猪链球菌2型ELISA抗体检测方法的建立及应用

猪链球菌2型ELISA抗体检测方法的建立及应用 猪链球菌2型ELISA抗体检测方法的建立 及应用 2005年第10 !透叠见.19. 猪链球菌2型ELISA抗体检测 '方法的建立及应用 张安定金梅林郑培喻正军涂家刚方兵兵吴斌陈焕春 (华中农业大学动物医学院传染病学研究室,武汉430070) 摘要猪链球菌按照荚膜多糖抗原的不同可分成35个荚膜血清型,提纯猪2型链球菌荚膜多糖抗原包被酶标 板,建立了检测猪2型链球菌血清抗体的间接ELISA检测方法,并将该方法应用于四川省2005年夏季猪血清 流行病学调查和2005年上半年湖北,河南,湖南三省的猪血清流行病学调查. 猪链球菌2型可以引起猪的急性败血症,脑膜 炎,关节炎及急性死亡,也可导致生猪从业人员和特 定人群感染和死亡,是一种重要的人畜共患传染病, 猪链球菌病在我国的大面积流行于20世纪60年 代,主要发生于广东,广西.1976年,四川省50多 个县爆发猪链球菌病,患病猪近百万头,死亡30多 万头,损失增重.1977年广西壮族自治区的51个 县流行此病.1987年江苏,江西等省出现猪链球菌 病流行,至此猪链球菌病在我国2O多个省(市,自治 区)流行.90年代后期,该病又呈明显上升趋势,其 表现形式多病原学方面发生了新的变化.1998, 1999年连续两年的夏季在江苏省南通地区,猪群大 面积暴发流行2型猪链球菌病,发病猪不分品种,年 龄,性别均易感染,发病猪占同群猪的26.38,病 死率达47.21,并导致特定人群感染致死,同时还 有25人受感染发病,14人死亡.2005年6至8月 间,四川省资阳市,内江市等地区暴发流行2型猪链 球菌病,并导致101人感染,37人死亡,发病及病死 人均与发病死猪有过密切的接触史.流行病学调查 结果显示,不明原因猝死的400多头猪在地域分布 上呈分散状,分布于300多户饲养卫生条件较差的 个体散养农户中,大中型养殖场和猪场均未发现病 例.该病已成为严重影响各国养猪业发展的一种重 要疫病,尤其在高密度的养猪场危害更大,同时在公 共卫生上亦显得十分重要,是一种"新的"人畜共患 病,应引起高度重视. 本研究建立了猪2型链球菌抗体的ELISA检 测方法,并将四川省简阳县,雁江县,乐至县发病猪 同群生猪血清样品84份用本ELISA方法检测,拟 了解猪链球菌2型在猪体的分布情况及同群猪感染 为该病的流行病学调查提供相关依据. 状况, 1材料与方法 1.1菌株 猪链球菌2型SC-1株,分离自发病猪内脏,由 四川省动物防疫监督总站分离,华中农业大学动物 医学院传染病学研究室鉴定与保存. 1.2血清样品 2005年7月采集自四川省猪链球菌2型发病 疫区血样84份;2005年上半年湖北,湖南,河南三 省送检的猪血清分别为438,150,89份,由华中农业 大学动物医学院传染病学研究室保存. 1.3猪2型链球菌荚膜多糖抗原的制备 将猪2型链球菌接种于含10犊牛血清的 TSA溶液(Becton,Dickinsonandcompany)中, 37?培养8h.使用0.3甲醛37?灭活24h.将灭 活的猪2型链球菌使用生理盐水洗3遍(10, 000rpm,5min),用1/10体积的生理盐水将其溶解, :Q:垫!狃殖 加入2的NaC1于4~C过夜(8,10h),10,000rpm, 10min,分别收集上清和沉淀:?上清于生理盐水中 4?透析48h后,煮沸15min,于10,000rpm,10rain 后收集上清;?将沉淀溶于10ml生理盐水中,超声 波破碎后,10,000rpm,10rain,收集上清煮沸 15min,于10,000rpm,10min后收集上清.将?和 ?混合备用. 1.4 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 阴性血清,标准阳性血清的制备 采集链球菌阴性的健康猪血清作为标准阴性血 fL化后免疫健康猪制 清.将链球菌灭活用弗氏佐N 备的血清作为标准阳性血清. 1.5ELlSA最佳反应条件的确定 使用方阵滴定的方法确定抗原(CPS)的最佳包 被浓度和待检猪血清的最佳稀释度.并选择适当的 封闭液(5脱脂乳,1BSA,0.5BSA)和血清稀 释液(0.5BSA,0.1BSA,5脱脂乳),同时确定 最佳反应程序. 1.6特异性试验 将猪的主要疫病血清用本E1ISA方法检测,以 确定本方法的特异性.主要疫病血清有:猪伪狂犬 病毒(PRV)的抗血清1份,猪细小病毒(PPV)的抗 血清1份,猪瘟病毒(HCV)的抗血清1份,猪圆环 病毒(PCV)的抗血清1份,猪蓝耳病毒(PRRSV)的 抗血清1份,猪口蹄疫病毒(FMDV)的抗血清1份, 猪日本乙型脑炎病毒(JEV)的抗血清1份,猪沙门 i圊.料QQ墨生筮Q塑 氏菌抗血清1份,猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)1,3,7 型的抗血清7份,猪副嗜血杆菌(HPS)的抗血清12 份,猪大肠肝菌08,K88,O157,H7抗原的抗血清, 猪C群链球菌病的抗血清15份,均由华中农业大 学农业微生物学国家重点实验室动物病原微生物分 室制备与保存 1.7敏感性试验 将琼脂扩散试验(AG1P)检测为阳性的10份猪 血清倍比稀释后分别用猪链球菌2型ELISA抗体 检测试剂盒和AGIP检测,并将两者的结果进行比 较,以确定ELISA方法的敏感性. 1.8临床应用 雁江县,乐至县发病猪同群生 将四川省简阳县, 猪血清样品84份用本ELISA方法检测,同时将本 方法用于检测湖北,湖南,河南三省送检的临床血 清,以评价本方法的临床应用效果. 2结果与讨论 2.1EUSA最佳反应条件的确定 使用方阵滴定的方法确定抗原(CPS)的最佳包 被浓度为1:80,待检猪血清的最佳稀释度为1: 4O. 分别将5脱脂乳,1BSA,0.5BSA作为封 闭液,检测标准阴性,阳性血清,结果表明5%脱脂 乳最适合作为本ELISA方法的封闭液. 表1猪主要病毒病抗血清的检测结果 OD6300.31o.17o.25o.160.200.17o.1o.28o.30o.170.210.16 猪C群链球菌123456789lO1112131415 01363oo.16o.38o.23o.19o.22o.30o.16o.230.230.25o.15o.28o.29o.25o.19 AGIP(效价)】:l】:2l:l】:1l:21:2l:ll:41:1I:2 ELISA(~:gr)1:3201:3201:3201:640I:640I:3201:3201:640I:3201:640 ELISA/AGIP320160320640320160320160320320 分别将0.59/6BSA,0.19/5BSA,59/5脱脂乳作为 血清稀释液,结果表明使用59/5的脱脂乳时背景最 低,且阳性值变化不明显.因此选用5脱脂乳作 为本EL1SA方法的血清稀释液. 通过检测100份阴牲猪血清,按平均值加上3 倍标准差计算得到本方法的临界值为0.4. 本方法的最佳反应程序为: 包被程序:用pH9.6的0.05moiL碳酸盐缓 冲液稀释抗原至工作浓度(1:80),lDOJ/孔包被酶 标板,4c包被过夜(12h),甩干.加人含5脱脂乳 的磷酸盐缓冲液封闭37?1h,甩干. 操作程序:?取酶标板,加人5脱脂乳稀释的 待检血清(1:40),lOO~,1/~L,37?,30rain,PBST洗 板3次,每次3rain.?加人1:5000稀释的酶标抗 体,lOOffl/~b,37?,30rain,PBST洗板3次,每次 3rain.?加入底物,lOOffl/~b,室温避光显色 10rain.?加终止液5Ol/孔终止反应,酶联免疫检 测仪测630nm值. 2.2特异性试验 将猪的主要疫病m清用本EL1SA方法检测,检 测结果(见表1—1,1—2)表明所有非2型猪链球菌的 疫病m清检测结果全部为阴性,而3份猪2型链球 菌的.清则检测全部为阳性,说明本方法具有很好 的敏感性. 2.3敏感性试验 将琼脂扩散试验(AG1P)检测为阳性的10份猪 血清倍比稀释后分别用猪链球菌2型EL1SA抗体 检测试剂盒和AGIP检测,结果(表3)表明ELISA 的敏感性是琼脂扩散试验的16O,64O倍. 2.4临床应用 将四川省简阳县,雁江县,乐至县发病猪同群牛 猪血清样品84份用本ELISA方法检测,检测结果 为阳性样品23份,可疑样品3份,阴性58份,阳性 率达27.3,与四川猪2型链球菌流行情况基本相 符.说明了本方法较好的临床应用效果. 另外将湖北(438),湖南(150),河南(89)三省送 检的临床血清用ELISA试剂盒检测,结果(见表4) 三省检出的阳性血清分别为255(58.2),86(57. 且各个猪场的阳性率变化很大 3),62(69.7)份, (0----1009/6).阳性率偏高的原因:?可能是由于所 检测的血清大部分为发病猪的血清;?也可能是三 省的猪场使用自家苗普遍的缘故.但是也说明了猪 链球菌2型确实在这三省流行,应予重视. 表4临床血清样品的检测结果 *其中有3份判为可疑. 3小结 (1)本方法操作简便,经济,快速,且E11SA方 法在我国各级兽医检测部门已应用多年,适合推 广应用.而且ELISA敏感性高,特异性好,在本病 的诊断,检疫及流行病学涧查中具有一定的实用 价值 (2)猪2型链球菌在我国的严峻形势使准确的 检测变得相当重要,为了满足各级兽医部门检疫的 需要,我们已按本ELISA方法组装了猪链球菌2型 ELISA抗体检测试剂盒用于猪2型链球菌的诊断 和抗体水平的监测.