氨基酸含量的测定（茚三酮比色法）
氨基酸含量的测定(茚三酮比色法)
原理
凡含有自由氨基的化合物，如蛋白质、多肽、氨基酸的溶液与水合茚三酮共热时，能产生紫色化合物，可用比色法进行测定。氨基酸与茚三酮的反应分两个步骤。第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛、茚三酮被还原成还原型茚三酮;第二步是所形成的还原型茚三酮与另一个茚三酮分子和NH3缩合生成有色物质。
仪器药品
721型分光光度计 台天平
减压蒸馏器 干燥
研钵 容量瓶
移液管 烧杯
试管架 试管
0.2mol/L柠檬酸缓冲液，pH5.0(见附
表
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2)
80%乙醇
10mmol/L KCN:称取0.1638gKCN溶于蒸馏水中，稀释至250ml备用(注意:KCN剧毒～)
KCN,乙二醇甲醚,茚三酮溶液*:称取1.25g重结晶茚三酮溶于25ml经重蒸馏的乙二醇甲醚中使成5%溶液。将2.5ml10mmol/L KCN溶液用乙二醇甲醚溶液稀释至125ml充分混合。然后将125mlKCN—乙二醇甲醚溶与25ml茚三酮,乙二醇甲醚溶液相混合，置试剂瓶待用，正常情况下应为浅黄色。
标准氨基酸溶液:称取亮氨酸20mg溶于10ml蒸馏水中，则得浓度为200μg/ml的母液。
上述所有试剂必须放在草酸保护的干燥器中，以免被空气中的NH3所污染。
乙二醇甲醚(CH3OCH2CH2OH, methyl cellusolve)的处理:将5g硫酸亚铁加在500g乙二醇甲醚中，振摇1?2小时。过滤除去硫酸亚铁(若滤液混浊没有关系)，再在蒸馏瓶中蒸馏，收集沸点121?125?部分，此时应为透明无色液体。KCN,乙二醇甲醚,茚三酮溶液配制后必须隔夜才能应用。配制后1星期内稳定，若超过1星期则灵敏度降低，不宜作定量。
茚三酮重结晶:即使AR级的茚三酮，由于保管不当，常带微红色，配成溶液后也带红色，影响比色测定，故需重结晶一次方可应用。5g茚三酮溶于15ml热蒸馏水中，加入0.25g活性炭，轻轻摇动，若溶液太稠不易操作，可酌量加水5?10ml，30分钟后用滤纸过滤，滤液放冰箱中过液，次晨即见微黄色结晶出现，过滤，再以1ml冷水洗涤结晶，置于干燥器中干燥，最后装入棕色试剂瓶中保存。
操作步骤
1(绘制标准曲线
取标准氨基酸母液将其稀释成0.5、1.0、5、10、20、30、40、50μg/ml的一系列浓度。
取不同浓度的标准氨基酸溶液1ml，加0.2mol/L柠檬酸缓冲溶液(pH5.0)1ml，充分混和，然后加入1mlKCN,乙二醇甲醚,茚三酮溶液，充分混匀后在100?沸水浴中加热15分钟，取出立即加入3ml60%乙醇稀释之。然后冷却，在波长570nm进行比色，读取吸光度A570。然后绘制A570,氨基酸浓度曲线，或进行直线回归求得相应的直线公式(参阅读实验86)
2(样品的制备
称取植物样品3g，于研钵中加少量80%乙醇，研磨成匀浆，移于100ml容量瓶中，用乙醇将残渣洗入瓶中，最后定容至刻度。过滤，取滤液20ml，在室温下减压蒸发干燥，蒸发的最后阶段在表面皿上进行，得到固形物。使用前用蒸馏水溶解，配制成每ml约含样品0.1g的稀释液。
3(比色测定
与上述制作标准曲线的方法相同。1ml样品(氨基酸含量大约在0.5?50μg)，1ml柠檬酸缓冲液，1mlKCN,乙二醇甲醚,茚三酮溶液，在100?水浴中加热15分钟，取出立即加入3ml60%乙醇稀释之，冷却后即进行比色测定，读取A570(脯氨酸则在440nm波长测定，注意需另行绘制标准曲线)。此法对于一些小肽也可以测定。在多肽合成中常用来检验有无自由氨基的肽类存在。
茚三酮与氨基酸所生成的颜色在1小时内稳定，因此加乙醇稀释后，应尽快进行测定。如果读数超过标准曲线范围，可再加60%乙醇稀释之，不使A570超过0.8为宜。
4(计算
按下列公式计算植物样品中氨基酸含(μg/ml鲜重)。
式中x为从标准曲线查得的氨基酸含量(μg/ml)。
V为20ml样品蒸干后最后的定容体积(ml)。
浙公网安备 33021202002483