钾通道在D型钠尿肽抑制胃动力中的作用（可编辑）

钾通道在D型钠尿肽抑制胃动力中的作用（可编辑） 钾通道在D型钠尿肽抑制胃动力中的作用 ? 世界华人消化杂志 2010年1月28日; 183: 217-221wcjd@wjgnet ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R BASIC RESEARCH 基础研究 钾通道在D型钠尿肽抑制胃动力中的作用 闻庆平蔡春玉李萍蔡正旭程雷齐清会郭慧淑 闻庆平李萍蔡正旭程雷齐清会郭慧淑 大连医科大学 ? 背景资料 and in perfusion medium were measured by 附属第一医院中心实验室辽宁省大连市 胃肠动力障碍性 radioimmunoassay. The whole cell patch-clamp 蔡春玉延边大学附属医院内科吉林省延吉市 疾病是常见病, 多 technique was used to record calcium-activated 闻庆平主 任医师主 要从事胃肠动力学方向的研究 发病, 严重影响患 国家自然科学基金资助项目 potassium current I and delayed rectifier KCa 者生活质量, 目前 大连市科学发展计划资助项目 尚无很好的治疗 potassium current I in gastric myocytes iso- KV 作者贡献分布 此文主要由郭慧淑、齐清会及闻庆平参与设 手段. 钠尿肽NP 计、实验、 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 与撰写课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 经费由郭慧淑与齐清会提供研究 lated by collagenase digestion是具有生物活性 经费蔡春玉与李萍承担了大部分实验工作蔡正旭参与部分实 的多聚肽类 , 以 验及数据统计工作程雷主要参与实验协调工作 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 写作由闻 RESULTS: DNP inhibited the spontaneous con- 庆平与郭慧淑完成 激素或神经递质 通讯作者郭慧淑教授辽 宁省大连市中山路号 大 traction of gastric antral circular smooth muscle 形式发挥生理作 连医科大学附属第一医院中心实验室 用. Vuolteenaho等 in a dose-dependent manner. DNP at concentra- 电话 首次在大鼠的胃 tions of 1, 10, 100 and 1 000 nmol/L reduced the 收稿日期修回日期 和小肠内发现了 接受日期在线出版日期 amplitude of the spontaneous contraction by ANP的免疫反应 35% ? 6%, 54% ? 6%, 78% ? 13% and 94% ? 6%, 物质, 为研究NP 与胃肠功能之间 respectively. LY83583, an inhibitor of soluble 的关系拉开了序 Role of potassium channels guanylate cyclase, significantly blocked DNP- 幕. DNP是新发现 in Dendroaspis natriuretic induced relaxation of gastric antral circular 的钠尿肽家族成 smooth muscle reduced amplitude: 42% ? 6% peptide-induced inhibition of 员, 关于其对胃肠 动力方面的研究 vs 60% ? 4%, P 0.05. In contrast, zaprinast, a gastric motility 机制还不甚清楚. cGMP-sensitive phosphodiesterase inhibitor, po- tentiated DNP-induced relaxation of gastric an- Qing-Ping Wen, Chun-Yu Cai, Ping Li, Zheng-Xu Cai, Lei Cheng, Qing-Hui Qi, Hui-Shu Guo tral circular smooth muscle reduced amplitude: 72% ? 7% vs 58% ? 5%, P 0.05. DNP markedly enhanced cGMP levels in gastric antral smooth Qing-Ping Wen, Ping Li, Zheng-Xu Cai, Lei Cheng,Central Laboratory, the First muscle tissue and in perfusion medium. DNP Qing-Hui Qi, Hui-Shu Guo, Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian increased the amplitude of I at 60 mV by KCa 116011, Liaoning Province, China 62.31% ? 3.22%, but decreased the amplitude ofDepartment of Internal Medicine, the Af- Chun-Yu Cai, I at 60 mV by 18% ? 2.3% in gastric antral cir- filiated Hospital of Yanbian University, Yanji 133000, Jilin KV Province, China cular myocytes of guinea pigs National Natural Science Foundation of Supported by: China, Nos. 30800382 and 30572449; and the Scientific CONCLUSION: DNP relaxes the gastric antral Developing Program of Dalian, No. 2008E13SF213 circular smooth muscle of guinea pigs by in- Correspondence to: Professor Hui-Shu Guo, the First Af- filiated Hospital of Dalian Medical University, 222 Zhong- creasing I in a cGMP-dependent pathwayKCa shan Road, Dalian 116011, Liaoning Province, I may play a critical role in regulating resting KV China. guohuishu1@//0>. membrane potential in gastric antral circular 2009-11-15 2009-12-28 Received: Revised: Accepted: 2009-12-29 Published online: 2010-01-28 myocytes of guinea pigsKey Words: Dendroaspis natriuretic peptide; Potas- sium channel; Cyclic guanosine monophosphate; Abstract Gastric motility; Guinea pig AIM: To investigate the role of potassium channels in Dendroaspis natriuretic peptide Wen QP, Cai CY, Li P, Cai ZX, Cheng L, Qi QH, Guo HSDNP-induced relaxation of gastric antral Role of potassium channels in Dendroaspis natriuretic circular smooth muscle of guinea pigs. peptide-induced inhibition of gastric motility. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2010; 183: 217-221 METHODS: The spontaneous contraction of ? 同行评议者 gastric antral circular muscle of guinea pigs was 任超世, 研究员, 摘要 recorded using a four-channel physiograph. The 中国医学科学院 contents of cyclic guanosine monophosphate 目 的 : 探讨钾通道在D 型钠尿肽抑制豚鼠胃窦 生物医学工程研 cGMP in gastric antral smooth muscle tissue 环形肌自发性收缩活动中 的作用. 究所 //.218ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志年月日第卷第期 [2] ? 相关报道 方 法 : 采用四道生理 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 仪记录豚鼠胃窦环 natriuretic peptide, MNP 其主要生理功能是利 K e d i a等发现 , 形肌自发性收缩活动; 应用放射免疫法测定 尿、利钠、舒张血管、降低血压和调节电解质 cGMP参与了CNP [3] 调节人前列腺平 豚鼠胃窦环形肌组织和灌流液中环-磷酸鸟苷 平衡等效应. Vuolteenaho等 首次在大鼠的胃和 滑肌的正常收缩cGMP含量; 运用全细胞模式的膜片钳技术 小肠内发现了ANP的免疫反应物质, 为研究NP Best等报道DNP 记录豚鼠胃窦环形肌上钙敏感钾电流和延迟 通过增加cGMP舒 与胃肠功能之间的关系拉开了序幕. 目前研究 张人动脉和静脉整流型钾电流证实NP受体natriuretic peptide receptor, NPR有 3种, 即NPR-A, NPR-B和NPR-C. 前两者有与鸟 结 果 : DNP抑制豚鼠胃窦环形肌自发性收缩 活动并呈现剂量依赖性. 1、10、100及1 000 苷酸环化酶相结合的结合位 点, 而后者却没有, [5] nmol/L的DNP抑制自发性收缩幅度分别为 NPR-C作为一种清除型受体而发挥作用. Cui等 35%?6%、54%?6%、78%?13%及94%? 在大鼠的胃窦黏膜和平滑肌组织中发现有NPR, 6%. 10 nmol/L鸟苷酸环化酶抑制剂LY83583 Crane等研究发现在大鼠的肠道内也存在着NPR 使收缩幅度抑制减弱42%?6% vs 60%?4%, 后来在家兔的胃肠道内也有NPRA存在. Chijiiwa P 0.05; 而用100 nmol/L的cGMP依赖的磷酸 等通过研究发现ANP能抑制胃平滑肌收缩反应, 脂酶抑制剂Zaparinast使DNP对胃窦环行肌自 ANP对胃肠动力的调节除了受中枢神经系统的 发性收缩的抑制效应增强72%?7% vs 58% 支配外, 还发现豚鼠的胃和小肠能合成通过旁分 ?5%, P 0.05. DNP明显增加豚鼠胃窦环形肌 组织和灌流液中的cGMP水平. 10 nmol/L DNP 泌和自分泌作用于胃肠道抑制胃肠运动. 从我们 [4] 增加豚鼠胃窦环形肌上钙敏感钾电流, 在60 以往的研究 发现CNP抑制豚鼠、大鼠和人胃 mV时增加的幅值为62.31%?3.22%, 抑制延 窦环形肌自发性收缩活动, 其中对人胃窦环形肌 迟整流型钾电流, 在60 mV时抑制幅度为18% 自发性收缩的抑制作用最强而对豚鼠胃窦环形 ?2.3%肌自发性收缩活动抑制作用最弱, 并发现对胃 窦、胃体和胃底部自发性收缩活动 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现出不同 结论: DNP通过增加I 和cGMP途径实现对 KCa 形式. 这表明钠尿肽对胃运动的作用不仅具有种 豚鼠胃窦环形肌的舒张作用. I 不参与此过 KV 程, 但在维持豚鼠胃窦环形肌细胞的静息膜电 属差异而且表现除部位差异. 钾通道在维持细胞 位中起重要作用. 的静息电位中起重要作用, 豚鼠胃窦环形肌上主 要有两种钾通道即I 和I目前对钾通道与 KCa KV 关键词型 钠尿肽钾 通道环 磷 酸鸟苷胃 动力 DNP调节胃动力之间的关系还不非常明确, 并且 豚鼠 cGMP是否参与此过程也不明确. 本研究旨在通 过四道生理记录仪观察DNP对豚鼠胃窦环形肌 闻庆平蔡春玉李萍蔡正旭程雷齐清会郭慧淑钾通道 在型钠尿肽抑制胃动力中的作用 世界华人消化杂志 自发性收缩活动的影响, 用放射免疫技术测定 DNP作用于豚鼠胃窦环形肌时组织和灌流液中 ////. cGMP的含量, 并用全细胞膜片钳技术记录DNP 调节胃动力与钾通道之间的关系, 从而阐述DNP 0 引言 调节胃动力的离子机制. 胃肠动力障碍性疾病, 如功能性消化不良、习惯 1 材料和方法 性便秘、糖尿病性胃轻瘫、手术后肠麻痹、多 器官功能障碍综合征multiple organ dysfunction 1.1 材料 40只EWG/B豚鼠, 雌雄不限, 体质量300 g ?50 g, 由大连医科大学动物中心提供; 用乌拉坦 syndrome, MODS的胃肠麻痹等是常见病, 多发 病, 严重影响患者生活质量, 目前尚且无很好的 50 mg/kg麻醉. 每个实验所用动物均为不同个体治疗手段. 钠尿肽natriuretic peptides, NP是具有 1.2 方法 生物活性的多聚肽类, 以激素或神经递质形式 1.2.1 肌条制备及其收缩活动的记录: 用乌拉坦 [1] 发挥生理作用到目前为止, NP家族包括心房 50 mg/kg麻醉豚鼠后, 沿中线剖腹取胃置于氧 饱和台氏液中, 去掉黏膜层即可见环行肌层, 沿 钠尿肽atrial natriuretic peptide, ANP, 脑钠尿肽 brain natriuretic peptide, BNP, C型钠尿肽C-type 垂直于胃长轴的方向剪取即可得环行肌条约 natriuretic peptide, CNP, D型钠尿肽dendroaspis 2.0 mm×15.0 mm, 沿胃长轴方向剪取则为纵 natriuretic peptide, DNP, VNPventricular 行肌. 取下的肌条放置于容积为2 mL的小槽内, natriuretic peptide, VNP和MNPmicrurus 槽的盖上有一玻璃小钩, 肌条的一端就固定在 //.闻庆平等钾通道在型钠尿肽抑制胃动力中的作用 219 A 100 B 100 图 1 D N P 对 豚 鼠 ? 创新盘点 d 本研究通过四道 胃窦环形肌自发性 80 生理记录仪观察 80 收缩活动的影响DNP对豚鼠胃窦 对 d b 60 环形肌自发性收 60 照组 不同 缩活动的影响 , d 浓度40 用放射免疫技术 40 高一个浓度组测定DNP作用于 20 豚鼠胃窦环形肌 20 时组织和灌流液 0 中cGMP的含量, 1 10 100 1 000 0 并用全细胞膜片 对照组 浓度 钳技术记录DNP 调节胃动力与钾 通道之间的关系, 100 图 2 LY83583 玻璃小钩上而另一端则连于张力换能器上TD- 从而阐述DNP调 对DNP抑制豚 节胃动力的离子 112S, 日本, 换能器与四道生理记录仪进而记录 80 鼠 胃 窦 环 形 机制. 肌条的收缩活动. 置有肌条的小槽始终用氧饱 肌 自 发 性 收 60 缩 活 动 的 影 和台氏液灌流, 通过恒温装置WC/09-05使槽内 a 响温度保持在37.0 ??0.5 ?, 实验开始前肌条至 40 组少需孵育40 min20 1.2.2 cGMP含量测定: 利用放射免疫技术测定组 0 织和灌流液中cGMP含量. 将组织切碎匀浆, 取 DNPDNP+LY 上清液浓缩, 取100 μL的浓缩液作为测定标本[5] 用标记碘125的cGMP标准品100 μL作为对照 准为P 0.05. 不同实验中均是不同个体得出的不 使测定标本与标准品与cGMP特异的抗体抗体 同数据, 并非一个个体上得出多个数据. 相结合. 测定标本与标记的cGMP将与抗体竞争 性结合. 用 γ计数器可以测定碘标记的cGMP与 2 结果 抗体结合的量, 从而间接计算出测定标本与抗 2.1 DNP对豚鼠胃窦环形肌自发性收缩活动的 体结合量进而测定标本中cGMP的含量影响及量效关系 肌条在台氏液中孵 育40 min左 1.2.3 细胞制备及其电生理记录: 用乌拉坦50 右出现稳定的肌条收缩波, 此时观察10 nmol/L mg/kg麻醉动物后, 迅速剪取胃窦部放入氧饱 D N P对豚鼠胃窦环形肌自发性收缩活动的影 和的无钙的PSS缓冲液中漂洗, 然后分离环行肌 响. 给予DNP后自发性收缩明显受到抑制, 不 并将其分割成几个肌条1 mm×4 mm. 将肌条 同剂量的DNP明显抑制, 并呈现剂量依赖关系放入4 ?的K-B液中保存约 15 min, 之后将其放 1、10、100、1 000 nmol/L的DNP抑制自发性 入装有36 ?消化液的试管中进行孵育. 消化液 收缩幅度, 其抑制程度分别为35%?6%, 54%? 是由0.1%的?型胶原酶、0.1%的二硫苏醇糖、 6%, 78%?13%和94%?6%. 其中高浓度即1 000 0.15%的胰蛋白抑制剂和0.2%的牛血清白蛋白 nmol/L的DNP几乎完全抑制自发性收缩活动图 溶入4 mL无钙的PSS缓冲液组成的. 孵育结束, 1A, n 8; 图1B, n 6将消化好的肌条移入4 ? K-B液中保存, 在实 2.2 DNP调节胃动力与cGMP之间关系 为了探讨 验前用管口圆滑的滴管轻轻吹打肌条即可得到 DNP抑制豚鼠胃动力的机制, 预先用10 nmol/L 分离的单细胞. 取1滴细胞悬浮液0.1 mL平铺 的鸟苷酸环化酶抑制剂LY83583处理15 min后,于倒置显微镜?-70 Olympus, Japan镜台上的 DNP对豚鼠胃窦环行肌自发性收缩活动的抑制 灌流槽底部, 待10-15 min细胞沉降至槽底后, 用 效应明显减弱, 由原来单纯给予DNP时抑制60% 等渗溶液进行灌流2-3 mL/min. 然后用电阻为 ?4%减弱到42%?6%图2; 而用100 nmol/L的 2-5 M Ω的玻璃电极进行5-10 G Ω的千兆封接. 钙 cGMP依赖的磷酸脂酶抑制剂Zaparinast预处理 敏感钾电流和延迟整流型钾电流通过Axopatch 15 min后, DNP对胃窦环行肌自发性收缩的抑制 1-D型膜片钳放大器记录. 效应增强, 由单纯给予DNP时抑制58%?5%增 统计学处理 所有统计数据用mean?SD来 强抑制到72%?7%图3. 另外, 用放射免疫技术 表示. 肌肉收缩幅度用SPSS统计, 电流幅值在 直接测定了DNP作用于豚鼠胃窦环形肌时肌组 Clamp Fit10中统计, 实验结果采用同体对照的t 织和灌流液中cGMP的含量, 结果发现其cGMP 检验和组间比较的t检验, 具有显著性差异的标 含量明显增加图//. Contraction amplitude mg Contraction amplitude mg 抑制百分比220ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志年月日第 卷第期 ? 100 图 3 Zapa? 对照组 DNP 10 nmol/L 应用要点 本研究证实, DNP rinast对DNP a 通过增加I 和 KCa 80 抑 制 豚 鼠 胃 cGMP途径实现对 窦 环 形 肌 自 豚鼠胃窦环形肌 60 发 性 收 缩 活 的舒张作用. I 100 mV 1 nA KV 动 的 影 响 不参与此过程, 但 -60 mV 100 ms 40 在维持豚鼠胃窦 组对照组 环形肌细胞的静 b 2.0 20 息膜电位中起重 要作用. 0 b 1.5 DNPDNP+Zap b 1.0 A 4 a d 0.5 3 a 0.0 2 -40 0 4080 Membrane potential mV 1 图 5 DNP对豚鼠胃窦环形肌上钙敏感钾电流的影响 对照组 0 对照组 B 20 mV的阶跃幅度去极化至+100 mV, 持续400 d ms, 电极内液加EGTA 10 mmol/L, 每次去极化 0.8 刺激间隔为10 s的情况下观察10 nmol/L DNP a 对豚鼠胃窦环形肌上I 的影响. 结果显示, 10 KV 0.6 nmol/L的DNP明显抑制I , 在60 mV时抑制幅度 KV 为18%?2.3%图60.4 3 讨论 0.2 在本研究中发现DNP对豚鼠胃窦环形肌自发性 收缩活动有明显的抑制作用, 并呈现剂量依赖 0.0 对照组 关系. 鸟苷酸环化酶抑制剂LY83583明显抑制 图 4 组织及流出液中cGMP含量. 组织中流出液DNP对胃动力的抑制作用而 cGMP敏感的磷酸 组 对照组 酯酶抑制剂Zaparinast却增强DNP对胃动力的抑 制效应. DNP通过增加钙敏感钾电流使细胞超级 2.3 DNP调节胃动力与I 之间关系 为了进一 KCa 化从而实现对胃窦环形肌的舒张作用步探讨DNP抑制胃动力的离子通道机 制, 观察 DNP是从一种美洲蛇毒液中提炼出来的38 了DNP对豚鼠胃窦环形肌上I 的影响. 利用传 KCa 个氨基酸组成的肽类物质, 关于DNP的研究主 [6] [7-8] 统全细胞模式的膜片钳技术, 在电压钳制在-60 要集中在心血管系统Ha等 研究发现DNP通 mV, 阶跃电压刺激从-40 mV开始, 以每20 mV的 过增加Bcl-2实现心肌梗死引起的心肌的损伤, 阶跃幅度去极化至+100 mV, 持续400 ms, 每次 同时他们证明DNP引起心肌细胞的凋亡. 近年 去极化刺激间隔为10 s的情况下观察了DNP对 来对DNP的研究越来越深入, 在胃肠道也发现 [9] 豚鼠胃窦环行肌细胞I 的影响. 10 nmol/L的 KCa 了DNP系统. Kim等 首次报道了DNP与胃肠功 DNP明显增加豚鼠胃窦环行肌I , 在60 mV时 KCa 能之间的关系, 证实DNP系统存在于大鼠的结 增加的幅值为62.31%?3.22%图5 肠, 作为局部调质并调节肠动力. 在我们以往的 2.4 DNP调节胃动力与I 之间的关系 豚鼠胃窦 研究中也发现在豚鼠的胃窦环形肌的黏膜层和 KV 环形肌上除了I 外还有另一种钾通道即I肌层内均有钠尿肽受体存在, 这 也证明了DNP KCa KV 本实验中还观察了DNP对I 的影响. 在电压钳 与胃肠功能有紧密联系. 在本研究中发现DNP KV 制在-60 mV, 阶跃电压刺激从-40 mV开始, 以每 抑制豚鼠胃窦环形肌自发 性收缩活动, 这种抑 //. pmol/g?protein 抑制百分比 pmol/g?protein I/I