MTT法绘制生长曲线
MTT法绘制生长曲线
细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行，但是数值不够精确，可有20,30%的误差，需结合其它指标进行
分析
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四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTT。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物 形成的量与细胞数成正比。
MTT溶液:用PBS配制5mg/ml的MTT溶液，0.22um的微孔滤器除菌，4?保存(两周内有效)。
一、操作步骤
1. 接种细胞:用0.25%胰蛋白酶消化细胞，配成单个细胞悬液，以每孔3000~8000/well接种于96孔培养板中，每孔体积200ul。
2. 培养细胞:将培养板移入CO2孵箱中，在37?、5% CO2及饱和湿度条件下培养。(培养时间取决于实验目的和要求)
3. 呈色:每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20ul，37?孵箱中继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮生长的细胞，需离心(1000rpm，5min)，然后弃去孔内培养液。每孔加入150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。
4. 比色:选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为终轴绘制细胞生长曲线。
注意事项
1( 选择适当的细胞接种浓度。在进行MTT试验前，对每一种细胞都应测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，然后确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间。
2( 避免血清干扰，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行试验。
3( 设空白对照，与试验平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔。最后比色时，以空白孔调零。
四唑蓝(MTT)法测定细胞生长曲线及生长速度:MTT法绘制3组细胞的生长曲线，分别将细胞用无血清培养液配制成单细胞悬液,计数后接种于96孔板(1×104)/孔，设立空白组培养7 d,每天每组细胞各取6孔,每孔加入MTT溶液0.5 g/L,37?继续培养4 h,弃去培养上清液,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl,振荡使结晶物充分溶解,选择492 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔波长吸光度(A)值的差值,以时间为横轴, A值为纵轴绘制生长曲线。
浙公网安备 33021202002483