第8章放射免疫技术（可编辑）

第8章放射免疫技术（可编辑） 2003年2月 第一节 概述 放射免疫技术是利用放射性核素标记抗原或抗体进行的抗原抗体反应。该技术是将放射性核素探测的灵敏性与抗原抗体结合的特异性相结合，用于微量或超微量生物活性物质(蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物)的定量 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 。 一、 基本类型及原理 放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)是以放射性核素标记的抗原与受检标本中的抗原去竞争结合相应的抗体，从而定量测定受检标本中的抗原，属竞 争性放射免疫技术。 免疫放射分析(immunoradiometricassay，IRMA)以放射性核素标记过量的抗体与待测抗原直接结合后，采用固相的免疫吸附载体分离结合与游离的标记抗 体，从而定量测定受检标本中的抗原，属非竞争性放射免疫技术。 二、常用的放射性核素 主要为131I、125I、14C和3H等。14C和3H释放β射线，需用液体闪烁仪测量，使用受限。125I释放γ射线，合适的半衰期，易于标记且不影响标记物 的活性，易测量。 三、标记物的制备及鉴定 基本原理:放射性 碘通过取代反应置换被标记物中酪氨酸残基或组胺残基 上的氢原子，有直接标记法和间接标记法。 (一)标记方法 1、直接标记法 是将125I直接结合于被标记物的酪氨酸残基或组胺残基上。此法优点是操作简便，它能使较多的125I结合在蛋白质上，故标记物 具有高度比放射性。但此法只能用于标记含酪氨酸残基或组胺残基的化合物。此外，若酪氨酸残基与蛋白质的特异性和生物活性有关，则该活性易因标记而受损 伤。 例:氯胺T直接标记法 氯胺T将125I的I,氧化为I+，I+取代蛋白质酪氨酸苯环的氢，形成二碘酪氨酸。放射性碘标记率的高低与抗原(蛋白质或多肽)分子中酪氨酸的含量及分子中酪氨酸的暴露程度有关，当分子中含有较多的酪氨酸，又暴露在外时，则标记率就高。 2、间接标记法(又称连接法) 是以125I标记在载体上，纯化后再与蛋白质结合。由于操作较复杂，标记蛋白质的比放射性显著低于直接法。但此法可标记缺乏酪氨酸的肽类及某些蛋白质。 (二) 标记物的纯化 标记完后应除去游离125I和其他试剂，纯化方法为葡聚糖凝胶柱层析，逐管收集，用γ计数仪测定每管的放射性强度(脉冲数/min,cpm)，前部为标记抗原峰，后部为游离125I峰。在标记抗原峰试管内加等量1,白蛋白作稳定剂，此即为标记抗原液。 图125I标记物柱层析分离纯化示意图 (三)标记物 的鉴定 1(放射化学纯度 三氯醋酸沉淀法，分别测定沉淀物和上清液的cpm值，被标记物上的放射性占总放射性的百分率 95%，即要求游离碘在总放射性碘的5,以下。标记抗原在贮存过久后，会出现标记物的脱碘，如游离碘超过5,则 应重新纯化去除这部分游离碘。 2(免疫活性 用小量的标记抗原加过量的抗体，反应后分离B和F，分别测定放射性，算出B/T的百分率。此值应在80,以上，该值越大，表示抗 原损伤越少。 3(比放射性 标记抗原必须有足够的比放射性。比放射性或比度是指单位重量抗原的放射强度。标记抗原的比放射性用mCi/mg(或mCi/mmol)表示。比 度越高，测定越敏感。 四、抗血清的鉴定 抗血清质量的指标主要有亲和常数、交叉反应率和滴度。 1(亲和常数(affinityconstant) 2(特异性(交叉反应率) 3(滴度 滴度系指将血清稀释时能与抗原发生反应的最高稀释度。它反映抗血清中有效抗体的浓度。在放射免疫分析中滴度为在无受检抗原存在时，结合50,标记抗原时抗血清的稀释 度。 图抗血清稀释曲线 第二节 放射免疫分析 放射免疫分析是由Yalow和Berson于1960年创建的标记免疫分析技术。由于标记物放射性核素的检测灵敏性，本法的灵敏度高达ng甚至pg水平，本法特 别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。 一、基本原理 放射免疫分析的基本原理是标记抗原(Ag*)和非标记抗原(Ag)对有限量特异性抗体(Ab)的竞争结合反应。 在这一反应系统中，作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的。抗体的量一般取用能结合40,,50,的标记抗原，而受检标本中的非标记抗原是变化的。根据标本中抗原量的不同，得到不同的反应 结果。 当标记抗原、非标记抗原和特异性抗体三者同时存在于一个反应系统时，由于标记抗原和非标记抗原对特异性抗体具有相同的结合力，因此两者相互竞争结合特异性抗体。由于标记抗原与特异性抗体的量是固定的，故标记抗原抗体复 合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变(反比)。非标记抗原量增加，相应地结合较多的抗体，从而抑制标记抗原对抗体的结合，使标记抗原抗体复合物相应减少，游离的标记抗原相应增加，亦即抗原抗体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比。 若将抗原抗体复合物与游离标记抗原分开，分别测定其放射性强度，就可算出结合态的标记抗原(B)与游离态的标记抗原(F)的比值(B/F)，或算出其结合率[B/ B，F ]，这与标本中的抗原量呈函数关系。用一系列不同剂量的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 抗原进行反应，计算相应的B/F，可以绘制出一条剂量反应曲线。受检标本在同样条件下进行测定，计算B/F值，即可在剂量反应曲线 上查出标本中抗原的含量。 二、测定方法 用放射免疫分析进行测定时分三个步骤，即抗原抗体的竞争抑制反应、B和 F的分离及放射性的测量。 (一)抗原抗体反应 将抗原(标准品和受检标本)、标记抗原和抗血清按顺序定量加入小试管中，在一定的温度下进行反应一定时间，使竞争抑制反应达到平衡。 (二) B、F分离技术 在RIA反应中，标记抗原和特异性抗体的含量极微，形成的标记抗原抗体复合物(B)不能自行沉淀，因此需用一种合适的沉淀剂使它彻底沉淀，以完成与游离标记抗原(F)的分离。另外对小分子量的抗原也可采取吸附法使B与F分 离。 1(第二抗体沉淀法 在抗原与特异性抗体反应后加入第二抗体，形成由抗原:第一抗体:第二抗 体组成的双抗体复合物。但因第一抗体浓度甚低，其复合物亦极少，无法进行离心分离，为此在分离时加入一定量的与一抗同种动物的血清或IgG，使之与第二抗体形成可见的沉淀物，与上述抗原的双抗体复合物形成共沉淀。经离心即可使含有结合态抗原(B)的沉淀物沉淀，与上清液中的游离标记抗原(F)分离。 2(聚乙二醇(PEG)沉淀法 3(PR试剂法 4(活性炭吸附法 (三)放射性强度的测定 B、F分离后，即可进行放射性强度测定。测量仪器有两类，液体闪烁计数仪(β射线，如3H、32P、14C等)和晶体闪烁计数仪(γ射线，如125I、131I、 57Cr等)。 计数单位是探测器输出的电脉冲数，单位为cpm(计数/分)，也可用cps(计 数/秒)表示。 每次测定均需作标准曲线图，以标准抗原的不同浓度为横坐标，以在测定中得到的相应放射性强度为纵坐标作图(图16-3)。放射性强度可任选B或F，亦可用计算值B/ B，F 、B/F。标本应作双份测定，取其平均值，在制作的标准曲 线图上查出相应的受检抗原浓度。 图RIA标准曲线 第三节 免疫放射分析 免疫放射分析(IRMA)是在放射免疫分析(RIA)的基础上发展起来的核素标记免疫测定，其特点为用核素标记的过量抗体直接与受检抗原反应，并用固相免疫吸附剂作为B或F的分离手段。 一、基本原理 单位点IRMA的原理。 抗原与过量的标记抗体在液相反应后加入免疫吸附剂(即结合在纤维素粉或其他颗粒载体上的抗原)。游离的标记抗体与免疫吸附剂结合被离心除去，然后 测定上清液的放射性量。 双位点IRMA的原理。 受检抗原与固相抗体结合后，洗涤，加核素标记的抗体，反应后洗涤除去游 离的标记抗体，测量固相上的放射性量。 不论是单位点还是双位点IRMA，最后测得的放射性与受检抗原的量呈正比。 二、IRMA与RIA的异同点 1(标记物在RIA中核素标记抗原，在IRMA中核素标记抗体 2(反应速率 反应速度与反应物的浓度呈正比，在IRMA中标记抗体是过量的，而且不存在竞争性结合复杂的反应，所以反应速度较RIA快。在RIA中抗体量是微量的，所以一定要用高亲和力的多克隆抗体，而在IRMA中应用亲和力较低的单克隆体 也能得到满意的结果。 3(反应模式(原理) RIA为竞争抑制，测得放射性的量与受检抗原呈反比。IRMA为非竞争结合，测得放射性的量与受检抗原成正比。 4(特异性 在双位点IRMA中，一般均应用针对不同位点的单克隆抗体，其交叉反应率低于应用多克隆抗体的 RIA。 5(标准曲线的工作浓度 6(分析误差 RIA中加入的抗体和标记抗原都是定量的，加样误差可严重影响测定结果。IRMA中标记和固相抗体在反应中都是过量的，只有受检标本的加样误差才会影 响分析结果。因此，IRMA的批内和批间变异均比较小。 7(其他 RIA可以测定大分子量与小分子量的物质，双位点IRMA只能测定 在分子上具有2个以上抗原表位的物质。 *临床免疫学与免疫学检验 * 第八章 放射免疫技术 临床免疫学及免 疫学检验 标记抗体 抗原 固相抗原 上清液 沉淀物