引物设计与siRNA

引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 与siRNA 实验六 iRNA干扰 GFP 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达实验 【原理】 RNA 沉默是发生在植物(转录后基因沉默或共抑制)、动物( RNA 干扰， RNAi )和真菌(消除作用)等真核生物细胞中的的特异性和高效率的 mRNA 降解机制。 在哺乳动物细胞中， RNAi 通常用于阻断特定基因的表达从而研究基因的功能。将靶向特定基因的大约 21 碱基长短的双链 siRNAs(small interfering RNAs) ，或者是 45—50-mer 的发夹结构 RNA ( small hairpin RNA, shRNA )转染到细胞。 shRNA 在细胞内会自动被加工成为 siRNA ，从而引发基因沉默或者表达抑制。通过质粒表达 siRNAs 同样可以抑制特定基因的表达。选用 PolIII 启动子启动编码 shRNA(small hairpin RNA) 的序列。 PolIII 启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成 RNA ，遇到 4—5 个连续的 U 即终止，非常精确。当这种带有 PolIII 启动子和 shRNA 编码序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达 siRNA 的质粒确实能够下调特定基因的表达，抑制范围包括外源基因和内源基因。 【试剂与仪器】 1 (小牛血清。 2 (双抗溶液(链霉素 100μg+ 青霉素 100 单位)。 3 ( DMEM 培养基。 4 (转染试剂( LIPOFECTAMINE 2000 )。 5 (细胞培养基( DMEM+10%NCS )。 6 ( PBS 。 7 (无血清培养基。 8 (胰酶( Trypsin )。 9 (培养皿，移液管，量筒，恒温水浴箱，离心机， 15ml 离心管，微量移液器，荧光显微镜，连续光谱荧光酶标仪。 【操作步骤】 1. 寡核苷酸单链的设计及合成 采用 Ambion 公司的 siRNA Target Finder ( online target finder )进行 siRNA 的设计( )，公司合成。 siRNA Target Sequence ONE: 5 '- AAGGTGATGCTACATACGGAA -3 ' Sense siRNA strand: 5 '- GGUGAUGCUACAUACGGAAtt -3' Antisense siRNA strand: 3' - UUCCGUAUGUAGCAUCACCtt -5' Position in gene sequence (cDNA): 104 Top Strand Oligonucleotide Template: (59mer) 5'- C GGTGATGCTACATACGGAA TTCAAGAGA TTCCGTATGTAGCATCACC TT TTTTGGTAC -3' Bottom Strand Oligonucleotide Template: (59mer) 5'- AAGGTGATGCTACATACGGAA TTCCGTATGTAGCATCACC -3' CAAAA TCTCTTGAA GGGCC 2 ( shDNA 的退火 用无核酶水稀释合成的单链寡核苷酸至 200μmol/L 反应体系组成: Top strand DNA oligo ( R ) ( 200μmol/L ) 5μl Bottom strand DNA oligo ( F ) (200μmol/L ) 5μl 10×Oligo Annealing Buffer 2μl DNase/RNase free water 8μl Total volume 20μl 程序退火 95? 4min 变性 90? 、 80? 、 70? 、 60? 、 50? 、 40? 、 30? 、 20? 、 10? 每 10 度递减，依次反应 3min 4? 10min -20? 保存 取 1μl 产物 2% 琼脂糖凝胶电泳，鉴定退火程度。 3 ( U6- shDNA 质粒构建 用 ApaI 和 KpnI 双酶切含人源 U6 启动子的质粒，回收线性质粒 (参见实验一步骤 9 )。 用连接酶将步骤 2 退火片段与线性的载体连接。 在 0.2ml 或 0.5ml 反应管中加入下列成分 线性载体 50ng shDNA 100ng T4 连接酶 2-3weiss units 10× 连接缓冲液 1μl 补超纯水至总体积为 10μl ，常温下放置 30 分钟以上;也可以 16? 或 4? 过夜。 4 (转化细菌筛选阳性重组子(参见实验四)。 5 (扩增含阳性重组子的细菌，提取质粒，备用。 6 (转染细胞(参见实验五)。 7 (荧光显微镜观察 GFP 的表达变化，用荧光酶标仪测荧光强度的变化。 引物设计有3 条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能 在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应(即错配)。 引物设计应注意如下要点: 1 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74?，不适于Taq DNA 聚合酶进行 反应。 2 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如 GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。 3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配 效率明显高于其他 3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’ 端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 4 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72?左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ，如按公式Tm,4(G+C)，2(A+T)，在Oligo 软 件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6 ?G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端?G 值较低(绝对值不超过9)， 而5’端和中间?G 值相对较高的引物。引物的3’端的?G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。 7 引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行 [8]。 8 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 1 中国美术学院(中国唯一国家级重点学科所在地,美术学,设计学博士点所在地.联合国承认学历的中国唯一美术类大学.属文化部和浙江省共同直 属,教学评估优秀学校) 2 中央美术学院(美术学,设计学博士点所在地.教育部直属大学.教学评估优秀学校) 3 西安美术学院(美术学博士点所在地,陕西省直属.还未教学评估) 4 天津美术学院(天津市直属,教学评估优秀) 5 鲁迅美术学院(辽宁省直属,未教学评估) 6 广州美术学院(广东省直属,未教学评估) 7 湖北美术学院(湖北省直属,教学评估良好) 8 四川美术学院(重庆市直属,教学评估不合格) 附:(中国美术考生心中美术大学排名) 1中央美术学院(油画强,造型学科厉害) 2中国美术学院(国画强,雕塑强.考生多,学校漂亮) 3鲁迅美术学院(素描等造型专业比较牛) 4四川美术学院(油画强,特别罗中立比较有名) ) 5天津美术学院(无评论 6广州美术学院(设计强) 7西安美术学院(无评论) 8湖北美术学院(无评论