存在诸多缺点。为了开辟阿片肽定量的新途径，我们以阿片肽的标准品(脑啡肽、强啡肽、,-内啡肽)为分离目标，采用毛细管电泳技术对此进行摸索。以荧光素异硫氰酸盐(FITC)为衍生化试剂，建立用毛细管区带电泳-激光诱导荧光检测测定亮氨酸脑啡肽(Leu-ENK)的方法， -14检测限达10mol，线性范围是35.2~563.1 fmol/,L，(n=7)r=0.9985。测得样品微透析液中脑啡肽的 -15含量为7.4，10 mol/,L，并对串联质谱测定阿片肽的方法进行尝试。 阿片肽存在于哺乳动物的组织和体液中，作用极为广泛，具有镇痛、抑制呼吸和参与 [1]应激反应等功能，与学习和记忆、生殖内分泌、免疫功能的调节也密切相关。阿片肽的定量测定最常用的方法是放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA)，它是通过专一活性(specific activity)高的示踪物，观察抗原与抗体结合反应产物来定量微量物质的一种分析方法。其缺点是一个抗体和其它肽的交叉免疫反应，限制了分子的专一性;其次放免试剂盒的成本较高，一种放免试剂盒只能测定其中一种阿片肽，操作复杂费时，使用 125 时接触有生物毒性的放射性物质(如I)，易对人体造成损害。毛细管电泳是上世纪80年代初迅速发展起来的一门分离分析技术，具有高效、快速、灵敏、样品用量少等特点， [2-3]在生命科学、环境科学、食品科学、临床等领域有着广泛的应用。毛细管电泳的分离模式众多，分离机理也各不相同，对样品来源受到限制的少量体积样品(如微透析液)分析，尤其是毛细管电泳-激光诱导荧光检测(CE-LIF)，已成为首选技术。目前，CE-LIF [4-5]用于直接测定微透析液中物质主要集中在一些氨基酸和生物胺等小分子物质方面，未见测定多肽、蛋白等生物大分子的报道。为了开辟阿片肽定量的新途径，对生物样品中微量的阿片肽能同时测定，我们以阿片肽的标准品(脑啡肽、强啡肽、,-内啡肽)为分离目标，采用毛细管电泳技术对此进行摸索。 一、实验部分 1.1仪器与试剂 P/ACE5000型毛细管电泳仪(Beckman 公司，美国)，配有紫外-可见检测器和氩离 67 子激光诱导荧光检测器(, = 488nm，, = 513nm)，Gold System数据处理系统;弹性exem 石英毛细管柱，50、75,m内径，购自河北永年光导纤维厂。质谱仪为电喷雾四极杆飞行时间串联质谱Q-TOF 2，英国micromass公司;亮氨酸脑啡肽(Leu-ENK)纯度99%、含量79%，强啡肽A(DYN A)纯度99%、含量72%，,-内啡肽(,-EP)纯度99%、含量77%，均购自sigma公司;荧光素异硫氰酸盐(FITC)异构体Ι、三羟基甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)为进口分装;四硼酸钠、硼砂、氢氧化钠等试剂均为国产分析纯。实验用水均为Milli-Q级，实验室自制。微透析液用微透析探针采自大鼠脑部的伏隔核区，分子量截留大于3500D，由合作单位提供。 1.2 缓冲液的配制 Tris-HPO缓冲液:称取一定量的Tris，水溶解后，用HPO4调pH，定容至所需浓。 343 Tris-硼砂缓冲液:称取Tris和硼砂,适量水溶解后，用NaOH调pH，定容至所需浓度。 硼砂-硼酸缓冲液(含SDS):称取适量硼砂、硼酸、SDS，加一定量的水溶解后，用NaOH调pH，定容至刻度。 1.3 标准品溶液的配制 精密称取一定量的阿片肽标准品，用去离子水溶解，配成浓度为1mg/mL的储备液，放-20?保存，临用前稀释到所需的浓度。微透析液每次取5,L，未作任何处理，直接进行衍生化分析。 1.4 样品的衍生化过程 所有衍生化过程都在200,L具塞离心管中进行。取一定量的样品液和0.2mol/L pH9.0碳酸钠盐缓冲液，衍生化时加入一定量的FITC溶液(0.2mg/mL，乙腈溶解，含1%甲醇、0.25‰吡啶v/v)，涡旋混匀后避光室温反应12-14h。空白对照按相同方法配制，每次样品衍生化时均同时制备空白对照。 1.5 电泳条件 柱子使用前用0.1mol/L的NaOH，HO、运行缓冲液分别洗柱10min，每次进样前用2 HO压力冲洗2min，缓冲液冲洗4min。每分析4-5次后更换新的运行缓冲液，UV或LIF2 检测。 68 二、结果与讨论 2.1分离模式的选择 P/ACE5000型毛细管电泳仪配有检测器(波长200nm、214nm、254nm、280nm)和激光诱导荧光(LIF)检测器(,ex/,em 488/520nm)。由于UV检测器的通用性，对于蛋白质、肽类样品不需要任何处理即可检测，我们首先用UV检测方法对阿片肽标准品进行分离。采用MEKC的分离模式对阿片肽标准品分别进样分离，仅Leu-ENK脑啡肽出现色谱峰。采用CZE分离，Leu-ENK、,-EP、DYN A在不同的保留时间出峰，混合后进样，三者能完全分开，见图1、2。在相同进样量情况下，Leu-ENK色谱峰的吸收强度约是MECC分离时的色谱峰强度的10多倍，故此确定CZE为分离模式。配制一系列不同 -12浓度的阿片肽标准混合液，进行分离。阿片肽的UV最小检测限约为2，10 mol/,L。文献报道用RIA测定脑组织中内源性阿片肽的浓度仅为pg/mg的水平，UV检测的灵敏度远低于实际样品的含量。LIF检测是CE所有检测方法中灵敏度最高的一种方法。但是大多数物质的荧光量子产率很低，或不发荧光。特别是感兴趣的一些生物大分子，如氨基酸、多肽和多数蛋白质等。因此，需借助衍生或荧光标记技术，使待测组分转变为能发荧光的衍生物，提高检测灵敏度。不同的荧光试剂有不同的激发和发射波长，标记的对象也不尽相同。常用的荧光衍生试剂见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1–1。 表1–1 常用的荧光衍生试剂 衍生试剂 激发和发射波长 反应物 荧光素异硫氰酸盐 氨基酸、多肽、蛋,ex 490nm ,em 519nm (fluorescein isothiocyanate, FITC) 白质 荧光胺 ,ex 390nm 伯氨基酸 ,em 450nm (fluorecamine) 邻苯二甲醛 氨基酸、多肽、蛋,ex 350nm ,em 450nm (o-phthaldialdehyde，OPA) 白质、胺 萘二醛衍生物 氨基酸，多肽，生,ex 442nm ,em 490nm (naphthalene-2，3-dicarboxyaldehyde，NDA) 物胺 3-(4-羧基甲酰基)-2-奎宁羧醛 ,ex 456nm 氨基酸、多肽 ,em 552nm [3-(4-carboxybenzoyl)-2-quinoline，CBQCA] 四甲基罗丹明异硫氰酸盐 ,ex 543nm (tetramethylrhodamine isothiocyanate，氨基酸、多肽 ,em 570 nm TRITC) 异硫氰酸苯脂 氨基酸、多肽、蛋,ex 290nm ,em 345nm (phenyl-isothiocyanate，PITC) 白质 9-芴基甲基氯甲酚酯 ,ex 260nm 氨基酸 ,em 305nm (9-fluorenylnethyl chloroformate，FMOC) 69 恰当地选择激发波长和荧光标记试剂，对提高检测灵敏度有着重要意义。毛细管电泳仪配备的LIF检测器，其,ex/,em为固定波长(488/520 nm)，限制了荧光试剂的选择范围，最适合的荧光衍生试剂仅有FITC。 ENK ENK ENK ,-EP DYN 图1 MEKC和CZE分离脑啡肽标准品电泳图 图2 阿片肽标准品混合物的CZE分离图 MEKC的分离条件:毛细管柱:50,m ，57cm ;电压:20KV， CZE分离条件:毛细管柱:50,m ，37cm ;电压:50mmol/L pH8.5硼砂，含50 mmol/LSDS，检测:(UV)15KV，缓冲液: 50 mmol/L pH2.5Tris-HPO，34200nm 柱温20?，压力进样30s。脑啡肽0.5mg/mL 检测:(UV)200nm 柱温20?，压力进样2s。CZE分离条件:毛细管柱:50,m ，37cm ;电压:15KV 脑啡肽、强啡肽、内啡肽均为0.5mg/mL。 缓冲液: 50 mmol/L pH2.5Tris-HPO，检测:(UV)200nm 34 柱温20?，压力进样4s。脑啡肽0.5mg/mL 2.2样品衍生化条件的优化 [6-8]FITC用于标记胺、氨基酸、抗体等衍生化条件已有很多研究，用于多肽的衍生化还未见文献报道。为了达到最佳的检测灵敏度和分离效率，对柱前衍生条件进行优化是必需的。影响衍生化的因素很多，有反应时间、pH、缓冲液等，我们以Leu-ENK为对象对这些因素考察。文献中溶解FITC的溶剂有丙酮、乙腈、甲醇。经比较发现，用乙腈作溶剂时，分离色谱图上FITC副产物的峰少，FITC-ENK色谱峰的荧光强度与丙酮、甲醇作溶剂时相近，故选择乙腈作为FITC的溶剂。FITC衍生化的过程不快，随着标记化合物的不同，文献上报道的反应时间也不同。衍生化时微量吡啶的存在，会加速反应完成， [5]且起到稳定衍生化产物的作用，因此配制FITC溶液时加入痕量的吡啶。考察了2h、4h、8h、12h、16h 不同时间点的衍生化程度，发现在12h反应已完全，在实验时采取衍生化反应12-14h。比较碳酸钠盐(CB)缓冲液pH9.0和pH9.0的硼砂缓冲液对衍生化效率的影响，二者结果相近。 70 在优化的衍生条件下对阿片肽的标准品Leu-ENK、,-EP、DYN A分别进行CZE-LIF A B C D FITC-DYN 3 3 { FITC-ENK 3 FITC-EP { 2 2 2 3 2 荧光相对强度 1 1 4 4 1 4 4 min min min min 图3 CZE-LIF分离三种FITC衍生化的阿片肽标准品电泳图 A空白对照，B 脑啡肽标准品，C 内啡肽标准品，D 强啡肽标准品，1、2、3、4为FITC及其 降解产物峰。分离条件:75,m ， 67cm，60 mmol/L pH9.4 Tris-硼砂缓冲液，电压350kv/cm， LIF检测:,ex/,em 488/520 nm，柱温25?， 压力进样3s。 分析，结果如图3。脑啡肽的FITC-ENK为一单峰，而,-EP和DYN均为多个色谱峰， [9]可能是多重标记造成的，故强啡肽和,-内啡肽不适宜用FITC进行衍生化测定，无法对,-EP和DYN进行定量分析。 2.3分离条件的优化 进样方式的选择:电动进样与样品溶液的离子强度和各组分的淌度有关，存在“电歧视”现象，故均采用最常用的压力进样方式。电泳分离效果的指标主要考察FITC-ENK峰与FITC及其降解产物色谱峰的分离情况。比较了不同毛细管长度(47、57、67cm)和内径(50、75,m)的分离情况。毛细管柱长分离度好，出峰时间延长;在毛细管柱长度相同的情况下，50,m内径柱分离好于75,m，但由于进样量小，检测限低于后者近一个数量级。综合各种因素，我们选择的毛细管柱为75,m ， 67cm。考察Tris-硼砂缓冲液不同浓度(20、40、60、80 mmol/L)的分离效果，60 mmol/L分析效果最好。电泳缓冲液的浓度太低，不仅样品区带会发生电扩散，而且电渗流(EOF)的速度过快，降低FITC衍生物的有效淌度差异，从而降低分离效率。随着缓冲液的浓度增加，电渗流速度降低，溶质在毛细管内的迁移速率下降，因此迁移时间延长。但浓度太高，产生的焦耳热的增加也会降低分辨率和分离效率。缓冲液pH是又一影响电泳分离的重要因素，比较pH为8.6、9.0、9.4、9.8、10.0缓冲液的分离结果，选择pH9.4的Tris-硼砂缓冲液。 2.4工作曲线的建立 取Leu-ENK储备液，用水稀释配制一系列不同浓度(,g/mL)0.05、0.08、0.10、0.20、0.40、0.80、1.00的Leu-ENK标准液，各取80,L，按1.4项下方法操作，加入40, L的 71 FITC 和40, L碳酸盐缓冲液，衍生化后进行CZE-LIF分析，所得结果见表2-2。以峰面积A对其相应的浓度C(fmol/,L)进行回归分析，结果见图4，得到回归方程 A =0.49466+0.08592C n=7，r=0.9985。 表2-2 脑啡肽的测定结果 衍生化后脑啡肽的浓度(fmol/,L) 测定的色谱峰面积 35.2 3.29889 56.3 5.53304 70.4 6.20926 140.8 14.15606 281.5 23.09028 422.3 36.54417 563.1 49.49354 50 40 30 20 Peak Area10 FITC {0A B C D 0100200300400500600 Concentration(fmol/μ L) 图4 ENK的线性回归曲线 FITC-ENK 荧光相对强度 min min min min 图5 CZE-LIF分离FITC衍生化的脑啡肽标准品电泳图 A空白对照，B ENK标准品35.2 fmol/,L.，C ENK标准品70.4 fmol/,L D ENK标准品140.8 fmol/,L， 分离条件:75,m ， 67cm，60 mmol/L pH9.4 Tris-硼砂缓冲液，电压350kv/cm，LIF检测:,ex/,em 488/520 nm，柱温25?， 压力进样2s。 FITC-ENK -15 以3倍信噪比计算检出限，得到ENK检测限为1.6 ， 10 mol/ ,L，电泳图见图5。连续进样5次来考察所建立电泳方法的重复性，色谱峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD)分别为10.36%和0.72%。色谱峰面积的RSD较大，部分原因是衍生化后样品中含有易挥发的溶剂乙腈。一段时间后，由于乙腈的挥发，样品的体积变小，浓度相对变 FITC-ENK -15大所致。文献中报道CE-LIF的浓度检测限达10mol/L水平，是在样品浓度过高的情况 72 下对FITC进行衍生化，然后再逐级稀释到所需浓度，不涉及实际微量样品的分析测定。这种条件下得到的检测限实际上只反映了LIF检测器的检测灵敏度，并不能真实反映整 -15个分析方法的检测限。用建立的方法对实际样品进行测定，测得微透析液中ENK的含量为7.4，10 mol/,L，见图6。 A B C FITC-ENK ? 图6 实际样品测定的CZE-LIF图 A 空白对照 B 脑啡肽标准品 C 微透析液 FITC-ENK 分离条件:75,m ， 67cm，60 mmol/L pH9.4 Tris-硼砂缓冲液，电压350kv/cm， LIF检测:,ex/,em 488/520 nm，柱温25?， 压力进样3s 2.5串联质谱法测定阿片肽 我们还尝试建立串联质谱Q-TOF测定阿片肽方法，根据质谱峰强度来定量。配制一 -14系列不同浓度的阿片肽标准品进行测定，检出限为5， 10 mol/ ,L。分析微透析液样品，未检出阿片肽，见图7。另外，由于影响质谱峰(离子流)的强度因素很多，用其定量较为困难。 73 ,-EP A B DYN-A ENK 图7 阿片肽标准品与微透析样品的Q-TOF质谱图 A:三种阿片肽混合物 100fmol/ ,L。 B 微透析液样品 MS-MS测定条件:Cone电压 45,。质量扫描范围 0.5, 2,,。源温 80?。去溶剂气体温 度150?，去溶剂气体流量300L/h 。碰撞气体压力0.24 ,,,。碰撞能量 3 0, 50,。 三、结论 ，[10-13][1113] CE用于神经肽方面的研究已有不少报道，其中Förtüs-Matei A.等 以阿片肽标准品为分析对象，建立CE的分离方法，用MEKC分离合成的强啡肽、脑啡肽及其类似物，没有应用于实际样品。用CE直接测定微透析液中阿片肽的研究至今尚为见报道，我们用毛细管电泳技术对阿片肽定量进行摸索，建立CZE-LIF测定Leu-ENK的方法，并测定了微透析液中脑啡肽的含量。这对于研究脑啡肽的作用机制，具有一定的现实意义。建立的CZE-LIF测定ENK的方法还需要在实际应用中进一步完善。 参考文献 1. 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