硅胶柱层析
展开剂的配制:将氯仿、甲醇及水按65:25:4的比例配制摇匀，配置展开剂时要严格按比例进行，否则很容易三相溶解不完全而出现分层现象，由于试剂容易挥发，每次使用都要重新配制。
将硅胶G板在105℃下活化至少半个小时。取出密闭冷却，然后在距离底端约1cm的同一水平上，点上样品溶液和大豆卵磷脂标样溶液，放进展开缸中进行展开，层析缸里的展开剂用量不得超过点样点。展开至距顶端约1cm处，爬板结束，取出晾干，放在碘缸中显色，磷脂成分会显示为黄色圆点。根据显色结果，可以判断样品中是否含有PC。而且如果有其他磷脂标样，还可以由不同磷脂成分的比移值，来判断样品中是否含有其他磷脂杂质。
磷脂酸胆碱的定性分析
1. 薄板的制备
称量硅胶G6g溶解于0. 5%梭甲基纤维素钠溶液18ml，调匀并经超声波震荡2min以赶走气泡，倒在洁净的20x7cm玻璃板上，使之涂布均匀。薄层厚度控制在0.2~0.25mm。自然晾干后，放在105℃烘箱内活化30min，置于干燥器中备用。
2. 样品的制备
称取10mg样品，加氯仿一甲醇溶液(1:1)1 ml充分溶解。
3. 点样
用微量进样器量取50ul
标准
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品或样品溶液点在薄层板距板的边缘2cm处，两边各留1.5cm(防止边缘效应)，各个点样点之间保持一定的距离，点样面积不超过5mm。
4. 展开
展开剂为氯仿:甲醇:水(体积比65:25:4)待溶剂挥发后，放入盛有展开剂的层析缸中，展开至顶端scm时取出薄板。
5. 显色及定位
将挥发尽溶剂的薄板放入碘缸内，盖好。升华的碘遇磷脂发生加成反应，而使磷脂的斑点呈现黄色。
硅胶柱层析可以去除PE、LPC等杂质磷脂，而PI及另外两种微量杂质必须通过其他方法除去。
当层析柱规格为φ20mm×700mm时大豆磷脂分离最佳的工艺条件为：采用的硅胶为80-120目粗孔2号硅胶，洗脱液为石油醚；石油醚：异丙醇：水=1：1：0.175， 流速为1.1BV/h，上样量为0.5g大豆水化油脚/g硅胶，柱温为室温。 得到的产物PC含量为85%左右。
当层析柱规格为φ14mmx700mm时大豆磷脂精制最佳的工艺条件为：采用吸附介质为100一200目的氧化铝，洗脱液为氯仿:甲醇(9/1，1/9各3.5BV)，流速为1.5BV/h，上样量为0.06g硅胶柱层析产物g/氧化铝，柱温为室温。此时，柱层析产物PC含量大于95%，柱层析阶段PC收率大于95%。
硅胶柱层析柱规格: φ20mm×700mm，硅胶型号为粗孔11号硅胶，45g; 柱高:35.2cm，床层体积:110.53;柱温:12℃;进样量:7.515g 粗提产物(PC纯度为43.86%)，溶于25ml洗脱液中;流速:1~1.5ml/min。
其中硅胶柱层析实验条件如下:
硅胶型号:80~120目粗孔2号硅胶(青岛海洋化工厂);
洗脱液: 石油醚(60~90℃):乙醇:水(1:1:0.175)，若大豆水化油脚
中本身不含有金属离子，则应采用正己烷来代替石油醚;
柱温:25℃左右;
上样量:0.0379粗提产物/ml床层体积;
上样浓度:0.2759粗提产物/m1洗脱液。
根据柱中色带和薄层色谱检测馏分的结果，将出现单一斑点，且在同一块薄层板上与标样卵磷脂有同一R，值的馏分收集在一起，然后用旋转蒸发器浓缩至膏状，真空干燥，即得到卵磷脂产品。称量，计算得率。
氧化铝做为吸附剂有二点不利之处:①由于吸附磷脂酞乙醇胺难于脱附不得不丢弃;②在层析中生成溶血性磷脂。一般说来，若分离的样品是溶于有机溶剂、具有中等分子量的非离子型化合物，尤其是含有多官能团及同分异构的化合物，适用于用硅胶色谱分离。用硅胶柱层析时，它最大的优点是硅胶可以重复使用，收集完大多洗脱液后硅胶只吸附很少量卵磷脂;另一个优点是高处理量。
硅胶板的制备方法
称量硅胶G6g溶解于0.5%羧酸甲基纤维素钠溶液18ml，调匀并经超声波震荡2min以赶走气，倒在洁净的20X7cm玻璃板上，使之涂布均匀。薄层厚度控制在0.2~0.25mm。自然晾干后，放在105℃烘箱内活化30min，置于干燥器中备用。
柱层析纯化操作步骤
（1）装柱 将玻璃层析柱垂直装置，以自动部分收集器作为洗脱液的接收器。用镊子取少许脱脂棉放于干净的层析柱底部，轻轻塞紧，再在脱脂棉上盖一层厚0.5cm的石英砂，关闭活塞，向柱中倒入氯仿至柱高的3/4处，打开活塞，控制流速为1滴/s。将氯仿与一定量的氧化铝调成糊状，徐徐倒入柱中。用木棒轻轻敲打柱身下部，使填装紧密，当装柱至3/4时，再在上面加一层0.5cm后的石英砂。操作时保持上述流速，使液面不低于砂子的上层。
（2）上样 准确称取一定量的蜡状卵磷脂，用尽可能少的氯仿溶解。当溶液液面刚好流至石英砂面时，立即沿柱壁加入配置好的卵磷脂溶液。
（3）洗脱 当此溶液流至接近石英砂面时，立即用一定配比的洗脱液连续洗脱。
（4）收集 保持滴液速度，用自动部分收集器每15ml换管收集。
（5）检测 根据柱中色带和薄层色谱检测馏分的结果，将出现单一斑点，且在同一块薄层板上与标样卵磷脂有同一Rf，值的馏分收集在一起，然后用旋转蒸发器浓缩至膏状，真空干燥，即得到卵磷脂产品。称量，计算得率。
展开剂的配制：氯仿：甲醇：水=65：25：4 比例要严格，否则很容易三相溶剂不完全二而出现分层现象。
常用洗脱液的极性
己烷和石油醚<环己烷<四氯化碳<三氯乙烯<二硫化碳<甲苯<苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<丙醇<乙醇<甲醇<水<吡啶<乙酸
卵磷脂柱层析
甲醇 氯仿 95%乙醇 酸性 中性
氯仿:甲醇 2:1
甲醇的极性大，洗脱能力较强，但是展开效果不理想;氯仿和95%乙醇的洗脱效果和展开效果均不理想;中性的甲醇一氯仿混合液洗脱效果较好，有一定的展开，但组分分离不理想。在甲醇一氯仿混合液加入少量冰醋酸(PH=4)，展开剂为酸性甲醇一氯仿1:2(V/V)时的分离效果最好。
梯度洗脱 氯仿：甲醇(v:v)=10：1到 1：3
磷脂酰胆碱的薄层色谱谱图
标准品的Rf=0.64
1-标准品（sigma 99%） 2-粉末磷脂 3-乙醇提取后的PC 4-柱层析纯化后的PC
德国Lipoid标样
几种展开剂的TLC结果
使用的展开剂: 氯仿：甲醇：水=65：25：4
展开剂为氯仿:甲醇:冰乙酸=24:18:0.04
中间的斑点为SIGMA标样，两侧为纯化后样，只是纯化样的点样量有所不同。可以看到纯化后样分离后得到单个斑点，Rf值与标样相近，此斑点应为PC，且为纯品。
使用的展开剂: 氯仿：甲醇：水=65：25：4
浙公网安备 33021202002483