实验二

DNA的酶切、回收、连接以及重组DNA的转化、鉴定 一、实验目的 学习利用限制性内切酶切割DNA的 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 ，并通过电泳检测酶切的效果。通过琼脂糖凝胶电泳中回收DNA片段，并将回收的目的片段与载体质粒片段进行定向连接，并将体外重组的DNA引入受体细胞，使受体菌具有新的遗传特性，并从中筛选出转化子。学习快速鉴定重组转化子的方法。以及掌握PCR的基本操作技术。 二、实验原理 目前已发现三类不同的限制性内切酶即I型、II型和III型。其中II型能专一识别碱基顺序，并在该处切断双链DNA，因而在基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 中得到广泛应用。DNA经限制性内切酶作用产生两种断裂状态：粘性末端或平末端。 酶切反应需Mg2+及其它一些辅助离子和一定的盐离子浓度，不同内切酶对盐离子有不同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量过高(>5%)，会使酶的识别位点发生改变，产生星活性(star activity)。绝大多数酶的反应温度37℃，也有个别要求在50 ~ 65℃。 回收目的片段的方法有多种，常用的有冻融法、低熔点琼脂糖法、透析袋法、电泳回收法、玻璃孔回收法等。本实验通过使用试剂盒来回收DNA  。 DNA连接酶催化两个双链DNA片段5’端磷酸和3’端羟基之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶主要有：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌连接酶两种。T4 DNA连接酶的底物可为：(1) 一条链带有缺口的双链DNA分子；(2) 两个存在互补粘性末端的双链DNA片段；(3) 两个存在平末端的DNA片段；(4) RNA－DNA杂合体中，具缺口的RNA和DNA分子。大肠杆菌DNA连接酶适当的底物只是带缺口的双链DNA分子和具有同源互补粘性末端的不同DNA片段，它不能催化平末端DNA分子之间的连接。用于克隆的质粒载体在酶切成线状后，一般需用碱性磷酸酯酶(CIP或BAP)进行去磷酸化处理，以防止载体自身环化，减少不含重组子的菌落产生。 把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化。当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最易发生。常用的转化方法是用CaCl2处理，被转化的细菌中，载体中抗抗生素基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。本实验所用重组DNA的载体带有E.coli中的-半乳糖苷酶基因 (LacZ)的调控序列和部分编码序列，编码区内插入了一个多克隆位点，进入宿主菌后可与宿主细胞之间实现-互补而产生Lac+，在生色底物X-gal存在下形成兰色菌落。如有外源DNA插入到质粒的该位点，则破坏了互补能力，菌落呈白色。 虽然大部分质粒载体都可通过蓝白色选择重组转化子，但在实际应用中往往有相当部分的白色克隆是不含插入子的。本鉴定方法是用碱性裂解液把转化子菌体裂解，然后直接用琼脂糖凝胶分离，通过比较白色和兰色转化子质粒的迁移率，鉴定出重组转化子。 三、实验 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 质粒pBluescript II（PSK）  目的基因MP3 四、仪器设备 分光光度检测仪              电泳仪            微型电泳槽 紫外透射检测仪              恒温培养箱  五、实验用具 微量取液器          微量离心管(0.5 ml1)        吸管头若干        点样板 六、试剂 限制性内切酶HindIII及对应的缓冲液(试剂商提供)    无菌双蒸水 10TBE电泳缓冲液      0.8%琼脂糖                载样缓冲液 七、实验步骤 1. 酶切：按下表配制酶解混合液   DNA 缓冲液(1/10 V) 10 l DNA 4~5 g 加双蒸水至总体积(V) 100 l 酶(HindIII) 40 U     混匀，37℃保温1.5 ~ 3小时，电泳前在4℃保存。 2. 电泳检测：取酶解液3~10 l电泳。 3. 切去含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶条带→称重为63mg→100mg琼脂糖对应100 g溶液的BD，向离心管中加入BD63g→60℃水浴8min,直至凝胶完全融化，期间要震荡摇匀3次→将上一步的溶液至于DNA纯化柱中，静置2min→12000rpm离心1min→加入500gPE，12000rpm离心1min，弃滤液→加入500gPE，12000rpm离心1min，弃滤液→12000rpm离心3min，以彻底出去纯化柱中的液体→将离心柱至于新的1.5ml的离心管中，向纯化柱的中央悬空滴加30-100gEluent（60℃预热），静置2min，12000rpm离心1min，管底即为目的DNA片段，贮存于-20℃处保存。 4. 载体的酶切和去磷酸化处理 (1) 在离心管中加入5 g psk质粒 DNA，10 l 10 HindIII缓冲液，加双蒸水至98 l，最后加入20 U HindIII酶。充分混匀，离心30秒，在37℃恒温水浴锅保温30分钟。 (2) 加入5 l 1M Tris-HCl (pH9.0)，2 U CIP，充分混匀，离心30秒，在37℃恒温水浴锅保温，60分钟。(加pH9.0的Tris-HCl缓冲液，目的是将pH7.5 ~ 8.0的酶切缓冲液的pH值调到适合CIP的pH8.5左右)。 (3) 温育结束时，加EDTA (pH 8.0)至终浓度为5 mM，混匀，于65℃加热60分钟(或于75℃10分钟)。然后用酚/氯仿抽提两次；上清液加0.1体积3 M醋酸钠，充分混匀，再加2.5倍体积的无水乙醇，充分混匀后于-20℃放置15分钟。12000 rpm离心15分钟，沉淀用冷70％酒精洗一次，风干后用40 l TE溶解(DNA浓度约为80~100 ng/l)。 5. 连接 在微量离心管中加入 载体DNA 1l (80~100ng) 目的片段DNA 50-100 ng ddH2O 加至8l     混匀，45 ~ 50℃，5分钟(使粘性末端分开） 加入10T4 DNA连接酶缓冲液1 l 用1连接酶缓冲液将连接酶稀释成0.2 Weiss单位或12 NEB单位/l 再加入已稀释的T4 DNA连接酶1 l 混匀，稍离心，在PCR仪上进行连接反应 65℃，5min，置于4oC保存备用 6 . 感受态细胞的制备 挑取E.coli DH5受体菌单菌落(2~3 mm)于有50 ml LB培养基的500-ml锥形瓶中。 37℃振荡(250rpm)培养约2.5小时(活细胞数不超过108个/ml)。 超净工作台上，倒入经消毒的50 ml离心管中，盖严。 在1L烧杯冰浴中放置10分钟，使菌液冷却至0℃。 4℃，4000 rpm离心10分钟收集菌体。 弃上清液，倒置在纸巾上1分钟。 加10 ml预冷的0.1 mol/L CaCl2 ，悬浮菌体。 冰浴25分钟。 离心（4℃，4000 rpm，10分钟）。 加入1.5 ml 预冷的0.1 mol/L CaCl2，小心悬浮 4℃冰箱保存过夜(12~24小时)。 7 . 转化 在1.5 ml离心管中加入   感受态细胞 ddH2O 连接物 载体质粒 重组质粒 空白对照 200 l 2 l 0 0 0 CK－(阴性对照) 200 l 0 0 1l (10 ng) 0 CK＋(阳性对照) 200 l 0 0   1 l(10 ng) 自我环化对照 200 l 0 2 l(不含插入子) 0 0 处 理 200 l 0 2 l 0 0             用吸管头温和混匀 冰浴30分钟 42℃，静置90秒 冰浴2~3分钟 加入800 l 37℃预热的SOC液体培养基 用1000-l取液器移至培养管，37℃摇动（200rpm）45分钟。 各取100~200 l涂板，将培养皿置于室温至液体被吸收。 倒置培养皿，37℃培养过夜. 观察转化结果(白色为阳性，蓝色为阴性) 8. 重组转化子的快速鉴定 用牙签从转化选择平板选取几十个白色和几个蓝色菌落，殖在LB平板上，37℃过夜。在96孔平板每孔加入20ul 10mM EDTA。用牙签挑取少量菌体(不能太多)，悬浮于各孔中(其中1~2孔是蓝色菌落作为对照)，将平板接触旋涡器几秒钟。加入20ul裂解液，将平板接触旋涡器几秒钟，静置5分钟。将等量的1M KCl和载样缓冲液混合，各孔中加入6ul，将平板接触旋涡器几秒钟。按蓝色菌落，白色菌落......最后蓝色菌落的顺序，各取20~30ul点样。电泳，观察。与蓝色菌落质粒迁移率比较，可判别白色菌落的重组质粒是否含有插入子。 9.PCR反应 (1) 模板DNA的抽提：按碱裂解法抽提得到质粒DNA。 (2) PCR操作： PCR反应混合液的配制 （n为反应数）： n x 2.0 l反应缓冲液(含15 mM MgCl2) n x 1.0 l dNTPs (2 mM) n x 1.0 l上游引物(5 M) （引物在反应液中的浓度通常为0.2~0.5M） n x 1.0 l下游引物(5 M) n x 0.5~0.8单位Taq酶 加无菌水至总体积 n x 19 l 每个PCR管中加入19 l反应混合液，1 l稀释质粒DNA（约2 ng），再加2滴矿物油，防止水分蒸发。稍离心。 含有重组质粒的菌体也可直接用于PCR扩增：用牙签点取少量菌体在空的PCR管底部插几下，加入反应混合液和滴矿物油即可。注意：菌体不可太多，太多的菌体(即杂质)会抑制Taq酶的活性。 (3) PCR反应过程：94℃，1 min(预变性，可用STOP键或Pause键进行) 94℃，30 S 55℃，1 min    35个循环 72℃，2 min 72℃，5 min (4) PCR产物的检测：取5 l PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳，然后放在紫外检测仪下观察，记录结果。 八、实验结果与 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 1.目的片段酶切电泳检测结果 从琼脂糖凝胶电泳中可以看出酶切出的目的片段很弱，可能为以下几方面的因素：（1）抽提的目的基因的质量较差；（2）样本存在多个酶切位点，因此切出几条弱带甚至弥散；（3）目的DNA携带酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，可能干扰了限制性内切酶的活性；（4）DNA的甲基化程度对酶切的影响；（5）没有正确使用和保存酶而导致酶的活性丧失。酶需要保存在-20度的低温环境中，只是在需要用酶才从冰箱中取出来。临时存放时需要将酶至于冰上。手拿酶管时不要接触酶管下步含酶的部分，移酶时尽可能用长TIP, 避免污染。用完后需要及时送回原处；（6）注意模板用量和反应体积的关系。模板浓度过高，溶液黏度过大，酶不能有效扩散，酶切效果不会好。浓度过低，也会影响酶活性。