siRNA干扰LOXL2基因在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的相关性研究

王 猛，王 品，黄 谦，沈 剑，曾佳佳，蒋涛涛

（深圳市龙华区人民医院 1.烧伤整形外科；2.超声影像科；3.产科 广东 深圳 518109）

瘢痕疙瘩（Keloid）是整形外科研究的难题之一，它是一种皮肤纤维化疾病，被认为是皮肤的良性肿瘤[1]。该病的特征是瘢痕超出最初损伤边缘呈浸润性生长[2]，且无自行消退倾向。瘢痕疙瘩不仅影响美观，还能引起疼痛、瘙痒等伴随症状，若发生在关节部位还有可能影响关节功能，造成患者终生的痛苦。瘢痕疙瘩目前多采用瘢痕疙瘩内药物注射、外科手术、局部放疗、加压疗法等多种治疗 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 相结合来治疗，但疗效大都不尽如人意，因此该疾病的治疗仍是一个世界性难题[3-8]。赖氨酰氧化酶样蛋白2（Lysyl oxidase like 2，LOXL2）属于赖氨酸氧化酶（LOX）家族，LOXL2基因定位于人类染色体8p21.3，编码蛋白质含744个氨基酸残基，分子质量约87kD，可激活胶原蛋白和弹力蛋白的赖氨酸残基，引起胶原蛋白和弹力蛋白的交联，还可通过细胞外基质调控肿瘤细胞生长增殖。此外，张浩[9]等研究发现，LOXL2可能在增生性瘢痕发病中发挥重要作用，是一个新的潜在的治疗靶点。因此，本研究欲探索抑制LOXL2 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达对瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFs）增殖、凋亡、侵袭、迁移的影响，以期为防治病理性瘢痕提供科学的理论导向。

1 资料和 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载

1.1 正常皮肤离体标本10例：取皮肤外科修整“猫耳”切除术中切除的正常皮肤组织作为立体标本。

入选标准：①性别不限；②年龄18～60岁；③排除重大系统疾患；④组织标本采集前获得所有患者的知情同意，患者在手术 协议书 婚内约定的财产协议书家庭养老协议书pdf意向性划转协议书商业银行关联方授信摔伤一次性补偿协议书 上签字同意手术；⑤研究得到医院医学伦理委员会的批准。

1.2 瘢痕疙瘩标本10例：取自2017年01月-2020年01月深圳市龙华区人民医院整形外科门诊及住院手术患者经手术切除的瘢痕组织作为离体标本。

入选标准：①参考2018年的《中国瘢痕疙瘩临床治疗推荐 指南 验证指南下载验证指南下载验证指南下载星度指南下载审查指南PDF 》，符合瘢痕疙瘩的诊断标准[10]；②瘢痕边缘呈“蟹足状”样突起，质地坚硬；病理组织学检查证实所取瘢痕疙瘩组织内有胶原及基质成分的大量沉积，成纤维细胞很多，并有分裂像；皮损处无感染病灶；病程大于1年且无自愈倾向、无自行消退；③皮损处未接受过任何药物、放射、激光等治疗；④排除其他重大系统性疾病；⑤年龄18～60岁，性别不限；⑥研究得到本院医学伦理委员会的批准。瘢痕疙瘩基线资料见表1。

表1 基线资料表

1.3 试剂：DEME培养基、胎牛血清和PBS(美国Gibco公司)；CCK-8试剂(上海东仁化学科技有限公司)；cDNA反转录试剂盒(美国Invitrogen公司)；Annexin V-FITC/PI试剂盒(大连 Meilunbio生物技术有限公司)；DKK3、CAPDH一抗和HRP羊抗兔二抗(美国Abcam公司)；Lipofectamine2000转染试剂盒(Invitrogen 公司)；PCR引物、小干扰RNA（Small interfering RNA,siRNA）由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 瘢痕疙瘩成纤维细胞（KFs）及正常皮肤成纤维细胞（NFs）的获取和培养：将收集的瘢痕疙瘩组织及正常皮肤组织块放置于培养皿中，用含青、链霉素（1 000 U/ml）的无菌PBS反复漂洗至无血色；无菌眼科剪去除表皮、结缔组织和血管，用眼科剪反复剪切成1～3 mm2的小碎块，并分散接种于经FBS润湿的5 cm×5 cm细胞培养瓶中；倒置培养瓶并加1 ml 50% FBS完全培养基，置于37℃，5% CO2的恒温培养箱内培养；8～12 h后翻转培养瓶；继续培养至镜下可见长梭形的细胞爬出（约3～5 d），每隔2～3 d更换一次50% FBS完全培养基；待原代细胞爬满大部分培养瓶底时，敲除组织块；PBS洗涤2遍，更换一次50% FBS完全培养基，继续培养。待原代培养的细胞生长至单层时加入2.5 g/L胰蛋白酶消化，继续传代培养。选取第4～6代的成纤维细胞进行后续实验。

1.5 qRT-PCR检测KFs及NFs中的LOXL2 mRNA的表达：取冻存正常皮肤和瘢痕疙瘩组织置于预冷研钵，加液氮后研磨至粉末，移入匀浆器中。Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA，以GAPDH为内参进行qRT-PCR。LOXL2引物序列：上游（F），5’-GTGGATCTGGCACGACTGTCA-3’；下游（R），5’-TTGAGCTTCAGCAGGTCATAGTGG-3’。GAPDH引物序列：上游（F），CCCTTCATTGACCTCAACTACAR；下游（R），5’-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。根据试剂盒及仪器使用说明书，设置实验程序反应温度及时间。PCR反应条件：预变性95℃ 2 min，95℃ 10 s，退火60℃ 1 min，延伸70℃，40个循环，4℃保存。反应结束后确认qPCR的扩增曲线和融解曲线，并按照2-△△t方法进行运算，从而得出相应的结论。

1.6 细胞转染：取第4～6代的瘢痕疙瘩成纤维细胞后，分为3组（KF组、si-NC、si-LOXL2），使用Primer Premier 6.0设计LOXL2特异性小的干扰RNA。si-LOXL2组RNA序列，5'-CAGUCUAUUAUAGUCACAU-3'；si-NC组（阴性对照组）RNA序列，5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'。上海吉玛制药技术有限公司采用脂质体介导法合成，使用LipofectamineTM2000按照说明书将脂质体分别转染三组瘢痕疙瘩成纤维细胞中，详细步骤见说明书。

1.7 Western Blot检测3组相关蛋白表达情况：提取样本总蛋白，进行蛋白定量后，各取50μg蛋白样本上样，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜，将其放入TBST配制的5%脱脂奶粉中封闭1 h。一抗孵育：取下PVDF膜用PBST漂洗1次，再小心把一抗稀释（按说明书配制通常为，抗体:稀释液=1:5 000）滴入孵育膜中，4℃摇床过夜。二抗孵育：使用二抗稀释液（按说明书配制通常为，抗体:稀释液=1:5 000），滴入PBST洗涤3次的PVDF，孵育，室温摇床1 h，取膜置于PBST洗涤3次，每次10 min，再转入干净PBST中。显影：在暗室中，使用ECL化学发光法，按照试剂盒说明书进行显影，用化学发光凝胶成像仪采集，显影所得条带用Image J软件进行灰度值扫描分析。

1.8 CCK-8检测KFs组，LOXL2阴性对照组（si-NC），LOXL2抑制表达组（si-LOXL2）的细胞增殖能力：分别取转染0、24、48、72 h的3组实验细胞，调整细胞浓度为4×104个/毫升，接种于96孔板，每组设3个复孔。37℃培养48 h后，加入10μL的CCK-8试剂，酶标仪检测测定450 nm波长各孔的吸光度值，取均值绘制生长曲线。

1.9 Annexin V-FITC/PI双染法检测3组瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡情况：取对数生长周期的3组细胞培养24 h。调整细胞密度为每毫升1×105，PBS洗涤2次，加入100 μl Binding Buffer和10 μl FITC标记的Annexin-V，室温避光30 min，再加入5 μl PI，避光反映5 min后，加入400 μl Binding Buffer，试剂分别加入离心管中重悬细胞，要求细胞数达到1×106细胞/毫升；上机定量检测。结果计算方法：细胞凋亡率=(凋亡细胞数量/正常细胞数量)×100%。

1.10 TransweⅡ细胞侵袭实验：在无菌条件下冰浴融化Matrigel，用PBS稀释成1 mg/ml，-20℃冻存备用。取出已经稀释好的Matrigel，冰浴融化，以50 ml的体积铺于TramweⅡ小室（24孔板），37℃放置1 h，使Matrigel聚合成凝胶。每孔加入200 μl 1640培养基使凝胶重构。在Transwell下室中加入趋化因子。在上室孔中准确加入细胞1×105个/孔，KFs组，LOXL2阴性对照组（si-NC），LOXL2抑制表达组（si-LOXL2）后，对数生长期细胞制备悬液后取200 μl，培养48 h。培养时间结束后，弃去上室液体，小心取出上室，用湿棉签擦去膜上微穿过膜的细胞。4%中性甲醛固定10 min，Giemsa染色10 min，PBS洗涤3次，干燥，取下微孔滤膜，倒置显微镜下直接观察穿过膜的细胞

1.11 统计学分析：应用SPSS 26.0分析，采用两独立样本t检验，多组采用单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准P＜0.05。

2 结果

2.1 KFs和NFs中LOXL2 mRNA的表达：运用qRT-PCR检测两组组织中LOXL2 mRNA相对表达水平，分别为1.002±0.158 vs 0.465±0.104，差异具有统计学意义（P＜0.01），见图1。

图1 KFs和NFs中LOXL2 mRNA的表达

2.2 KFs组，LOXL2阴性对照组（si-NC），LOXL2抑制表达组（si-LOXL2）成纤维细胞相关蛋白表达情况：运用Western Blot检测三组LOXL2蛋白含量，si-LOXL2组对比其他两组，LOXL2蛋白表达明显下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图2 三组瘢痕成纤维细胞的LOXL2蛋白含量

2.3 KFs组，LOXL2阴性对照组（si-NC），LOXL2抑制表达组（si-LOXL2）细胞增殖情况：通过CCK-8实验结果显示，接种24 h后各组成纤维细胞增殖能力无明显差异，无统计学意义（P＞0.05）；48 h时后KFs组与si-NC组成纤维细胞增殖活性逐渐增高，差异具有统计学差异（P＜0.05）；si-LOXL2组在48 h及72 h时生长速度低于其他组，降低程度与si-NC组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示抑制LOXL2基因表达能抑制成纤维细胞增殖，见表2，图3。

表2 三组瘢痕成纤维细胞不同时段的OD值 （±s）

表2 三组瘢痕成纤维细胞不同时段的OD值 （±s）

组别 时间 0 h 24 h 48 h 72 h KFs组 0.490±0.021 0.530±0.014 0.791±0.020 1.130±0.125 si-NC组 0.496±0.023 0.535±0.024 0.790±0.030 1.248±0.015 si-LOXL2组 0.493±0.025 0.550±0.023 0.520±0.021 0.435±0.016

图3 三组瘢痕成纤维细胞不同时段OD值

2.4 KFs组，LOXL2阴性对照组（si-NC），LOXL2抑制表达组（si-LOXL2）细胞凋亡情况：运用流式细胞仪检测，KFs组与si-NC组细胞凋亡未见明显差异，无统计学意义（P＞0.05）。si-LOXL2组相对其他两组细胞凋亡明显增加，发现凋亡程度与si-NC组相比差异有统计学意义（P＜0.05），特别是细胞早期凋亡，提示抑制LOXL2可以促进瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡，见图4。

图4 三组瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡情况

2.5 si-RNA对瘢痕疙瘩成纤维细胞侵袭的影响：通过TransweⅡ小室检测三实验组细胞，si-NC组与KFs组细胞转移到小室下壁的细胞数目无明显差别，无统计学意义（P＞0.05），而si-LOXL2组细胞数明显减少，抑制LOXL2可明显降低KF细胞侵袭性，与si-NC组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），见图5。

图5 三组瘢痕疙瘩成纤维细胞侵袭性情况

3 讨论

瘢痕疙瘩是一种皮肤纤维增生性疾病，其病理特征主要是皮肤受损后成纤维细胞大量增殖，以及以胶原纤维为主的细胞外基质过度增生和沉积[11-12]，较少自行消退，多数将伴随着患者的一生。学者认为瘢痕疙瘩形成与肿瘤相关基因的遗传和表观遗传改变有关。因此寻找瘢痕疙瘩的相关调控基因已成为当前瘢痕研究的热点之一。然而，瘢痕疙瘩的具体发病机制尚未完全了解[13]。近些年来，研究者发现瘢痕疙瘩中成纤维细胞的过度增殖和胶原的堆积沉淀可能与某些原癌基因和抑癌基因的突变有关[14-15]。

赖氨酰氧化酶样2（LOXL2），一种促进细胞外间质胶原纤维网络的酶。通过细胞外基质调控肿瘤细胞生长增殖，在多种肿瘤中高表达[16-20]，抑制LOXL2可以促进癌细胞凋亡，抑制侵袭等相关生物特性。Puente[21]等人发现LOXL2抑制剂能减少瘢痕疙瘩成纤维细胞数量、增殖、集落形成和细胞生长，并能诱导细胞周期阻滞和增加细胞凋亡。Matsuo[22]等人发现抑制LOXL2表达可以抑制转化生长因子-β1诱导的肌成纤维细胞前体标志物的表达、原肌成纤维细胞的出现以及肺成纤维细胞分化成肌成纤维细胞的进化.Mohseni[23]通过靶向赖氨酰氧化酶（LOX）发现可以减缓肝纤维化进程，考虑其抑制转化生长因子-β1通路从而抑制成纤维细胞增值及炎症介质产生。另有研究者发现抑制LOXL2不仅仅能抑制细胞纤维化，还能作用于加速胶原降解，促进MMPs分泌[24]。Wu[25]在肝细胞癌体外实验中发现上调LOXL2表达能激活了JNK/c-JUN信号通路影响纤连蛋白产生、MMP9的表达、细胞粘附等，从而影响细胞外基质合成。因此，LOXL2在创伤愈合[26]、器官纤维化[27]、肿瘤侵袭[28]等过程中发挥重要作用。

本研究中发现LOXL2基因在瘢痕疙瘩中高表达。研究发现其一方面可能通过激活了JNK/c-JUN信号通路影响纤连蛋白生成、MMP、细胞黏附等，从而影响细胞外基质合成，促进瘢痕疙瘩发生发展，而另一方面可能间接激活TGF-β通路促进成纤维细胞的增殖，诱导合成以胶原蛋白为主的细胞外基质的过度沉积，形成瘢痕疙瘩[29]。此次研究通过抑制LOXL2转录发现可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、侵袭，促进凋亡等相关生物特性。提示LOXL2可能是一个新的潜在的治疗靶点。然而，关于LOXL2在瘢痕成纤维细胞中具体介导了哪些信号通路还有待深入研究。

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