VSV病毒扩增与标定

VSV病毒扩增与标定 50,组织细胞感染量(TCID50)试验 指能使半数单层细胞管(孔)出现细胞病变的病毒稀释度。此法估计病毒感染性的强弱和含量，不能准确测定感染性病毒颗粒的多少。 1(待测病毒液按10倍系列稀释法稀释 2(各稀释度的病毒接种于形成单层的细胞瓶或培养板(每稀释度接种几 瓶)。 (将细胞瓶或培养板置于温箱37?培养数日。 3 4(观察CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按 Reed Muench 法计算出该病毒液的TCID50效价。 例如使50%细胞管出现病变的病毒稀释度在10-4~10-5之间，其中间距离比例按下式计算: 中间距离,高于50,的病变率(按瓶计),50/高于50,的病变率,低于50,的病变率。 假定中间距离为0.5。故能使50%细胞管发生病变的病毒稀释度为10-4.5，即TCID50为 104.5倍，当病毒悬液做104.5倍稀释时，0.1ml中含1个TCID50。 50-100T CID50的VSV 就是发生的病变时的的VSV稀释浓度的倍数。 2.1 材料与仪器 2.1.1 实验材料 Eagle’s 最低限度培养基(MEM):MEM 粉末(Gibco 公司产品，1L 装)溶 于1L 双蒸水，0.22µm 微孔膜过滤除菌，分装，37?无菌检验一周后，置于4?保存。使用前加入经56?水浴灭活30min 的新生小牛血清(四季青生物工程材料有限公司产品)，双抗(青霉素和链霉素各250 单位/mL)，用NaHCO3 调pH至7.2~7.4。 1%维尔烯(Versene):EDTA 10.0g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.15g， NaH2PO4 0.2g，葡萄糖0.2g，加去离子水至1000mL，pH7.4。 细胞消化液:1%胰酶(Difco)5mL，1%维尔烯(Versene)2mL，用不含钙 和镁的PBS(pH=7.2)定容至100mL。Difco 和Versene 的最终浓度分别为0.05% 和0.02%，用无菌膜过滤除菌后备用。 结晶紫染液:结晶紫0.5%(w/v)，NaCl 0.85%(w/v)，乙醇50%(v/v)， 甲醛3%(v/v)，蒸馏水47%(v/v)。 脱色液:乙二醇甲醚(Ethylene Glycol Monomethyl Ether)50%，蒸馏水50%。2.1.2 实验仪器 酶标仪MR550 型:美国Bio-Rad 公司产品; 倒置显微镜IMT-2 型:日本Olympus 公司产品。 2.1.3 测定细胞与攻击病毒 人羊膜细胞(WISH)株和水泡性口炎病毒(VSV)株:由上海第二军医大 学惠赠。 2.1.4 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品 干扰素α 标准品(Lot 03/94，效价12,000 IU/mL)100 倍稀释分装:由上海 第二军医大学惠赠 2.2 实验方法 2.2.1 Wish 细胞的培养 取出保存于-80?的Wish 细胞株，37?水浴解冻后，1000r/min 离心5min， 弃上清;沉淀用含10%小牛血清的MEM 培养液悬浮，移至细胞培养瓶，加入适量培养液置于含5,CO2 的37?培养箱内，出现均匀的单层细胞，每2~3 天传代一次，实验时取对数生长期细胞。 2.2.2 VSV 的扩增与保存[80] 用含10%小牛血清的MEM 培养液按1:200 稀释VSV，接种于生长良好的单 层Wish 细胞中进行增殖，孵育至细胞病变达75%~100%时，即可冻存于-20?以下。次日取出，反复冻融2~3 次，再用巴氏管吹打，3000r/min 离心20min，收集上清。根据每次用量分装，冻存于-80?以下，毒种应冻存于液氮中。 VSV 容易在生长繁殖中产生各种变异株，其中最重要的是一种所谓“缺陷型 干扰颗粒”(Defective Interfering Particles，DI)变异株。DI 颗粒是一种比正常 VSV 病毒小得多的不完全的病毒体，所含RNA 较小，缺少转录酶活性，所以 DI 颗粒感染细胞后单独不能增殖，必须与野生株一起才能增殖。。但是，DI 颗粒与野生株一起增殖时，又会“竞争性”地抑制后者，并因此出现“自身干扰现象”。另外，这种DI 颗粒还可导致“超敏感细胞”，形成“持续感染状态”，这种处于持续感染状态的细胞对野生病毒攻击有抵抗力。当用VSV 的野生株以高“感染复数”(MOI，即低浓度稀释)进行连续传代时，即可产生大量的DI 颗粒，并因而使病毒滴度急骤下降。。防止DI 颗粒形成的措施是:首先应以低“感染复数”传代，其次应尽可能减少传代次数。因此，为防止产生DI 颗粒，每次扩增的量至少应够用6 个月以上 2.2.3 VSV 效价的滴定[81] 每次VSV 扩增之后，应进行VSV 效价滴定，以确定本批次病毒的活性并计 算TCID50。 将生长良好的单层Wish 细胞用细胞消化液将其消化下来，再用含10,灭活 新生小牛血清的MEM 培养液配成细胞浓度约3×104 个/mL 的悬液，96 孔细胞培养板上每孔加入细胞悬液100µL(约300-500 个细胞/孔)，置37?孵育至生成均匀的细胞单层。用含5,灭活新生小牛血清的MEM 培养液将病毒作连续10 倍稀释(如10-1-10-10)，每个稀释度作6 个重复。弃去培养板中上清，每孔加入病毒稀释液100µL。细胞对照孔加入100µL 含5,灭活新生小牛血清的MEM 培养液。置37?孵育，以24h 时微量板孔中半数出现细胞病变现象的稀释度为1个TCID50，此稀释度的倒数乘以10 倍作为病毒效价(TCID50/mL) 在VSV 使用前应先按照病毒效价进行稀释，用于攻击的病毒每孔效价应该 维持在100-300 个TCID50/mL。 2.2.4 微量CPE 测定法[82] 按《中国生物制品规程》(一部)中 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 采用Wish 细胞,VSV 体系测定， 根据干扰素对Wish 细胞的保护性，即细胞的病变程度按5 级打分法记录不同浓度时的保护性(用国家标准品(Lot 03/94)为参考标定其IU 值。 2.2.5 结晶紫染色测定法[83] 结晶紫染色测定法基于结晶紫染液可通过细胞的特定摄生法而选择性地被 细胞核吸收，死亡的细胞几乎不吸收，这样结晶紫染料的吸收量与活细胞数成正比，而被核(DNA)吸收的结晶紫又可为有机溶媒提取，所以可根据提取液颜色深浅来判断活细胞的多少，即通过测定提取液的光密度值(OD)来确定活细胞的数量[4]。 将生长良好的单层Wish 细胞用含10,小牛血清的MEM 培养液配成细胞浓 度约5×105 个/mL 的悬液，加到96 孔细胞培养板上，75µL/孔。培养2~4h 后， 每孔加入4 或5 倍梯次稀释的干扰素样品75µL，样品稀释用含8,小牛血清的 MEM 培养液，每个样品4-6 个平行孔，阴性(即细胞对照)和阳性(即病毒对照)对照孔均不加干扰素，每孔加入75µL 含8,小牛血清MEM 培养基。 培养 20~24h 后，弃上清，用含4,小牛血清MEM 培养基稀释的VSV 病毒攻击， 100µL(200TCID50)/孔，阴性对照孔加入100µL/孔含4,小牛血清MEM 培养基。 然后于含5,CO2 的37?孵箱中培养至所有阳性对照孔病变达到3 级以上，弃上清，每孔加入40µL 结晶紫染液，室温染色20min，弃掉染液，用自来水冲残余的染液，吸干后，每孔加入100µL 的脱色液脱色，测定每孔A550 值。 2.2.6 干扰素效价的计算方法[81] 本实验引进病毒滴度测定的Reed-Muench 法计算干扰素效价(U/mL)，再以 干扰素标准品为参考，校正待测品的效价(IU/mL)。国际上最常采用的判定干扰素活性的方法是在标本的梯次稀释度中，仍能保护半数细胞免受攻击病毒损害的最高稀释度的倒数即为干扰素的效价。该方法的步骤为: ? 根据ELISA 测定550nm 吸收值进行计算 [OD]保护,[OD]实测,[OD]病毒对照 [OD]破坏,[OD]细胞对照,[OD]实测; ? 累积和计算保护百分比; ? 用插入公式计算IFN 效价 ? 按平行操作和同法计算的标准IFN 活性效价的标定值进行工作单位修正