发表论文3.21

醒脑开窍法对阳明腑实证发热大鼠神经肽类分子的影响 [摘要]目的：探讨醒脑开窍法对阳明腑实证发热大鼠下丘脑中促肾上腺激素释放激素（CRH）、血管加压素（AVP）、P物质（SP）、神经降压素（NT）的含量影响。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ：参照樊氏[1]造模法，建立大鼠阳明腑实证发热模型，随机分为6组：空白组、模型组和4组给药治疗组，各治疗组应用醒脑静注射液、大承气汤、醒脑静合用大承气汤（简称开窍通腑组）、扑热息痛治疗，体温下降期处死动物，观察其下丘脑、胃、结肠及血浆中CRH、AVP的含量变化。结果：神经肽类物质的含量治疗组与模型组间存在显著性差异（P＜0.05），通过药物作用提高机体AVP含量来抑制内生致热源CRH的生成，从而使CRH的含量降低，抑制体温升高；通过药物作用使P物质、NT的含量增加来降低体温。结论：醒脑开窍法对大鼠阳明腑实证发热有很好的解热作用，但开窍法兼顾通腑法治疗效果最佳。其解热机制与神经肽类物质CRH、AVP、P物质、NT的含量有关；在脑-肠轴的调控下，药物作用于机体，通过改变机体神经肽类分子的含量参与体温调节，维持机体内环境的稳态，使体温恢复正常。 关键词：醒脑开窍法；神经肽；阳明腑实证；发热； 开窍法，是开通心窍，苏醒神志的治法，传统上用其治疗窍闭时 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现的意识昏迷、谵语等，但近年来，被广泛应用于临床各种发热的治疗，如肺系疾病发热[2-6]、中枢性发热[7-11]、癌性发热[12-15]、流行性出血热发热[16-19]等，并取得良好疗效。其临床常用代表方剂醒脑静注射液治疗各种发热亦有诸多报导，但其作用于机体的解热机制尚不明确。本研究基于脑肠相通理论和同病异治的治疗原则，旨在研究醒脑开窍法对体温正负调节因子的影响，揭示醒脑开窍法对阳明腑实证的解热机制，为指导临床治疗发热性疾病提供实验依据。 1材料与方法 1.1药品试剂 Elisa试剂盒（由上海江莱生物科技有限公司提供）；大肠杆菌内毒素（由西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司,批号L-2630）称取1mg（3×106EU/mg），加300ml生理盐水配制成10000EU/ml的母液，取1ml母液加250ml生理盐水，配制成40EU/ml的大肠杆菌内毒素注射液；附子、干姜、肉桂（购自山东中医药大学中鲁医院）以1:1:1做水煎剂，先泡一个小时，加十倍量的水，水沸后半小时，过滤药液，再加八倍量的水，煎煮40分钟，过滤药液，两次药液混合后，将药液浓缩至2g/ml，4℃保存；大承气汤（购自山东中医药大学中鲁医院）大黄12g，厚朴24g，枳实12g，芒硝9g，先煎厚朴、枳实，水沸30分钟，后下大黄，约十分钟后，过滤药液，第二遍煎约20分钟，两遍和在一起溶入芒硝，浓缩至1g/ml，4℃保存；醒脑静注射液（购自山东省中医院）；扑热息痛片：（购自山东省中医院）根据换算系数，取一片扑热息痛，加33.3ml蒸馏水，给药量即是体重/100ml； 1.2实验仪器 离心机（微量高速离心机（国产）仪器型号：TG16W）；微型电动匀浆机(购于北京优尼康生物科技有限公司)；酶标仪芬兰（Labsystems Multiskan MS）仪器型号(352型)；洗板机：芬兰（Thermo Labsystems）仪器型号(AC8)；培养箱(隔水式恒温培养箱（国产）仪器型号：GNP-9080型) ；电子体温计（欧姆龙）仪器型号LM-142。 1.3动物分组 取Wistar大鼠40只随机分为A、B、C、D、E、F组，每组10只，雌雄各半，A组（空白组）、B组（模型组）、C组（醒脑静组，造模后尾静脉注射醒脑静注射液，0.06ml/100g体重）、D组（大承气汤组，造模后灌服大承气汤，1ml/100g体重）、E组(醒脑静合用大承气汤，等效剂量)、F组（扑热息痛组，造模后灌服体重/100ml）。 1.4造模给药 除空白组外，用制好的附子、干姜、肉桂水煎剂，每天按20g/kg体重，对模型组和治疗组进行灌胃，空白组灌等量蒸馏水，连续12天后，禁食（不禁水）12h。将大鼠自身粪便制成100g/L的混悬液，给模型组和各治疗组大鼠2ml灌胃 ，每天两次，连续两天，空白组灌等量蒸馏水。根据40EU/100g体重于实验的第15天对模型组和治疗组进行腹腔注射，空白组注射等量生理盐水。治疗组于注射大肠杆菌内毒素后，分别进行给药治疗。 1.5标本制备 麻醉各组大鼠，在冰台迅速取出各组大鼠的动脉血、下丘脑、胃、结肠。将动脉血置37℃水浴30分钟后以3000转/分的速度离心10分钟，取血清置于5ml冻存管-20℃保存，下丘脑、胃、结肠分别匀浆后离心取上清液装入5ml冻存管置于-20℃冰箱保存。 1.6指标检测 体温测量使用电子体温计测量大鼠肛温。 各组织CRH、AVP、SP、NT的测量采用Elisa试剂盒进行检测。 1.7统计处理 采用GraphPad Prism 4进行统计学处理，所有数据结果均以±s表示，组间均数比较±s结果经t检验，P＜0.05表示有差异性。 2 实验结果 2.1体温动态变化曲线 如下图1所示阳明腑实证大鼠尾静脉注射醒脑静后体温下降迅速且平缓，大承气汤组体温迅速下降的同时，由于过度的泄泻导致体温降至基础体温以下，醒脑静合大承气汤组的体温下降较以上两组还要迅速，且降低的趋势较单用大承气汤组平缓，表现出理想的解热作用。西药扑热息痛的解热效果亦明显迅速，但在解热的过程中偶尔出现反复的体温回升趋势。从各组大鼠的体温变化过程中的平均体温来看（见图3-1），除模型组与空白组之间有统计学意义外，其余各给药组与空白组之间没有统计学意义，证明醒脑静注射液及大承气汤、扑热息痛等同样对阳明腑实证大鼠具有很好的解热作用，由此可见，醒脑开窍法在治疗阳明腑实证发热过程中发挥有效的解热作用。 图1：给药后体温动态变化曲线 2.2各组大鼠脑肠轴上各组织中CRH、AVP、SP、NT的含量 如表2、表3所示，CRH、AVP主要分布在下丘脑中，在胃肠及血浆中也广泛分布，各组间进行比较，CRH的含量治疗组明显低于模型组（●P＜0.05），接近于空白组水平；AVP的含量差异性主要表现在治疗组与空白组（*P＜0.05），考虑模型组AVP含量高于空白组却与治疗组差异不大，这可能与大鼠自身免疫有关。表4、表5显示，SP的含量各治疗组含量明显高于空白组，模型组SP含量升高可能与自身免疫相关，NT的含量各治疗组含量明显高于空白组（*P＜0.05）和模型组（●P＜0.05），但各给药组与醒脑静组比较没有显著性差异。 表2：大鼠各组织中CRH的含量比较（ng/L）（±s, n=10）   下丘脑 脊髓 胃 结肠 肾 肺 血浆 A组 B组 C组 D组 E组 F组 32.30±1.20* 40.04±4.40△● 33.34±2.89* 33.66±3.19* 29.14±1.61* 30.42±3.67* 23.85±3.15* 30.91±5.17△● 23.64±1.89* 24.40±1.76* 22.64±2.49* 23.97±2.34* 22.24±3.07* 27.45±1.97△● 21.28±2.92* 22.87±2.42* 20.69±1.97* 20.96±3.17* 19.30±3.91* 24.81±1.73△● 17.95±2.17* 19.57±2.60* 20.24±1.78* 20.74±3.45* 20.34±0.89* 24.18±2.25△● 19.48±0.95* 21.10±1.60* 22.30±1.84* 20.28±0.97* 22.20±1.45* 26.06±2.90△● 21.41±1.32* 21.54±1.33* 21.38±0.84* 22.42±1.46* 24.29±0.98* 27.37±3.08△ 22.96±1.66* 21.47±1.48* 22.72±1.74* 23.51±2.62*                 与A组比较●P＜0.05，与B组比较*P＜0.05，与C组比较△P＜0.05 表3：大鼠各组织中AVP的含量比较（ng/L）（±s, n=10）   下丘脑 脊髓 胃 结肠 肾 肺 血浆 A组 B组 C组 D组 E组 F组 541.0±26.35△ 575.9±25.74● 607.8±15.98● 608.1±28.97● 587.0±18.79● 593.1±29.09● 459.4±44.02△ 513.2±37.30● 539.8±33.17● 517.8±40.51● 528.1±41.94● 513.2±30.15● 532.7±37.57 583.2±57.95 599.5±34.68 577.6±52.06 621.1±36.30● 595.3±64.18 466.8±37.89△* 533.9±40.45● 562.3±41.50● 530.5±41.34● 593.3±28.75●* 525.9±36.34● 463.2±40.13△* 510.2±21.57● 533.8±38.75● 538.4±24.17● 552.5±25.30●* 572.3±17.93●* 465.0±25.91△ 507.4±18.39 551.0±52.01● 521.2±41.83● 548.2±40.76● 507.8±37.75● 473.7±27.37△ 528.5±48.36● 543.1±50.04● 535.6±42.93● 558.6±12.72● 534.8±34.02●                 与A组比较●P＜0.05，与B组比较*P＜0.05，与C组比较△P＜0.05 表4：大鼠各组织中中SP的含量比较（ng/L）（±s, n=10）   下丘脑 脊髓 胃 结肠 肾 肺 血浆 A组 B组 C组 D组 E组 F组 147.4±5.15△ 155.4±6.61● 161.1±7.11● 159.9±5.39● 168.4±7.55●* 160.6±3.41● 138.4±9.46△ 144.8±3.61 152.4±5.94● 156.0±2.26●* 156.3±8.43●* 151.2±4.89● 106.1±5.31 109.1±10.26 115.3±9.37 114.9±6.23 124.7±5.90●* 118.4±7.79● 96.29±9.36Δ 93.12±7.58 113.1±5.19●* 107.1±5.74●* 112.5±6.65●* 110.1±6.30●* 87.12±5.01 85.20±4.35 88.47±6.53 89.57±5.27 90.63±3.52 92.97±4.80 82.13±7.13Δ 80.98±3.01 91.10±5.43* 89.19±6.40 98.35±9.36●* 91.24±5.19* 102.2±6.64 100.4±8.78 108.0±6.81 106.2±5.72 107.9±6.29 108.9±8.12                 与A组比较●P＜0.05，与B组比较*P＜0.05，与C组比较△P＜0.05 表5：大鼠各组织中中NT的含量比较（ng/L）（±s, n=10）   下丘脑 脊髓 胃 结肠 肾 肺 血浆 A组 B组 C组 D组 E组 F组 105.3±4.68*△ 111.8±5.67●△ 134.5±2.49●* 136.4±2.69●* 169.8±1.96●* 157.0±6.19●* 98.42±7.45△ 103.0±3.01△ 130.0±2.30●* 141.3±2.91●* 155.1±4.90●* 143.5±6.78●* 74.65±7.73△ 76.08±5.99△ 109.3±8.74●* 101.6±3.41●* 118.4±6.27●* 97.41±4.14●* 68.06±6.52△ 68.03±5.15△ 85.80±4.91●* 84.65±5.24●* 93.88±2.31●* 82.69±5.06●* 52.95±5.29△ 52.59±5.40△ 69.26±3.51●* 69.73±4.33●* 74.77±7.63●* 65.45±5.64●* 51.01±4.07△ 47.95±4.87△ 64.51±5.05●* 62.82±4.97●* 69.82±5.53●* 61.79±2.46●* 84.42±4.41△ 85.46±4.64△ 95.04±7.24●* 96.14±3.58●* 108.1±5.29●* 92.81±3.37●*                 与A组比较●P＜0.05，与B组比较*P＜0.05，与C组比较△P＜0.05 3讨论 中枢脑内神经肽在体温调节和发热机制中的作用颇受注意，发现促肾上腺皮质激素释放激素(CRH）是重要的中枢发热介质。精氨酸加压素(AVP)是一种下丘脑合成的后垂体肽激素，在体温负调节中有重要作用[20]。P物质（ substance P，SP）、神经降压素（neurotensin，NT）在神经系统与非神经系统之间的桥梁作用，尤其是其介导的神经系统与免疫系统、神经系统与内分泌系统间的作用引人注目。众多试验证明P物质、NT参与体温调节反应 [21]。本实验表明：醒脑开窍法对阳明腑实证发热有很好的解热作用，其解热机制与神经肽类物质CRH、AVP、P物质、NT有关，通过药物作用提高机体AVP含量来抑制内生致热源CRH的生成，通过提高P物质、NT的含量来降低体温，从而达到速效解热的目的。同时，揭示了醒脑开窍法与通腑泻热法同样对胃肠道疾病造成的发热有很好的治疗作用，提示“肠病治脑”的思路，为“脑肠相通”理论提供实验依据。以此为基础引导我们探求治疗温病三焦发热的新的治疗方法。