IPTG诱导浓度、时间及温度对重组促性腺激素释放激素基因表达的影响

IPTG诱导浓度、时间及温度对重组促性腺激素释放激素基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的影响 IPTG诱导浓度、时间及温度对重组促性腺 激素释放激素基因表达的影响 《黑龙江畜牧兽医)2006年第8期17 IPTG诱导浓度,时问及温度对重组促性腺激素 释放激素基因表达的影响 金元昌,刘利,苏晓艳,李景鹏,李会东,周建红 (1.广西大学生命科学与技术学院,广西南宁530004;2.湖南科技大学生命科学学院,湖南湘潭411201; 3.贺州学院,广西贺州542800;4.湖南科技大学附属医院,湖南湘潭411201; 5.东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨150030) 中图分类号:Q786文献标识码:A文章编号:1004—7034(2006)08—0017—03 关键词:促性腺激素释放激素;诱导浓度;外源蛋白;表达 摘要:以人工合成的促性腺激素释放激素 (gonadotropinreleasinghormone,GnRH)/转运肽(TRS)基 因与表达载体pGEX一6p一1相连的重组子(pGE—G)作为研究对象,转化大肠杆菌BI21(ED3)plyS. 利用IPTG作为诱导剂,分析比较不同IPTG诱导条件对于表达产物的影响,以确定最佳IPTG诱导条 件.结果表明:融合蛋白大部分以包涵体的形式存在,诱导温度为30?;IPTG浓度为0.2mmol/L 时,可溶性融合蛋白GST—GnRH/TRS表达量最大.光密度扫描对表达产物进行初步定量,表明表 达产物约占菌体总蛋白的33.3%. IPTG为异丙基硫一D一代半乳糖苷,是I8一半 乳糖苷酶底物的类似物,有很强的诱导力,在有IPTG 诱导物存在的条件下,诱导物可与阻遏蛋白结合成复 合物,而使阻遏蛋白构象发生改变,阻遏蛋白就不能 再与O基因结合,从而促进基因表达.促性腺激素 释放激素(GnRH)为下丘脑神经元分泌的十肽激素, 下丘脑的GnRH分泌呈典型的脉冲式释放,这是成熟 动物的特征,对于性周期的形成是至关重要的,下丘 脑GnRH脉冲式释放模式的丧失将导致闭经...试 验以IPTG不同浓度,不同诱导时间和不同诱导温度 对重组GnRH基因进行诱导表达,以研究IPTG诱导 浓度,时间及温度对重组GnRH基因表达的影响. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1工程菌 质粒pGEX一6p一1,东北农业大学生命科学学 院基因部保存;受体细胞JM109及BI21(DE3)plyS, 购自PROMEQA公司;重组促性腺激素释放激素/转 运肽基因的工程菌pGE—G,东北农业大学生命科学 学院基因部构建. 1.2材料 x—gal,IPTG,青霉素,低分子质量蛋白 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 ,丙 烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,购自大连宝生物工程有限 收稿日期:2005—10—08 作者简介:金元昌(1969一),男,讲师,硕士研究生 公司;酵母提取物,胰蛋白胨,低熔点琼脂糖,购自北 京原平皓生物工程公司.其他试剂均为国产分析纯. 1.3主要仪器 高速低温离心机(美国,Beckman),电子分析天 平(瑞士,MettlerToledo),移液器(法国,Gilson,德国, Eppendorf),一20?冰柜(海尔),一70?冰柜(日本, Sanyo),电泳仪(美国,Bio—Rad),高压灭菌锅(13 本,Sanyo),超纯水器(英国,UVP),凝胶成相仪(美 国,Millipore),直流电泳仪(DYY一111型,北京六一仪 器厂),超净工作台(FromaScientific1829.SN.17069 — 15),紫外分光光度计(日本,uV一120—02),pH 计(pHS一3C型,上海雷磁仪器厂),电热恒温水槽 (DK一80型,上海精宏实验设备有限公司),高速台 式离心机(TGL一16型,上海医疗器械六厂),低速离 心机(LD4—2型,北京医用离心机厂),水浴摇床 (HZS—D型,哈尔滨市东联电子技术开发公司),垂 直板电泳系统(DYY一111型,北京六一仪器厂)等 1.4方法 将含有阳性重组子pGE—G的BL21(DE3)plysS 菌接种于含Amp100mL的LB液体培养基中, 37?培养过夜.取上述过夜培养物以1/10的比例 接种于新鲜的LB(含Amp100g/mL)液体培养基 中. 1.4.1最适诱导剂浓度的选择取4支试管,每管 分装扩大培养液2mL,分别按0.2,0.6,1.0, 2.0mmol/L的终浓度加入诱导剂IPTG,37?振荡培 18 HeilongjiangAnimalScience andVeterinaryMedicine?82006 养4h至OD590达0.6.用SDS—PAGE分析,比较,依 据融合蛋白表达量的多少选出最适诱导剂浓度. 1.4.2最适诱导时间的选择在余下的10mL扩大 培养菌液中,加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG,继 续振荡培养,并分别在2,3,4,5,20h后各取出2mL 诱导培养菌液,置4?冰箱中终止培养,再用SDS— PAGE分析,比较融合蛋白的表达量,选出最适诱导 时间. 1.4.3最适诱导温度的选择除在37?进行诱导 表达外,另在30?进行诱导表达,超声破碎菌体,观 察诱导温度对可溶性融合蛋白所占比例的影响. 2结果 2.1GST—GnRI-I/TRS初步表达SDS—PAGE分析 用SDS—PAGE鉴定,结果在24ku与29ku之间 产生1条特异的蛋白带(箭头所示),与预期蛋白 (GST—GnRH/TR,28ku)的大小一致,诱导2h的对 照的非重组PGEX一6P一1产生25ku(GST)带,而未 经IPTG诱导的质粒菌的培养物样品无特异带出现 (见图1). 34 瞧 1,2,5,6,7.0.2mmol/LIPTG诱导2,3,4,5,20h;3.未诱导 的pYC2/BL21(DE3)plysS;4.标准蛋白质分子质量(66,45. 36,29,24,20,14ku);8,9,10.0.6,1.0,2.0mmol/LIPTG诱 导4h. 图2融合蛋白表达的最佳诱导剂浓度和诱导表达时间 2.3不同温度的优化表达SDS—PAGE分析 取超声破碎处理后的37?诱导菌液上清液和沉 淀进行SDS—PAGES分析.结果表明,融合蛋白大 部分以包涵体的形式存在.把诱导温度降为30?, 0.2mmo~L的IPTG诱导时,可溶性融合蛋白占大多 数,光密度扫描对其进行定量分析表明,该可溶性融 合蛋白约占菌体总可溶性蛋白的33.3%(见图3). 1.标准蛋白质分子质量;2.2h诱导阳性;3.诱导前阳性; 4.2h诱导阴性;5.4h诱导阳性;6.4h诱导阴性. 图1重组菌表达产物的凝胶电泳结果 KuM2l 66{ 45搴 36 29 24 未诱导的pYC2/BL21(DE3) plysS. 图3融合蛋白表达的最佳诱导温度 2.4表达产物的含量测定 2?2不同时间及浓度的优化表达SDS—PAGE分析光密度扫描对表 达产物进行定量分析(见图4), SDS—PAGE结果表明,诱导时间和IPTG浓度对第一峰为表达蛋白, 对应于NO.7.结果表明,融合蛋 GST—GnRI-L/TRS蛋白的产量无显着影响(见图2).白约占菌体总蛋 白的33.3%. 0 0 0 — 0. 80-4 ,0.0o0 — 0.200 135.3 N0.YP0SAEEAMRRK 249.418V 53.757 891.054 504.835v 437.472V 2113.348v 31955.95v 6576.83v 11855.46V 7773.79v 15534.11v 4613.03v 4279.31v 6370.42v 3496.441v T0TAL95914.5 图4GST—GnRI-L/TRS融合蛋白在大肠杆菌中表达量的光密度扫 描分析 , 2O9542385118466 9OO8OO2361864463 舳{8?Sj?m坞”{;} 123456789O12345 《黑龙江畜牧兽医)2006年第8期19 3讨论 (1)试验采用IPTG诱导,表达量较高,在摸索了 诱导时间和诱导物浓度对蛋白质表达量的影响时,发 现并不是诱导时间越长蛋白质表达量越多,也不是诱 导物浓度越大蛋白质表达量越多.其中诱导物IPTG 本身有毒性,对于人类临床药用蛋白质的大批量制 备,IPTG并不是理想的诱导物,而且价格也很昂贵. 从目前的研究来看,还没有找到更为理想的诱导物, 凡是用药物诱导法诱导表达目的蛋白均用IPTG诱 导.试验研究表明,在实验室条件下小量表达目的蛋 白质用IPTG诱导还是比较方便的. (2)尽管pGEX一6p一1原核表达系统具有上述 优点,并成功地应用于多种蛋白的表达,但在实际操 作中往往还是存在形成包涵体的问题J,因此,要获 得GnRH/TRS蛋白,需要裂解菌体并溶解包涵体. 裂解菌体的方法有多种,如高压匀浆法,超声破碎法, 酶溶解法,前两种需要反复多次操作才能裂菌完全, 且超声的时间过长或者功率过高,都会显着降低融合 蛋白与谷胱甘肽琼脂糖珠的结合能力,故此研究采用 酶溶法.包涵体的溶解需要打开包涵体中蛋白质分 子间的非共价键和离子键,使多肽伸展.常用溶解包 涵体的变性剂有盐酸胍,尿素,SDS和去垢剂,高离子 强度的盐酸胍溶液可使蛋白质重折叠期间产生聚合, SDS带负电荷并与蛋白质结合形成共价复合物,不利 于纯化,尿素会使融合蛋白的GST部分发生变性,失 去与谷胱甘肽琼脂糖珠的结合能力,因而,试验应用 1%的TritonX一100为去垢剂.考虑到包涵体的 复性相当复杂,故采用了一些减少包涵体的措施,如 降低诱导剂的浓度,采用了30?诱导,30?诱导主 要以可溶性形式存在,而37?诱导主要以包涵体形 式存在,这可能与不同温度环境下菌体内微环境的不 同而造成的蛋白溶解度的改变有关.而诱导时间和 IFFG浓度对GST—GnRH/TRS蛋白的产量无显着影 响. 参考文献: [1]孙刚.胎盘内分泌的基础与临床[M].上海:第二军医大学出版 社,2001:110—111. [2]J萨姆布鲁克,EF弗里奇,T曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南 [M].2版.金冬雁,黎孟枫译.北京:科学出版社,1992. [3]FRANGIONIJV,NEELBG.Solubilizationandpurificationofenzy- maticallyactiveglutathioneS—transferase(pGEX)fusionprotein [J].AnalBiochem,1993,210(1):179—187. [4]方向东,林来兴妹,高基民,等.重组人G—CSF大肠杆菌表达产 物的纯化及鉴定『J1.中国生物制品学杂志,1997,10(1):1—4. Effectofinduceconcentration.timeandtemperatureofIPTGontheexpressio n oftheGST—.GnRH/TRSgene JINYuan—chang..,LIULi,SUXiao—yan.etal (1.CuangxiUniversity,Nanning530004,China;2.CollegeofTechnological, HunanUniversity,Xiangtan411201,China; 3.HezhouUniVersity,Hezhou542800,China;4.Affiliatedhospital,HunanUniversity,Xiangtan411201,China) Keywords:Gonadotropinreleasinghormone(GnRH);inducedconcentration:exogenousprotein:expression Abstract:TheobjectisrecombinantGnRH2SgeneandtransportergenewithfusionexpressionvectorpGEX一6p一1,transformedintotheBI21(ED3) plysSprokaryoticexpressionsystem,inducedandexpressedbyIPTG, analyzedtheeffectofdifferentconcentration,timeandtemperatureofIPTGontheex. pressionoftheGST—GnRH/TRSgene,confirmedthebestinducedconditionofIPTG.SDS—PAGEanalysisshowedthatGST—GnRH/TRSexDressi0n quantityWasthemostwhentemperatureofIPTGWas30qCandconcentrationofIPTGWas0.2mmo~L.TheamountofthegoalproteinWasevaluatedbvden. sitometricscanning.ItindicatedthattheproductoftheGST—GnRH/TRSge neWas33%oftotalbacterialproteinofBI21(ED3).(009) ? 基层园地? 雏鹅马杜拉霉素中毒的诊治 1发病情况 某个体养殖户饲养18日龄雏鹅214只.2005 年7月份,为防治球虫病,用马杜拉霉素拌料饲喂,但 由于称量时失误,将10克马杜拉霉添加到200千克 料(纯品添加剂量应为5毫克/千克)中,次日雏鹅出 现中毒症状,并不断有雏鹅死亡,3天内共死亡雏鹅 165只,死亡率高达78%. 2临床症状 中毒初雏鹅多表现为神经症状,兴奋不安,乱飞 乱跑,口流黏液,头向后仰;后期表现为精神沉郁,食 欲部分或全部废绝,部分病鹅拉白色或浅绿色稀便. 3剖检变化 病死鹅的口,鼻内有黏液,气管出血,腺胃黏膜脱 落,心外膜充血,肝脏淤血,小肠黏膜弥漫性出血,肾 淤血. 4治疗 无特效解毒药,采用综合治疗措施.立即停喂拌 有马杜拉霉素的饲料,更换新料;VI服补液盐饮水,任 鹅自由饮用,症状较重的雏鹅可逐只灌服;饮水中加 入0.02%维生素C. 在临床实践中,要严格掌握马杜拉霉素的用量, 谨防中毒. 李丽,孙宝莹,王金莉(锦州医学院畜牧兽医学 院,辽宁锦州121001) (010)