NFκB-HIF1α-TNFα信号转导通路中正反馈调节的作用及 …

NFκB-HIF1α-TNFα信号转导通路中正反馈调节的作用及 … 《慢加急性肝衰竭肝库普弗细胞(Kupffer cells)中NFκB-HIF1α-TNFα信号转导通路中正反馈调节的作用及机制的研究》 可行性报告 一、立项的背景和意义 我国是慢性肝病大国～特别是乙型肝炎大国～约有9300万慢性乙肝病毒感染者。这些患者通常都是终身感染～期间病情可发生各种变化。若不进行治疗干预～部分病人可发展至肝硬化、肝衰竭和肝细 [1]胞癌。肝衰竭常见的有四型:急性肝衰竭,acute liver failure～ALF,～亚急性肝衰竭,subacute liver failure～SALF,～慢加急性肝衰竭(acute on chronic liver failure～ACLF)和慢性肝衰竭,chronic liver failure～CLF,。其中～ACLF已经代替ALF成为我国最常见～也是病死率最高的肝衰竭。ACLF被认为是在已知或尚未发现的慢性肝病基础上～患者出现黄疸(血清胆红素?10 mg /dl,171μmol /L,)和凝血功能障碍(INR?1. 5～或凝血酶原活动度< 40%)为最初临床 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现的急性肝脏损害～发病4周内合并腹水和/或者肝性脑病等症候群的一种疾病。慢加急性肝衰竭来势凶猛～发展迅速～预后差～使得其病死率高达 [2-3]60-80%。 我国现有潜在的ACLF发病人群众多～给社会带来了沉重的负担。但学界关于ACLF的研究才刚刚起步～而因此探讨慢加急性肝衰竭的发病机制和有效的治疗措施十分有必要～也具有极大的临床价值和社会经济效益。 二、国内外研究现状和发展趋势 已有的研究证实慢加急性肝衰竭发生的可能机制与过度的免疫反应、炎症因子瀑布反应和肝细胞凋亡有关。通过临床病例的研究～有研究发现ACLF病人血清中炎性介质明显增高～如TNF-α、IL-1、 [3]IL-2、IL-6等。这些炎症因子可触发体内一系列病理生理过程～而 [4]这也被认为是ACLF所具有的重要病理改变之一。能够释放或是受到免疫因子调控的免疫细胞分布广泛～大体上可以分为循环免疫细胞和常驻组织内的免疫细胞。在循环免疫细胞中～T细胞应答是肝衰竭中常见的病因之一。其核心过程是T细胞向Th1型或Th2型分化～CD4，Th1能够产生γ干扰素,IFN-γ,～可杀伤细胞内微生物。相反～CD4，Th2细胞则产生IL-4和IL-5～并与IgE、嗜酸和嗜碱粒细 [5]胞主导的反应相关。同时～肝内免疫细胞包括内皮细胞 ( SEC)、星形细胞、KC和淋巴细胞等。其中KC是在肝中定居的巨噬细胞～正常情况下通过吞噬外源颗粒起到保护肝细胞的作用。在慢加急性肝衰竭中～由于KC处于严重的免疫应激及低氧情况～KC中的免疫信号通路和低氧应激信号通路被激活～从而释放出大量促炎症细胞因子,如TNFα及IL-1β等)、脂质炎性介质、氧自由基等～不仅可直接引起肝细胞损伤～还能诱导肝细胞产生IL-8～中性粒细胞进入肝脏～ [6]加重肝细胞损伤。这些研究表明KC在慢加急性肝衰竭的发病过程 [7-8]中扮演着十分重要的作用。 另外炎症因子TNF-α及其下游信号通路在慢加急性肝衰竭发病中也扮演着十分重要的作用。TNF-α是一种主要由单核-巨噬细胞产 生的具有广谱生理和病理效应的细胞因子。TNF-α一方面参与机体的免疫防御机能, 清除引起肝衰竭病原如HBV～另一方面介导休克、 [5]炎症反应、组织损伤等病理生理反应。在肝细胞中～适量TNF-α介导的免疫反应对机体有保护作用～可促进细胞生长分化～但过量的TNFα则在肝损伤中起重要的介导作用。既往研究表明～TNF-α对肝细胞有直接损伤作用,其通过与肝细胞膜上的TNF受体结合而导致一系列信号传导途径, 最终激活细胞内多种非溶酶体性脱氧核糖核酸内切酶, 将肝细胞双链基因组DNA切割成寡脱氧核苷酸片段, 从而引起肝细胞的死亡。TNF-α除了有直接的肝细胞毒性外, 还可激活肝内皮细胞和肝细胞转录因子, 诱导下游炎症相关基因表达, 诱发炎性细胞对肝细胞的损伤～引起肝细胞坏死,上调中性粒细胞表面黏附因子CD11b/CD18的表达, 使中性粒细胞或Kupffer细胞释放炎性介质, [6]引起白细胞在炎症部位聚集并引起组织的免疫损伤。 还有研究表明TNF-α通过与肝细胞膜上其受体TNF-R1结合而诱发肝细胞凋亡 [7]是肝衰竭模型的重要病理机制～而使用抗TNF-αIgG预处理可阻断LPS诱导的大鼠肝细胞凋亡和坏死。因此～TNF-α被认为是慢加急性肝衰竭动物模型中诱导肝细胞调亡的关键细胞因子之一。但是～在慢加急性肝衰竭中～KC中TNFα的表达是怎么被启动的～以及如何调控其表达是非常重要而又没有被解决的问题。 核因子NF-κB和低氧诱导因子HIF1α分别在炎症和低氧反应中发挥非常重要的转录因子。其中NF-κB是介导细胞中的免疫反应最重要的转录因子～其最重要的形式是p50 /p65异种二聚体。在生理 条件下～NF-κB的二聚体被它的抑制蛋白I-κκBs约束在细胞浆里。当细胞被刺激时, I-NFκB 被I-NFκB酶( IKK) 迅速磷酸化, I-NFκB降解释放NF-κB, NF-κB从细胞浆转移到细胞核, 再结合到与各种基因刺激子和增强子一致的序列上, 引起其下游的靶基因表达～进而激活并增强免疫反应。有研究报道在慢加急性肝衰竭肝组织中 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 到TNFα的高活性。而HIF1α是介导细胞中氧化应激反应的最主要的转录因子HIF-1的一个亚基～它在细胞氧分压正常时很快被降解～但是在缺氧时能够稳定存在并诱导下游基因的表达调控细胞的能量 [9]代谢和血管生成。2011年刘均艳等人发现肝衰竭组大鼠肝脏中HIF-1α的表达显著增加。以上的研究提示在慢加急性肝衰竭过程中KC中同时存在免疫反应与缺氧应激反应的异常活化。 Rirs J 于2008的Nature上刊登自己的研究成果时指出～在遇到炎症和缺氧状况时～免疫细胞中NFκB蛋白活化～进而结合到HIF-1α的启动子区～导致其表达升高。进而表明免疫反应的信号通路和氧化应激信号通路可以有crosstalk。另外一些研究报道TNF-α可以激 [10,11]活NF-κB～从而促进肝细胞凋亡 。 在慢加急性肝衰竭中～KC细胞中是否存在这两条信号通路的同时活化～他们活化后是否是导致KC分泌TNFα,而TNFα是否可以激活KC细胞中NFκB和HIF1α,而改变这种正反馈是否能改善慢加急性肝衰竭,也就是说在慢加急性肝衰竭过程中～NFκB介导的炎症反应和HIF-1α介导的缺氧反应之间的联系及其在ACLF中发挥的作用则无人报道。 三、研究开发内容和技术关键 ,一,研究开发内容: 1、充分利用临床上的慢加急性肝衰竭病人的组织标本～分离Kupffer cells～研究NFκB/HIF1α/TNFα在其中的表达情况～明确三者的表达是否随着病情的进展而逐渐增加。 2、体内研究:在大鼠慢加急性肝衰竭组织中检测NFκB/HIF1α/TNFα的变化。在慢性给于人白蛋白基础上～给予D-氨基半乳糖,D-Glucosaminic Acid, 400mg,kg，脂多糖,lipopolysaccharide,100μg,kg,GalN + LPS,同时腹腔注射的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ～来建立慢加急性肝衰竭大鼠模型～分为4组:?白蛋白对照组,?GalN + LPS处理0.5h组,?GalN + LPS处理3h组,?GalN + LPS处理24h组。取模型大鼠的肝组织与血清～在前者分离中Kupffer cells并检测KC中NFκB～IκκB～HIF1α～TNFα的表达～在后者中检测TNFα的量。 3、体外实验:分离正常大鼠肝脏中的KC细胞～原代培养～实验前一个星期～每天进行人白蛋白刺激～之后检测D-氨基半乳糖联合脂多糖处理后KC细胞中NFκB-HIF1α-TNFα的改变～以未经刺激的KC细胞做对照。建立D-氨基半乳糖联合脂多糖处理的KC～分为4组:?白蛋白对照组,?GalN + LPS处理0.5h组,?GalN + LPS处理3h组,?GalN + LPS处理24h组。检测KC中NFκB～IκκB～HIF1α～TNFα的表达～在过夜上清中检测TNFα的量。 4、机制探讨:NFκB-HIF1α-TNFα在信号通路中激活顺序的研究 构建Luciferase reporter 质粒来研究NFκB和HIF1α这两种转录因子对TNFα转录激活的影响～同时也研究NFκB是否能够激活HIF1α的表达～充分明确NFκB-HIF1α-TNFα这三者之间的激活顺序～从而明确它们在整个信号转导通路中的顺序。 5、RNA干扰技术在研究NFκB-HIF1α-TNFα正反馈中的应用。 在KC细胞中～分别干扰下调NFκB～HIF1α～TNFα任意其中的一个～观察其余两种蛋白的表达情况, 正常状况下～在体外KC培养细胞中～分三组: ?在0h、0.5h、3h、12h时间点～检测对照和TNFαRNAi干预组～HIF1α 和NFκB的表达 ?在0h、0.5h、3h、12h时间点～检测对照和HIF1α RNAi干预组～NFκB和TNFα的表达 ?在0h、0.5h、3h、12h时间点～检测对照和NFκB RNAi干预组～HIF1α和TNFα的表达 6、单独外源性高表达NFκB/HIF1α /TNFα～研究其对另外两个蛋白表达的影响分别构建外源性表达NFκB/HIF1α/TNFα的真核质粒载体～分别瞬时转染至KC细胞中～外源性表达上调NFκB～HIF1α～TNFα任意其中的一个～观察其余两种蛋白的表达情况～从而确定他们之间正反馈的关系。 正常状况下～在体外KC培养细胞中～分三组: ?在0h、0.5h、3h、12h时间点～检测对照和TNFα 外源性表达组中HIF1α 和NFκB的表达 ?在0h、0.5h、3h、12h时间点～检测对照和HIF1α RNAi外源性表达组中NFκB和TNFα的表达 ?在0h、0.5h、3h、12h时间点～检测对照和NFκB RNAi外源性表达组中HIF1α和TNFα的表达。 7、体外慢加急性肝衰竭模型中NFκB-HIF1α-TNFα是否存在正反馈 在KC中～分别通过RNA干预技术下调NFκB～HIF1α～TNFα的表达～之后用D-氨基半乳糖联合脂多糖刺激KC细胞～检测其余两种蛋白的表达, 实验分三组: ?在0h、0.5h、3h、12h时间点～检测对照和TNFαRNAi干预组中HIF1α 和NFκB的表达 ?在0h、0.5h、3h、12h时间点～检测对照和HIF1α RNAi干预组中NFκB和TNFα的表达 ?在0h、0.5h、3h、12h时间点～检测对照和NFκB RNAi干预组中HIF1α和TNFα的表达 8、体内分别及联合应用NFκB/HIF1α/TNFα的三种抗体预处理对慢加急性肝衰竭大鼠炎症状态的影响在体用NFκB/HIF1α/TNFα的抗体预处理～看D-氨基半乳糖联合脂多糖处理的大鼠生存曲线～肝功能和病理改变～ 检测IL-2, IL-6和IL-1β等炎性因子的表达,检测NFκB/HIF1α/TNFα的抑制对慢加急性肝衰竭大鼠中肝脏细胞凋亡的影响。 ,二,技术关键: 1、外源性高表达 NFκB/HIF1α/TNFα的质粒载体的构建, 2、NFκB/HIF1α/TNFa干扰RNA的设计和高效的瞬时转染, 3、Luciferase reporter 报告基因的建立～并且通过该报告基因来研究NFκB/HIF1α/TNFα三者间的激活关系。 四、预期目标: 证明TNF-α、NF-κB和HIF1α存在正反馈～抑制该正反馈对慢加急性肝衰竭存在保护作用,进一步揭示该正反馈的调控机制。预计发表SCI论文1篇～培养硕士研究生1名。 五、研究 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 、技术路线、组织方式与课题分解 ,一,研究方案: 1、ACLF病人肝组织及血清中NFκB/HIF1α/TNFα的测定 充分利用临床上的慢加急性肝衰竭病人的组织标本～用流式细胞术分离Kupffer cells～采用Real-time PCR及Western Blot方法检测NFκB/HIF1α/TNFα在KC中的表达情况～明确三者的表达是否随着病情的进展而逐渐增加。同时～收集并用ELISA方法检测ACLF病人血清中炎症因子TNFα和IL-6的表达情况。 2、大鼠Kupffer cells的分离、纯化和鉴定 参照文献方法～应用?型胶原酶原位灌注肝脏后制成非实质细胞悬液～然后制备Percoll梯度离心液～最下层为50% Percoll分离液,5 ml～中间层为,,, Percoll分离液20ml, 最上层为非实质细胞悬液10 ml。该梯度液在,?、900g,半径16cm,离心20 min～然后用吸管小心吸取50% Percoll梯度离心液,主要为KC,分别放入50 , l Falcon离心管内～加入,× PBS至50 ml～,?、900g κ半径16 c,,离心10 min。沉淀经无血清1640液洗涤,次后用含血清1640完全培养基20 ml混匀制成细胞悬液。采用细胞计数板法测定细胞数～采用0.4,台盼蓝拒染法评估细胞活力。,,在细胞培养箱内,37?～,, CO2,孵育,,～待,,充分贴壁后换液,次～继续在细胞培养箱内培养～每隔24，48,更换,次培养液。48,后首次换液～以后视情况2，3 d换液,次。 在倒臵荧光显微镜下观察,,的形态和生长特征～然后在328 nm激发波长的荧光显微镜下观察～并在透射电镜和扫描电镜下观察细胞形态,同时通过免疫组织化学法检测ED,、Desin和α-,,,等的表达来鉴定KC细胞。 3、NFκB/HIF1α/TNFa干扰RNA的设计和高效的瞬时转染 我们 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 应用专业的干扰RNA设计软件～并且通过和富有经验的生物公司合作～来摸索、找到抑制基因表达效果最好的RNAi序列～并且通过慢病毒作为载体～提高转染的效率～使NFκB/HIF1α/TNFα能够达到90%以上的瞬时抑制效果。 4、外源性高表达 NFκB/HIF1α/TNFα的质粒载体的构建 我们使用高效真核表达载体pCDNA3.1～来构建高表达 NFκB/HIF1α/TNFα的载体～通过体外细胞转染实验来验证其达到我们实验的要求。 5、常规的western blot, 免疫组化～ELISA等技术的运用 在整个实验开展过程中～对于NFκB/HIF1α/TNFα的表达检测～ 比如临床标本～我们使用western blot 和免疫组化的方法～对于体外细胞系研究～我们用western blot 或者real time PCR的方法。PCR引物和相应的蛋白抗体都可以买到～极大的方便了实验的开展。 6、慢加急性肝衰竭模型的建立 健康SD大鼠κ6-8周龄～体重250 g所有实验组大鼠均按照每日腹腔注射人血白蛋白三个月～再将D-氨基半乳糖κ 800 mg /kg+ 脂多糖κ 100 μg /kg ～用无菌生理盐水溶解后腹腔内注射～对照组大鼠仅腹腔内注射等量生理盐水κ大鼠腹腔注射体积为10-20 ml /kg。 7、生存分析 观察各组大鼠腹腔注射D-氨基半乳糖和脂多糖后外观、皮毛、肤色、呼吸、行为活动、精神状态、食欲、大小便及鼻、眼、口腔有无异常分泌物等变化, 并准确记录出现死亡的时间、数量等情况。 8、肝功能检测 取各组大鼠血清～检测ALT和AST。 9、细胞凋亡信号通路及凋亡检测 肝细胞凋亡检测:采用末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记法κTUNEL检测肝细胞凋亡水平: 大鼠肝组织标本用10%中性甲醛固定后常规梯度乙醇脱水, 二甲苯透明～石蜡包埋。3~ 5 µm 石蜡切片, 从每只大鼠的连续切片中随机抽取1 张, 参考相关实验技术作TUNEL 染色, 染色后细胞浆呈棕褐色染色为阳性细胞, 即凋亡细胞。每张切片任选10个高倍视野计数并计算细胞凋亡指数κ AI, 以细胞凋亡指数估计凋亡程度, AI= 凋亡细胞数/总细胞数×100%。 肝组织凋亡相关蛋白的表达:分别提取各组大鼠肝组织的线粒体和胞浆蛋白～各样本进行蛋白定量～western blot 法检测细胞色素C、Bcl-2、Bax、caspase-9和3蛋白的表达情况。 10、血清炎症因子检测及组织炎症因子的表达 血清炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平的检测:取各组大鼠血清～采用免疫酶联方法,ELISA法,检测血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平～试剂盒由美国R&D公司提供。肝组织炎症因子蛋白的表达:分别提取各组大鼠肝组织的蛋白～检测TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。 相关炎症信号通路的检测:分别提取各组大鼠肝组织的核蛋白和胞浆蛋白～检测NF-κB ,p65,在细胞核的表达～胞浆P-NFκB在胞浆的表达。 ,二,技术路线: ,三,组织安排: 课题负责人为副主任医师～有主任医师作为指导者～多名主治医师、住院医师及硕士研究生参与～组织结构合理。定期召开科研会议～协商科研进度。 ,四,课题分解 课题研究内容可分解为临床标本、细胞实验及动物实验～分别由相关人员负责施行。 六、计划进度安排: 2013.9-2013.12 临床组织标本的检测～明确TNFα～NFκB和HIF1α在慢加急性肝衰竭病人KC细胞中的表达,分离～纯化～培养～鉴定KC细胞～构建外源性高表达TNFα～NFκB和HIF1α的质粒载体。转染大鼠KC细胞～研究其单独表达对其他另外两个蛋白的影响, 2014.1-2014.6:构建TNFα～NFκB～HIF1α的RNAi载体慢病毒,通过上调和下调这三个蛋白的表达～来研究对其它两个蛋白的影响～分析其是否存在正反馈的效果。luciferase reporter assay 分析NFκB和HIF1α 对TNFα转录激活情况以及NFκB对HIF1α的转录激活, 2014.7-2014.12: 构建大鼠慢加急性肝衰竭模型～分析随着病程进展TNFα～NFκB～HIF1α的表达情况,在体外用抗体干预TNFα～NFκB～HIF1α之后～并进行慢加急性肝衰竭大鼠模型的生存分析～并检测其肝组织的病理改变,检测大鼠肝功能和血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平～以及肝细胞凋亡的情况,整理数据～统计分析和 撰写文章、投稿。 七、 现有工作基础和条件 申请者所在单位为高校附属医院～具备细胞生物学、分子生物学、动物学实验、病理免疫组化等实验所需的条件～具有PCR仪、曝光仪、酶标仪、高速低温离心机、细胞培养室等条件。本院有大量患者血液标本～并有相当数量慢加急性肝衰竭患者～为实验顺利开展提供了充足的病例以及样本。 本研究团队由副主任医师主导～本团队有成员既有丰富的临床肝衰竭防治经验～又有住院医师及研究生参与实验～团队合理。 八、经费预算与说明 总经费 5万元 设备费:0 万元 信息费:,.？万元 验收费:,.,万元 能源材料费:？.,万元 人 员费:, 万元 设计试验费:, 万元 会议调研费 ,.,万元 租赁费 ,万元 其他费用: ,.,万元 参考文献 1、中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会. 慢性乙型肝炎防治指南. 中华传染病杂志 2005; 23: 421-431. 2、Kim SH, Kim YS, Kang SS, et al. 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