孕激素在子痫前期发病机理TLR4信号通路中作用研究（可编辑）

孕激素在子痫前期发病机理TLR4信号通路中作用研究（可编辑） 分类号学号 M200975300 学校代码 10487密级硕 硕 硕 硕士 士 士 士学 学 学 学位 位 位 位论 论 论 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 文 文 文孕 孕 孕 孕激 激 激 激素 素 素 素在 在 在 在子 子 子 子痫 痫 痫 痫前 前 前 前期 期 期 期发 发 发 发病 病 病 病机 机 机 机理 理 理 理 TTTTLLLLRRRR4444 信 信 信 信号 号 号 号通 通 通 通路 路 路 路中 中 中 中的 的 的 的作 作 作 作用 用 用 用研 研 研 研究 究 究 究 学位申请人: 吴 敏 学科专业: 妇产科学 指导教师: 吴超英 副教授 答辩日期: 2012 年 4 月A Dissertation Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of medicine The role of progesterone in the TLR4 signaling pathway of the pathogenesis of pre-eclampsia Candidate : Wu Min Major: Obstetrics and Gynecology Supervisor : A. P. Wu ChaoyingHuazhong University of Science and Technology Wuhan, Hubei 430074, P. R. China April, 2012 独 独创 创性 性声 声明 明 独 独创 创性 性声 声明 明 本人郑重声明,本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果的总结。尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体,均已在文 中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。 学位论文作者签名: 日期:年 月 日 学 学 学 学位 位 位 位论 论 论 论文 文 文 文版 版 版 版权 权 权 权使 使 使 使用 用 用 用授 授 授 授权 权 权 权书 书 书 书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本 人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索, 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密?,在_____年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密?。 (请在以上方框内打“?” ) 学位论文作者签名: 指导教师签名:日期: 年 月 日 日期: 年 月日目 目 目 目 录 录 录 录 中 中英 英文 文缩 缩略 略词 词表 表 11中 中英 英文 文缩 缩略 略词 词表 表 11中 中 中 中文 文 文 文摘 摘 摘 摘要 要 要 要. 2222 AAAAbbbbssssttttrrrraaaacccctttt. 4444 正 正 文 文 正 正 文 文 前 言. 6 材料与 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 7 实验结果„.22讨 论.26 参考文献. 29 综 综 综 综 述 述 述 述. 33332222 致 致 谢 谢3388致 致 谢 谢3388华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 中 中英 英文 文缩 缩略 略词 词表 表中 中英 英文 文缩 缩 略 略词 词表 表英 英 英 英文 文 文 文缩 缩 缩 缩写 写 写 写英 英 英 英文 文 文 文全 全 全 全称 称 称 称 中 中 中 中文 文 文 文全 全 全 全称 称 称 称 cDNAComplementary deoxyribonucleic acid 互补脱氧核糖核酸 DEPCdiethyl pryocarbonate 焦炭酸二乙酯 ELISA Enzyme linked immunosorbent assay酶联免疫吸附测定 IL-6 interleukin-6 白介素-6 MyD88 myeloid differentiation factor 88髓样细胞分化因子 88 mRNA Messenger ribonucleic acid 信使核糖核酸 NF-kappaB nuclear factor kB,NF-kB核转录因子- kB PAMP Pathogen-associated molecule pattern 病原相关分子模式 PBS Phosphate balanced solution 磷酸盐缓冲液 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应 PRR Pattern recognition receptor 模式识别受体 PE Preeclampsia 子痫前期Real time-PCR Reverse transcription polymerase 实时定量逆转录聚合酶 Chain reaction 链技术 PBMC peripheral blood mononuclear cell 外周血单个核细胞 SAH Subarachnoid Hemorrhage 蛛网膜下腔出血 TLR4Toll like receptor 4 Toll 样受体 4 TLRs Toll-like receptorsToll 样受体 TNF-α Tumor necrosis factor-alpha 肿瘤坏死因子 Western Blot Alternatively, protein immunoblot 免疫印迹法 1 华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 孕 孕激 激素 素在 在子 子痫 痫前 前期 期发 发病 病机 机理 理 TLR4 信 信号 号通 通路 路中 中的 的作 作用 用研 研究 究 孕 孕激 激素 素在 在子 子痫 痫前 前期 期发 发病 病机 机理 理 信 信号 号通 通路 路中 中的 的作 作用 用研 研究 究硕士研究生:吴敏 指导老师: 吴超英 副教授 中 中 中 中文 文 文 文摘 摘 摘 摘要 要 要 要 目 目 目 目的 的 的 的:研究孕激素在子痫前期(preeclampsia,PE)孕妇外周血血浆中的水平及 其在子痫前期发病 机制 综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图 Toll 样受体 4(toll-like receptor4,TLR4)信号通路 中的作用。 方 方 方 方法 法 法 法:选择 30 例子痫前期孕妇,年龄:28? 5 岁,孕周 34.1?4.1 周,用稀释定 量法测定其血浆孕激素水平,并与正常孕妇对照;原代培养子痫前期孕妇外周血 单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),以不同浓度孕激素(0M、 -8 -6 -4 10 M、10 M、10 M)刺激,实时定量聚合酶联反应(Real-time polymerase Chain reaction,real-time PCR)检测 TLR4mRNA、髓样细胞分化蛋白 88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)mRNA、核转录因子-kappaBnuclear factor kB,NF-kB mRNA的表达;免疫印迹法 Western blot 检测 Ikappa-B蛋白的表达, 用酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测细胞上 清液中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factors,TNF-α)及白介素-6(interleukin-6 , IL-6)的表达。 结 结果 果:子痫前期孕妇血浆孕激素水平为:376.524nmol/L?145.89nmol/L,正常孕 结 结果 果 妇血浆孕激素水平为:438.007nmol/L?148.124nmol/L,两组比较差异有显著性, P0.05。随着孕激素浓度的增加,TLR4mRNA、MyD88mRNA及 NF-κBmRNA -?CT 的相对表达量(2 )逐渐减少,其相对表达量分别为:TLR4mRNA:空白组: -8 -6 -4 1.462?1.102, 10 M组: 1.260?0.413, 10 M组: 0.852?0.218, 10 M组: 0.584?0.029; -8 -6 MyD88mRNA:空白组: 1.052?0.269, 10 M 组: 0.705?0.037, 10 M 组: -4 -8 0.2944?0.019, 10 M 组: 0.097?0.011; NF-κBmRNA:空白组: 2.341?0.326,10 M -6 -4 组:1.045?0.393, 10 M 组:0.0212?0.008, 10 M 组:0.006?0.0013,各组间的差 异均有统计学意义且 p0.05, IkappaB蛋白的表达随着孕激素浓度的增加而升高, -8 -6 其 OD 比值为:空白组: 0.187?0.015, 10 M 组: 0.777?0.047,10 M 组: 2 华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 -4 1.42?0.092,10 M 组:2.3?0.243,且各组间比较差异有统计学意义:P0.05;随 着孕激素浓度的增加,细胞上清中细胞因子 TNF-α(空白组:5.733 pg/ml?0.208 -8 -6 pg/ml,10 M 组:3.100 pg/ml?0.201 pg/ml,10 M 组:2.101 pg/ml?0.098 pg/ml, -4 10 M 组:1.100 pg/ml?0.057 pg/ml)及 IL-6(空白组:215.80 pg/ml?34.67 pg/ml, -8 -6 -4 10 M 组:97.84 pg/ml?2.565 pg/ml,10 M 组:67.74pg/ml?0.938 pg/ml,10 M 组: 30.48pg/ml?0.670 pg/ml)表达均减少,且各组间比较均有统计学意义:P0.05。 关 关键 键词 词:孕激素,子痫前期,TLR4,NF-kB ,TNF-α 关 关键 键词 词 3 华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 The role of progesterone in the TLR4 signaling pathway of the pathogenesis of pre-eclampsia Master Candidate: Wu MinSupervisor: A.P. Wu Chaoying Abstract:Objective: To study the difference of progesterone level of maternal blood betweenthe preeclampsia pre-eclampsia, PE patients and the normal pregnant women; and the role of progesterone in the Toll-like receptor 4 toll-like receptor4, TLR4 signal pathway in PEMethods: 30 groups PE patients and normal pregnant women were included, between the two groups, there were no significant differences in gestational age, age and weight, the level of progesterone in maternal venous blood was measured by the Quantitative dilution method; the peripheral blood mononuclear cells PBMC isolated from the preeclampsia pregnant women were primary cultured, with different concentrations of progesterone 0M,10-8M, 10-6M, 10-4M stimulated, and then the TLR4mRNA, MyD88mRNA myeloid differentiation protein 88, NF-kappaB mRNA nuclear factor κ B, NF-κ B was measured by Real-time PCR Real-time polymerase chain reaction; The Ikappa-B protein expression was detected by Western blot; and the supernatant tumor necrosis factor-α TNF- α and interleukin-6 IL-6 expression was gained by Enzyme-linked immunosorbentassay ELISA Results: The progesterone level of preeclampsia was 376.524nmol/L?145.89nmol/L, And the progesterone level of the normal pregnant women was 438.007nmol/L? 148.124nmol/L, P 0.05. With the concentrations of progesterone increasing , the TLR4mRNA 、MyD88mRNA and NF-kBmRNA expression show a downward trend,-?CT -8 their 2 value were as follows: TLR4mRNA: the control:1.462?1.102, 10 M -6 -4 group:1.260?0.413, 10 M group:0.852?0.218, 10 M group:0.584?0.029; -8 -6 MyD88mRNA:the control:1.052?0.269, 10 M group:0.705?0.037, 10 M group: 4 华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 -4 0.2944?0.019, 10 M group : 0.097?0.011 ; NF- κ BmRNA : the control : -8 -6 -4 M group:1.045?0.393, 10 M group:0.0212?0.008, 10 M group: 2.341?0.326,10 0.006?0.0013;and there is significant difference among the groups,P0.05; The -8 IkappaB protein expression (OD value:the control:0.187?0.015, 10 M group: -6 -4 0.777?0.047,10 M group:1.42?0.092,10 M group:2.3?0.243)decreased with the increase of the concentration of progesterone, and P0.05; the TNF-α expression -8 -6 the control: 5.733 pg/ml?0.208 pg/ml, 10 M group: 3.100 pg/ml?0.201 pg/ml, 10 M -4 group:2.101 pg/ml?0.098 pg/ml, 10 M group:1.100 pg/ml?0.057 pg/ml and the -8 IL-6 expression (the control:215.80 pg/ml?34.67 pg/ml,10 M group:97.84 -6 -4 pg/ml?2.565 pg/ml , 10 M group : 67.74pg/ml?0.938 pg/ml,10 M group : 30.48pg/ml?0.670 pg/ml) was decreased with the progesterone concentration decreased, P0.05 Conclusion: The blood progesterone level of preeclampsia was lower than the normal pregnant women, and the progesterone can inhibit the TLR4 signal pathway in preeclampsia, it plays a significant role in the TLR4 signal pathway ,and providing a new aspect for the research of preeclampsiaKey words: progesterone, preeclampsia, TLR4, TNF-α, NF-kB5 华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 前 前言 言前 前言 言子痫前期(Preeclampsia,PE)是妊娠期特 有的疾病,该病严重影响母婴健康, 是我国孕产妇围产期及围产儿发生不良结局的主要原因之一。目 前研究显示其发 [1] 病机制多样,无法用一元理论解释 。近来有研究提示:在子痫前 期中,宫内感 染可通过多种作用机制发生作用,而 TLR4(toll-like receptor4,TLR4)作为 先天免疫反应与后天获得性免疫的桥梁,其级联反应通路是宫内 感染导致子痫前 期的重要途径之一,它可因大量的炎性因子释放引起一系列免疫 反应而导致子痫 [2,3] 前期的产生 。 TLRs(toll-like receptors,TLRs)是一种模式识别抗体家族,是天然免疫 的重要组成部分,目前为止Toll样受体家族至少有11名成员,它们各自的配体不 同,TLR4是其成员之一,除可在单核细胞,血管内皮细胞,树突状细胞,多形核 [4] 细胞,T、B淋巴细胞等广泛表达,其在母胎界面亦广泛表达 ,可识别跨膜信号 革兰氏阴性菌脂多糖(lip polysaccharides, LPS)和热休克蛋白60,介导一种慢性 [5] 炎症反应以大量的炎性因子表达为特征 。TLR4与其配体识别并结合后可通过 MyD88依赖性和非依赖性两种途径活化信号转导通路。MyD88依赖途径,即 TLR4与其配体识别并结合后募集MyD88并激活下游一系列激酶最终使NF-κB转 [6] 位到胞核,启动细胞因子如IL-1、IL-6和TNF-α的合成与释放 ,介导急性炎症反 应,直接杀伤入侵的病原微生物。TLR4的活化具有双重作用,它可以通过先天 性免疫应答和获得性免疫反应来保护机体,但是它所引起的持续性炎症反应也会 [7] 对机体产生损伤 。孕激素作为女性机体的重要激素,是妊娠发生及维持妊娠进 展的重要激素之一,同时孕激素可参与机体免疫反应。已有研究报道孕激素可在 [8] 中枢神经系统疾病如脑损伤发病机制TLR4信号通路中起抑制作用 。但孕激素 在子痫前期中的作用,国内外文献报道不一,尚无定论。本研究通过了解孕激素 在子痫前期和正常孕妇血浆中的表达差异,并进一步研究其对TLR4信号通路的影 响,以期为子痫前期发病机理的研究提供新的资料并为临床子痫前期的防治提供 理论基础。 6 华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 材 材料 料与 与方 方法 法材 材料 料与 与方 方法 法( ( ( (一 一 一 一) ) ) ) 材 材 材 材料 料 料 料 11、 、子 子痫 痫前 前期 期孕 孕妇 妇外 外周 周静 静脉 脉血 血:孕妇来自 2010.3?2011.7 华中科技大学同济医学 11、 、子 子痫 痫前 前期 期孕 孕妇 妇外 外周 周静 静脉 脉血 血 院附属协和医院产科门诊及住院病人,年龄 28?5.0 岁,孕周 34.1?4.1 周, 子痫前期诊断 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 :参照人民卫生出版社 2005 年出版的《威廉姆斯产科学 手册》第 21 版。无菌条件下采取无其它并发症的子痫前期孕妇外周静脉血 10ml,根据实验内容以肝素(提取细胞总蛋白)或 EDTA-Na(提取细胞 RNA) 2 抗凝,取得标本后立即用于实验。 2222、 、 、 、主 主 主 主要 要 要 要试 试 试 试剂 剂 剂 剂: : : : 黄体酮: 上海通用药业; RP1640 完全培养液: 美国 Gibco 公司; 10%小牛血清: 杭州四季青公司; 淋巴细胞分离液(Ficoll-Paque):美国 GE公司; Ikappa-B抗体: 美国 Santa公司; β-actin抗体: Sigma公司 ECL发光剂: 碧云天公司 RNA提取试剂 Trizol: 美国 GIBCO公司; RNA逆转录反应试剂: 大连宝生物公司(Takara);引物合成: invitrogen公司 DEPC: Sigma公司 PCR 反应试剂: 大连宝生物公司(Takara); TNF-α ELISA试剂盒: Neobioscience公司 IL-6 ELISA试剂盒: Neobioscience公司 RIPA蛋白裂解液和 PMSF: 普利来公司 BCA蛋白浓度测定试剂盒: 美国 Pierce Chemical 公司 33、 、主 主要 要溶 溶液 液配 配制 制33、 、主 主要 要溶 溶液 液配 配制 制3.1 RPMI-1640 培养液7 华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 RPMI-1640 培养基 10g 溶于 300ml 超纯水中,加入 NaHC0 2g,青霉素(20 3 万/ml)0.5ml,链霉素(20 万/ml)0.5ml,溶解后以超纯水定容至 1000ml,最终 PH为 7.2, 0.45μm 和 0.22μm 于超净台上过滤,需要可加入 10%小牛血清。 3.2 磷酸盐缓冲液phosphate-buffered saline,PBSg/L KCl 0.2 g KH P0 0.24 g 2 4 NaCl 8.0 g Na HP04.12H20 3.58 g 2 用双蒸水溶解后定容至 1000ml, 分装备用。3.3 D?Hank’s液 g/L KCl 0.4 g KH P0 0.06 g 2 4 NaCl 8.0 g NaHC0 0.35 g 3 Na HP0 .12H 0 0.06 g 2 4 2 用双蒸水溶解后定容至 1000ml,分装后,高压备用,4?C 冰箱保存备用。 3.4 DEPC水 用移液器吸取 lmlDEPC,溶于 1000ml 双蒸水中,备用。 3.5 细胞蛋白裂解液 按 RIPA与 PMSF比例为 100:1 的比例配置,最好现配现用。 3.6 1.5mol/L Tris?HCl(pH8.3) 超纯水 200ml Tris MW121.14 45.43g 充分溶解后,用浓盐酸调节 pH至 8.3,最后用超纯水定容至 250ml,于室温下 保存。 3.7 10%过硫酸铵(AP) 超纯水 1.0ml 过硫酸胺 0.1g 充分溶解后,可以在 4 ?保存 1 周。 3.8 1 mol/L Tris?HCl(pH6.8) Tris 30.28 g 超纯水 200ml8 华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 充分溶解后,用浓盐酸调节 pH至 6.8,用超纯水定容至 250ml, 于室温保存。 3.930%丙稀酰胺(100ml) 双丙烯酰胺 1 g 丙烯酰胺 29 g 充分溶解,后用超纯水定容至 100ml,4?C 冰箱保存。 3.10 5×SDS 上样缓冲液溴酚蓝 0.025 SDS 0.5g 0.5 mol/L Tris?HCl(pH6.8) 2.5ml 二硫叔糖醇(DTT,MW154.5) 0.39g 甘油 2.5ml 充分混匀后,分装于 1.5ml 离心管中,4?冰箱保存。 3.11 0.5×Tris-甘氨酸电泳液缓冲液 SDS 1g Tris(MW121.14) 3.03g 甘氨酸(MW75.07) 14.4g 用蒸馏水充分溶解后定容至 1000ml,此溶液为 1×,临用前稀释 2 倍,室温保 存备用。 3.12 转膜缓冲液 甘氨酸 9g Tris-base 1.93g 甲醇 200ml 完全用蒸馏水溶解后定容至 1000ml,室温保存备用。 3.13 TBS 缓冲液(5×)PH:7.5 Tris 12.1g NaCl 40g 用蒸馏水完全溶解, HCL调 PH至 7.5 后用蒸馏水定容至 1000ml,室温保存备用。 3.14 TBST 缓冲液 (1?) 现配现用9 华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 20%Tween20 1 ml TBS(1×) 1000ml 3.15 5%TBS 封闭液 TBS(1×)100ml 脱脂奶粉5g 3.1610 ×丽春红染液 磺基水杨酸 30g 丽春红 S 2g 三氯乙酸 30g 充分溶解后,用蒸馏水定容至 100ml,室温保存,使用时应该将其稀释 10 倍。 3.17 5X 显影液50?自来水 375ml 溴化钾 20.95g 无水碳酸钠 33.75g 无水亚硫酸钠 22.5g 米吐尔 1.55g 充分溶解后补水定容至 500ml 3.18 定影液 50~60?自来水 700ml 无水亚硫酸钠 15g 硫代硫酸钠 240g 硼酸 7.5g 冰乙酸 12.6ml 钾明矾 15g(水温冷至 30?以下时再加入) 每一种粉剂加入均应在上一粉剂完全溶解后再加入,成分溶解后 再加水定容至 1000ml,室温保存备用。 44、 、主 主要 要仪 仪器 器 44、 、主 主要 要仪 仪器 器 双蒸水系统 Lonenaustauscher SG10华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 高温烘烤箱 上海精宏实验设备有限公司 紫外分光光度计 美国 BECKMAN 公司生产的 DU650 型 4?、-20?冰箱 西门子冰箱 -80?低温冰箱 Thermo Forma -86? ULT Freezer 转膜电泳仪 BIORAD公司仪器 电热超净工作台 北京半导体设备一厂 恒温水浴箱 上海跃进医疗器械厂 细胞培养箱 日本三洋株式会社 荧光定量 PCR 仪 美国 Applied Biosystems 公司。 低温高速离心机 德国 Heraeus 公司 凝胶图像分析系统 英国 UVP 公司生产的 GDS8000 型 条带密度分析软件 Gelworks 1D interdiate 软件 ( ( ( (二 二 二 二) ) ) )实 实 实 实验 验 验 验方 方 方 方法 法 法 法 11、 、子 子痫 痫前 前期 期孕 孕妇 妇与 与正 正常 常孕 孕妇 妇外 外周 周静 静脉 脉血 血孕 孕激 激素 素水 水平 平比 比较 较:将在年龄、孕周子痫 11、 、子 子痫 痫前 前期 期孕 孕妇 妇与 与正 正常 常孕 孕妇 妇外 外周 周静 静脉 脉血 血孕 孕激 激素 素水 水平 平比 比较 较 前期孕妇与正常孕妇按配对 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 原则配对,共 30 对,无菌条件下用促凝管抽取 其外周静脉血 3ml,以稀释定量法测定其血浆孕激素水平。2222、 、 、 、外 外 外 外周 周 周 周血 血 血 血单 单 单 单个 个 个 个核 核 核 核细 细 细 细胞 胞 胞 胞制 制 制 制备 备 备 备: 2.1:标本来源:2010 年 3 月-2011 年 7 月武汉协和医院产科住院部子痫前期且无 其它并发症患着。 2.2:标本:无菌条件下抽取的子痫前期孕妇外周静脉血 10-15ml。 2.3:步骤:(在超净工作台工作,全程无菌作业) ? 将取得的在外周静脉血与 PBS 液 1:1 等比充分混匀,按照稀释静脉血:淋 巴细胞分离液为 2:1 的比例在淋巴细胞分离液表面轻轻加入稀释血液,保持其界 限清楚。 ? 室温下水平离心 2500rpm×25min。 ? 离心后离心管中液体分为三层:上层:血浆和 PBS 液中层:Ficol 分离液11华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 下层:红细胞及粒细胞 在上层与中层之间可见一清晰白色云雾状狭窄带为单个核细胞,还混有少许血小 板,用毛细吸管轻轻吸出此狭窄带至另一离心管中。 ? 在单个核细胞离心管中加入相当其体积 5 倍的 PBS 液,1500rpm×10 两次, 弃上清,低温离心有利于去除血小板。 ? 加入含 10%小牛血清的 RP1640 重悬细胞。 ? 0.2%台盼蓝计数及测定活率,将获得的细胞(或率 95%以上)调整为 4.5× 6 10 个/ml 细胞悬液,种于六孔板中,每孔 2ml。? 在 37?C、5%CO 中培养 24 小时。 2 -2 3333、 、 、 、孕 孕 孕 孕激 激 激 激素 素 素 素刺 刺 刺 刺激 激 激 激:将黄体酮原液用无水乙醇充分混匀稀释成 10 M 作为母液待用 -8 -6 -4 将母液用 1640 液分别稀释成 10 M、10 M、10 M;将已培养 24 小时的淋巴细 胞取出显微镜下观察其大部分呈悬浮状态生长,将各孔培养基吸出室温下 -8 -6 -4 2500rpm×5min 离心,弃上清后分别加入含不同浓度孕激素 10 M、 10 M、 10 M、 空白对照但不含血清的 1640 培养液 2ml,置于 37?C、5%CO 中培养 6 小时。 2 4444、 、 、 、RRRReeeeaaaallll----ttttiiiimmmmeeee PPPPCCCCRRRR检 检 检 检测 测 测 测TTTTLLLLRRRR4444mmmmRRRRNNNNAAAA、 、 、 、MMMMyyyyDDDD88888888 mmmmRRRRNNNNAAAA、 、 、 、NNNNFFFF----kkkkBBBB mmmmRRRRNNNNAAAA的 的 的 的表 表 表 表达 达 达 达 4.1 细胞 RNA提取 4.1.1 细胞提取 ? 将六孔板中的培养基收集到离心管中。 ? 4?C,2500rpm 离心 8 分钟。 ? 离心后将上清分装于小 EP 管中,-80?C 保存待用。 ? 沉淀中加入 PBS 2 ml,4?C,2500rpm 离心 5 分钟,清洗细胞一次。 ? 弃掉上清,轻轻吸尽沉淀上层液体后加入 Trizol500?l,轻轻吹打至不见细胞 沉淀,将其转移至 EP 管中,-80?C 保存待用或立即用于 RNA提取。 4.1.2 RNA提取 (全程佩戴一次性口罩、帽子及手套,并及时更换) ? 从-80?C 冰箱取出已加 Trizol 的细胞,待其自然溶解。 ? 溶解后颠倒混匀数次,室温静置 5min。 ? 以每 1mlTrizol 中加 0.2ml 氯仿的比例向裂解液中加入 0.1ml 的氯仿。盖紧 EP 管盖,震荡 EP 管 15 秒,使其充分混匀,冰浴静置 5min(室温 3-5min)。4?, 12华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 10000g离心 15min。 ? 小心地从离心机中取出离心管,发现其液体分为三层:上层为水相,中间层 为白色,底层为黄色有机相,RNA 主要位于水相中,吸取上层水相于另一 EP 管中,(注意不要吸动中间白色相),其体积约 Trizol 的一半。 ? 在上清中按加入与上清等体积的异丙醇,轻轻上下颠倒离心管,充分混匀, 室温下静置 10min。低温 4?,12000g离心 10min。 ? 小心倒掉离心管中上清,留取沉淀。沿管壁缓慢地加 0.5ml 现配的 75%的乙 醇(1ml 溶液中含 0.75ml 无水乙醇,0.25mlDEPC 水,需预冷),轻轻颠倒洗涤 离心管壁, 4?,7500g离心 5min。 ? 小心倒掉上清,将离心管置于超净工作台上开风机吹干,至 RNA 沉淀变透 明,约 10 分钟,(不能让 RNA沉淀完全干燥,否则会极大地降低它的可溶性)。 吹干后向管中加入 10-20μl 0.1%DEPC 水,用于溶解 RNA,待其充分溶解后,-80 ?保存或立即用于逆转录。 ? 用紫外分光光度仪鉴定总RNA纯度及浓度;1%琼脂糖凝胶含核酸燃料5 ug/m1电泳以确证总RNA的完整性。 4.2 cDNA合成 ?RNA逆转录反应体系:反应液配制在冰上进行,所需反应试剂成分如下: 试剂 用量PrimeScript TM RT Enzyme Mix 1 0.5μl Oligo dT primer 0.5μl*1 Random 6 mers 0.5μl 5×primeScript TM Buffer 2μl*2 Total RNA5μl DEPC 水 1.5μl Total 10μl *1:Random 6 mers 和 Oligo dT Primer同时使用,可有效地将全长 mRNA反转录 成 cDNA *2:因提取的 RNA浓度相对较低,所用的总 RNA体积偏大。13华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 ?上机进行逆转录: 逆转录反应条件如下:37 ? 15 min (逆转录反应) 85 ? 5 sec(逆转录酶的失活反应) 4?stop ? 所得产物-20 ?冰箱保存,或立即进行 PCR。 4.3 Real-time PCR(实时定量聚合酶联反应) 根据参考文献设计引物,应用逆转录聚合酶链反应(Real time-PCR)技术扩增 所需 mRNA部分片段,各引物序列如下: β-actin引物序列:上游引物 5†-TCCTGTGGCATCCACGAAACT- 3†下游引物 5†-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT- 3†TLR4 引物序列: 上游引物 5†-AGTGTGTGTGTCCGCATGAT- 3† 下游引物 5†-CCACTTGGGGTCTAAGAACG- 3† MyD88 引物序列: 上游 5†-CGCCGGATGGTGGTGGTTGT-3† 下游 5†-TGAGGTCGCAGACAGTGATGAACC-3† NF-kB引物序列 上游 5†-CCACAAGCAAGAAGCTGAAG-3† 下游 5†-AGATACTATCTGTAAGTGAACC- 3†? PCR 反应体系:反应液配制在冰上进行,所需反应试剂成分如下: 试剂 使用量目标 mRNA上游引物 1μl目标 mRNA下游引物 1μ l模板(cDNA 溶液) 2μlSYBR? Premix Ex TaqTM II(2×) 12.5μl dH2O 8μlTotal 25 μl 14华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 每个反应试管设三个副孔。 ? 进行 Real Time PCR 反应:各目标反应条件如下: TLR4 MyD88 NF-κB 步骤 1:预变性 95? 30 秒 95? 30 秒 95? 30 秒 循环 2: 变性95? 5 秒 95? 5 秒 95? 5 秒 退火58? 30 秒 56? 30 秒56? 30 秒 循环40 次 40 次40 次 ? 实验结果分析: 在试验初以各目的基因模板稀释成一系列浓度梯度进行 PCR 反应,以每个稀 释样品的 Ct 值对初始模板浓度的 log 值作标准曲线,用计算机算出其斜率并得 -? ? ? ?? ? ? ?Ct 到各模板扩增效率在 90-105%之间,因此可用相对定量法 2 法分析 RNA相 对量。Ct 值的意义:C:Cycle,T:threshold,Ct 值的意义:反应最初产物成指 数增长,但荧光处于背景水平,检测不到其信号,当累积了足够的扩增产物,可 以产生可检测的荧光数时,这个循环数即初始循环数,即 Ct,通用的统计学计 算方式都是基于 Ct 值。 ? 计算方法 -? ? ? ?? ? ? ?Ct 目的基因相对定量值:目的基因 mRNA相对表达量比值 F=2 ?Ct=Ct 目的基因- Ctβactin ??Ct?Ct 实验组(本实验中为各孕激素浓度组)-?Ct 对照组(本实验 中为 0M 孕激素组) 得到的结果是通过管家基因表达水平校准的试验样本中目标基因相对于校准 样本的增加或减少的倍数,用管家基因校准目标基因表达的目的是弥补样本组织 量得差异。 5555、 、 、 、weeeesssstttteeeerrrrnnnn----bbbbllllooootttt( ( ( (免 免 免 免疫 疫 疫 疫印 印 印 印记 记 记 记法 法 法 法) ) ) )检 检 检 检测 测 测 测IIIIkkkkaaaappppppppaaaa----BBBB蛋 蛋 蛋 蛋白 白 白 白的 的 的 的表 表 表 表达 达 达 达 5.1 细胞总蛋白提取 ? 将不同浓度孕激素刺激后的细胞分别收集到离心管中。15华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 ? 4?C,2500rpm 离心 8 分钟。 ? 离心后将上清分装于小 EP 管中,-80?C 保存待用。 ? 沉淀中加入 PBS 2 ml,4?C,2500rpm 离心 5 分钟,清洗细胞一次。 ? 在获得的细胞沉淀中加入含有 PMSF(体积为 RIPA的 1/100)的 RIPA裂解 液 100μl(大约为细胞体积的 10 倍),冰上裂解 30min。 ? 将裂解后的液体于低温离心机 4? ,12000g 离心 20min,将上清转移至另一 EP 管,此上清即为细胞总蛋白。 ? 将获得的蛋白立即用于 western blot 或于-80?冰箱保存。 5.2 BCA法测定细胞蛋白浓度 ? 根据所需配置 BCA 工作液:A试剂:B试剂 50 :1,充分混匀后 24 小时 内稳定。 ? 充分溶解蛋白标准品:用 PBS 缓冲液将 10μl 标准品稀释至 100μl,使其终浓 度为 0.5mg/ml。 ? 将稀释后的标准品以 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl 的量 分别加入到 96 孔板的标 准品孔中,再分别加标准品稀释液至 20μl。 ? 加适当体积样品到 96 孔板的样品孔中,再分别加标准品稀释液至 20μl。 ? 各孔加入 80μl BCA 工作液,37?放置 30分钟。 ? 测定 A562 的 OD 值,根据标准曲线计算出蛋白浓度。 5.3 做胶 ? 清洗玻璃板:用自来水清洗干净玻璃板,务必使其不留污渍,用蒸馏水冲洗 干净后晾干。? 将晾干后玻璃板对齐小心放入夹中夹紧,垂直卡在电泳仪架子上准备灌胶。 (两玻璃应对齐,以免漏胶。) ? 配置 10%的分离胶,配置方法如下: 试剂 用量 超纯水 4 ml16华 华 华 华 中 中 中 中 科 科 科 科 技 技 技 技 大 大 大 大 学 学 学 学 硕 硕 硕 硕 士 士 士 士 学 学 学 学 位 位 位 位 论 论 论 论 文 文 文 文 30%丙烯 3.3ml 1.5 mol/L Tris?HCl(pH8.3) 2.5ml 10%SDS 100 μl10%AP 100 μl TEMED *1 5 μlTotal 10ml *1:最后加入,促进凝固,加完后马上灌胶,否则液体很快会凝固。 ? 将配置好的分离胶迅速灌