雨生红球藻（Haematococcus

雨生红球藻（Haematococcus 雨生红球藻(Haematococcus 第37卷第5期 2006年9月 海洋与湖沼 OCEANOLOGIAETLIMNOLOGIASINICA V01.37.No.5 Sep.,2006 雨生红球藻(Haematococcuspluvialis) 破壁 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 对虾青素提取率的影响术 周湘池刘必谦曾庆国蒋霞敏 (宁波大学生命科学与生物工程学院宁波315211) 十(宁波市海洋与渔业研究院宁波315012) 提要采用匀浆法,冻融温差法,超声波法,直接研磨法和低温研磨法等5种破壁方法,研 究了雨生红球藻提取虾青素时破壁方法对虾青素提取率的影响.结果表明,对雨生红球藻进 行破壁是必要的.其中匀浆法,冻融温差法,超声波法,直接研磨法和低温研磨法等的最佳破 壁条件为:匀浆法破壁时间22min,水为介质;冻融温差法破壁温度为一70~C,时间为12h,冻 融2次,水为介质;超声功率400W,每次超声时间5s,共超声25rain;直接研磨法研磨时间 1rain;加液氮低温研磨法破壁2次,每次时间0.5rain;虾孛素的提取率依次为0.76%,0.93%, 1.03%,1.51%和3.21%.匀浆法和超声波法破壁由于要使用溶剂或介质,对后续的虾青素 提取和分离会有影响,而直接研磨法在破壁过程中产生高温,降低了虾青素的生理 活性,所以 它们都不是雨生红球藻破壁的最佳方法.加液氮低温研磨法在破壁过程中不添加 化学试剂, 不产生污染,能最大限度地保留虾青素的生理活性,是所选方法中最好的一种. 关键词雨生红球藻,虾青素,细胞破壁,虾青素提取 中图分类号Q946 虾青素(Astaxanthin)是唯一能通过血脑屏障 的类胡萝卜素,其化学名是:3,3?二羟基?4,4?二 酮基?p?胡萝卜素;分子式(通式)是:C.H:0;分 子量为596.86;虾青素分子由4个异戊二烯单位 以共轭双键形式连接,两端义有2个异戊二烯单 位组成六节环结构.虾青素具有水溶性和亲脂 性,易溶于二硫化碳,丙酮,苯和氯仿等有机溶 剂,化学性质活泼,易于氧化,氧化后变为虾红素 (朱明军等,2000).在虾青素分子中,有很长的 共轭双键,有羟基和在共轭双键链末端的不饱和 酮,其中羟基和酮基又构成?羟基酮.虾青素的 结构特点使其极易与自由基反应而清除自由基, 起到抗氧化作用(范荣新,2000).研究表明(Miki, 1991),虾青素的抗氧化性比B?胡萝卜素高了10 倍以上,同时它还比维生素E的抑制脂质过氧化 反应特性高100倍以上,被誉为"超级抗氧化 剂",可显着提高人体的免疫力,具有显着的抗疲 劳和抗衰老作用,天然虾青素的稳定性,抗氧化 活性,生物利用安全性及生物效价等性能均显着 优于人T合成产品,鉴于虾青素卓越的生理功 能,其已被广泛应用于食品,医药,化妆品及水产 养殖业中. 雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)是一种 单细胞微藻,隶属绿藻门,团藻目,红球藻科,红 球藻属(殷明焱等,1998),是公认自然界中生产 天然虾青素的最好生物来源,在极佳的培养条件 下,雨生红球藻的虾青素含量可达3%以上,远高 于红酵母和其他微生物,因此利用雨生红球藻提 取虾青素,具有广阔的发展前景,极具大规模工 业化生产潜力,已成为各国研究的热点.但是由 于其细胞壁较厚,加大了从中提取虾青素的难 度,也降低了藻粉直接作饵料的利用率.所以在 浙江省自然科学基金资助项目,301208号.周湘池,副研究员,E—mail:zhouxiangchi@nbu.edu.cn 1)通讯作者:刘必谦,研究员,E—mail:lbqhy@nbu.edu.cn 收稿13期:2004—12-07,收修改稿13期:2005—04—22 5期周湘池等:雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)破壁方法对虾青素提取率的影响425 使用前必须将其细胞壁进行破碎(破壁)(Sommer etal,1991). 目前藻类常用的破壁方法主要有:机械研磨 法(Bubrick,1991),酶法(Mendes—Pintoetal, 2001)和化学法(Gudinetal,1994;Judithetal, 2004).在这几种方法中,研磨法对原料营养成 分的损失较少;酶法破壁增加了后续分离的难 度;化学法研究时问长,方法比较系统,破壁效果 也不错,但其过程中用了有机溶剂,不但成本高, 工艺复杂,且不够环保,不能达到食品生产的绿 色标准. 本文中比较了匀浆法(薛艳华等,2004),冻 融温差法,直接研磨法,超声波法(卢群等,2003; Katsudaetal,2004)和低温研磨法等五种破壁方 法对雨生红球藻中虾青素提取率的影响,旨在从 中选出最优化的破壁处理条件. l材料与方法 1.1材料 雨生红球藻(Haernatococcuspluvialis)由宁波 大学水产系藻种室提供;虾青素标准样品购自 Sigma公司. 1.2方法 1.2.1吸收曲线的绘制用三氯甲烷配制一 定浓度的虾青素标准溶液,用可见与紫外分光光 度计扫描不同波长下的吸光度,确定测定虾青素 的最佳波长. 1.2.2标准曲线的绘制配制一系列浓度不 同的虾青素标准溶液,分别在最佳波长下测定吸 光度.以标准溶液浓度为横坐标,以吸光度为纵 坐标作图,得标准曲线或工作曲线. 1.2.3雨生红球藻提取物粗品中虾青素含量的 测定将各破壁条件下的样品用三氯甲烷提 取,稀释定容,在最佳波长下测定吸光度. 1.2.4T艺 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 雨生红球藻收集一离心 (?3600r/min)一冷冻干燥一破壁一提取一三氯 甲烷定容一虾青素含量测定. 1.2.5破壁方法 (1)匀浆法:准确称取一定量的雨生红球藻 样品,加入适量的水,置匀浆机中匀浆,用三氯甲 烷提取,稀释定容,备用. (2)冻融温差法:准确称取一定量的雨生红 球藻样品,加入适量的溶剂,于低温下冷冻,再于 室温下解冻,如此反复一定次数后,用三氯甲烷 提取,稀释定容,备用. (3)超声波法:准确称取一定量的雨生红球 藻,加入适量的三氯甲烷,用频率为2×10一2× 10Hz的超声波进行超声处理,稀释定容,备用. (4)直接研磨法:准确称取一定量的雨生红 球藻样品,置研磨器中研磨1min,加入适量的三 氯甲烷提取,稀释定容,备用. (5)低温研磨法:准确称取一定量的雨生红球 藻样品,置研磨器中加液氮研磨0.5rain,重复一 次.加入适量的j氯甲烷提取,稀释定容,备用. 2结果与讨论 2.1吸收曲线 用三氯甲烷配制一定浓度的虾青素标准溶 液和红球藻提取物溶液,测定在不同波长下的吸 光度(图1,图2).结果表明:虾青素在波长 450--540nm巾有一吸收带,其最大吸收波长 为486nm. 图1虾青素标准品的吸收曲线 Fig.1Standardabsorptioncurveofastaxanthin 波长/nnl 图2雨生红球藻提取物的吸收曲线 Fig.2Absorptioncurveofastaxanthinextractedfrom .pluvialis 2.2标准曲线 用一系列不同浓度的虾青素标准溶液分别 426海洋与湖沼 在486nm波长下测定其吸光度值.以标准溶液 浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标作图(图3). 图3虾青素标准溶液在486nm波长下的吸光度 Fig.3Standardabsorbencyofastaxanthinin 486nmwavelength 2.3匀浆破壁法虾青素的提取率 匀浆法是利用螺旋桨施加的搅拌离心力,挤 压力,剪切力(或固体原料与液体溶剂之间的摩 擦力)对细胞进行搅拌进而破碎细胞壁.由实验 可知:匀浆破壁时间超过22min后,虾青素提取 率曲线斜率变化缓慢,故再延长时间,对提取率 无明显影响,因此,得出匀浆法破壁最佳时间为 22min,此时虾青素的提取率约为0.76%(图4). 匀浆法破壁的效果不是很好,而且匀浆过程 中产生苗温,很容易使虾青素氧化而破坏其生理 活性,故此法不适宜虾青素的提取. \ 褂 图4匀浆破壁法虾青素提取率(%) Fig.4Theextractionratef%)ofastaxanthin inhomogenatemethod 2.4冻融温差法破壁时虾青素的提取率 冻融温差法是利用细胞温度的骤冷骤热变 化导致细胞热胀冷缩从而达到破壁效果.本实 验中从选取冻融温度,时间,作用方式及溶剂 等四因素,做出4因素3水平的正交分析,冻 融时,采用9组不同条件的实验进行比较,结 果见表1. 表1利用冻融温差法破壁获得的虾青素提取率 Tab.1Theextractionrateofastaxanthininfi'eezing—thawingmethod 5期周湘池等:雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)破壁方法对虾青素提取率的影 响427 实验结果表明,对实验结果影响的显着性 从大到小依次为:温度,加入的溶剂种类,方式, 时间. 从正交表可以得到此时的最佳破壁条件:温 度为一70?,时间为24h,方式为冻融3次,加入 的溶剂为水.考虑到一些实际操作因素和经济 成本,将最佳破壁条件调整为:温度为一70?,时 间为12h,冻融2次,加入溶剂为水,此时虾青素 的提取率约为0.93%. 冻融温差法的优势在于设备简单,操作比较 容易,适合较大规模的生产,适合于对光和热较 敏感的生理活性物质的提取,但该法对雨生红球 藻的破壁效果一般. 2.5超声波法破壁时的虾青素提取率(功率 400W,时间5s,间隙9s) 长 槲 t/rain 图5超声波法破壁时虾青素提取率 Fig.5Theextractionrateofastaxanthinin ultrasonicmethod 由图5可知,随着超声时间的增长,虾青素 提取率增加,但超声破壁时间超过25min后,提 取率曲线斜率变化缓慢,故再延长时间,对提取 率无明显影响,因此,认为超声波法破壁时问以 25min为佳,此时虾青素的提取率约0.96%,最高 时已超过1.0%. 超声波是一种频率为2×10一2×10Hz的 声波,具有热效应,机械效应和空化效应,可有效 地破除溶质中的细胞壁,利用超声波可以集破壁 与提取于一体,强化溶剂提取过程,缩短提取时 问,提高提取率.超声波对雨生红球藻的破壁效 果较好,但因其破壁过程中产生高温,为了避免 虾青素氧化,实际操作时要采用冰浴,不太适合 大规模提取;同时破壁介质与提取时的溶剂要一 致,否则不利于目标产物的分离和纯化,影响产 品质量;虾青素在有机溶剂中的溶解度较大,若 破壁过程中采用了有机溶剂,则虾青素的提取方 法就只能是溶剂法了,这将限制后续的提取方法 的选择,如虾青素的二氧化碳超临界流体萃取. 若破壁时采用了有机溶剂(乙醇除外),则提取的 虾青素就不是绿色或有机产品,使其附加值大 大降低.因此,超声波法不适合于雨生红球藻 的破壁. 2.6研磨法破壁时虾青素的提取率 由表2可知,用研磨法进行破壁的效果较 好,直接研磨破壁时虾青素的提取率能达到 1.5%左右,但直接研磨时产生高温,且研磨时间 长,破壁后部分虾青素暴露在空气中容易被氧化 而破坏其生理活性,故不适合于雨生红球藻的破 壁;加液氮低温研磨破壁后提取率能达到3.2% 以上,是所选方法中最好的一种.因为液氮的温 度为一196?,液氮挥发时使被研磨物变脆而使 研磨时间变短,所以低温研磨破壁法集中了研磨 法和温差破壁两种方法的优点,且使温差变得更 大,因而使破壁更有效,且操作简单.破壁过程 中不添加化学试剂,不产生任何污染,是一种全 物理的破壁方法.若能设计特制接口,将破壁后 产物直接输送至二氧化碳超临界流体萃取仪的 萃取釜,则提取的虾青素可保持最大限度的生理 活性和最高的提取率. 表2研磨法破壁时虾青素的提取率 Tab.2Theextractionrateofastaxanthiningrindingmethod 428海洋与湖沼37卷 2.7各种破壁方法下虾青素提取率(分光光度 测定) 由表3可得,各破壁法组与空白组问以及低 温研磨法与其他破壁法组问,行检验均P<0.01, 差异很显着,且其均数问差异较大,表明各种破 壁法均有较好的效果.而低温下机械研磨法的 破壁效果最佳. 表3几种破壁法破壁结果 Tab.3Comparisonamongtheresultsofseveral cell—wallbreakingmethods 3结论 3.1从雨生红球藻中提取虾青素时,对其进行 破壁是必要的. 3.2在本实验所选破壁方法中,按匀浆法,冻融 温差法,超声波法,直接研磨法和低温研磨法的 顺序,破壁效果依次增强,虾青素的提取率分别 为0.76%,0.93%,1.03%,1.51%和3.21%,其 中以低温研磨法为最好. 3.3低温研磨法是雨生红球藻的较理想的破壁 方法,破壁过程不影响虾青素的生理活性,无化 学溶剂污染,破壁成本较低,工艺流程简单,适合 于大规模生产.若能结合二氧化碳超临界流体 萃取虾青素,则能最大限度地保留提取物的生理 活性. 参考文献 卢群,丘泰球,胡爱军,2003.超声强化法提取海藻油的 研究.广东药学院,19(2):104—105 朱明军,宗敏华,吴振强等,2000.虾青素研究进展.食品 工业科技,21(2):79—81 范荣新,2000.虾青素的性质与开发.海湖盐与化工, 29(6):17—19 殷明焱,刘建国,张京浦等,1998.雨生红球藻和虾青素研 究述评.海洋湖沼通报,2:53—62 薛艳华,史权,庞海河等,2004.灵芝孢子几种破壁方法 比较分析.植物研究,24(4):216—218 BubrickP,1991.ProductionofastaxanthinfromHaematococ— cBioresTechnol,38:237—239 GudinC,TrezzyC,MaillardP,1994.Methodforextracting carotenoids.Particularlyastaxanth,fromacultureof microalgae.PCTIntAppl,94/23057:105 JudithRD,KlausD,TangCSetal,2004.Pressurizedfluid extiactionofcarotenoidsfromHaematococcuspluvialis andDunaliellasalinaandkavalactonesfromPiper methysticum.AnalyticaChimicaActa,501:175—181 KatsudaT,LababpourA,ShimaharaKetal,2004.Astaxan— thinproductionbyHaematococcuspluvialisunderillumi— nat'~onwithLEDs.EnzymeandMicrobialTechnology, 35:81—86 Mendes—PintoMM,RaposoMFJ,BowenJetal,2001.Eval— uationofdifferentcelldisruptionprocessesonencysted ce1)sofHaematococcuspluvialis:effectsonastaxanthin recoveryandimplicationsforbio—availability.Journalof AppliedPhycology,3:19—24 MikiW.1991.Biologicalfunctionsandactivitiesofanimal carertenoids.Pure&ApplChem.63:141—146 SommerTR,PottsWT,MorriseyNM,1991.Utilizationof microalgaeastaxanthinbyrainbowtrout(Oncorhynchus mykiss).Aquaculture,94:79—88 5期周湘池等:雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)破壁方法对虾青素提取率的影 响429 THEBESTCELL-WALLBREAKINGMETHODFOREXTRACTING ASTAXANTHINFROMHAEMAToCoCCUsPLUVIALIS ZHOUXiang—Chi,LIUBi—Qian,ZENGQing—Guot.JIANGXia—Min (FacultyofLifeSciencesandBiotechnology,NingboUniversity,Ningbo,315211) 十(InstituteofOceanandFishersofNingboCity,Ningbo,315012) AbstractAstaxanthin,anaturallyoccurringcarotenoidpigment,isapowerfulbiologicalantioxidantthat exhibitsstrongfreeradicalscavengingactivityandprotectsagainstlipidperoxldatlonandoxidativedamage. Astaxanthinhasbecomeafocusofresearchwithgrowingnumberofscientificpublications ,andbeapplied broadlyinthefieldsoffood,medicineandaquaculture. Haematococcuspluvialis,atypeofmicroscopicgreenalgae.isoneofthemostimportantnaturalsources ofcarotenoidastaxanthinbeingusedasapigmentorinaquaculture.However.theastaxanthinextractionfmm H.pluvialisisaffectedbythicksporopollenincellwallofitscysts. Therefore.breakingupthece11wa11is necessaryintheprocedureoftheextraction.Wetestedfourdifferentcell— wallbreakingmethodsforcomparing theextractionefficiency,includinghomogenization,freezing— thawing,uhrasonicatingandmortar—grinding. Foreachmethod,theoptimalconditionwasexaminedalongwiththecorrespondingextractionratecalculated simultaneously.Theresultsshowedthat22一 minutehomogenizationwaslongenoughtobreakupthecellwalls andcouldreachtheextractionrateof0.76%.Forthefreezing—thawingmethod. H.pluvialiswasfrozenat 一 70? inwaterfor12hours,thenthesamplewastakenoutfromtherefrigeratorandthawedatroomtemDer— ature.Thisprocedurewasrepeatedfortwotimes;theextractionratewas0. 93%.Inuhrasonicmethod.the samplewastreatedin(2x10)Hz一 (2x10)Hzpowerofultrasoundfor25minutes.Thismethodreached theextractionrateat1.03%.However,theuseoforganicsolventinthehomogenatemethodandultrasonic methodwouldcauseanegativeimpactonextractionandpurificationofastaxanthin. Forthegrindingmethod,mortar— grindingthesamplefor1minutewasproperfortheextractionofastax— anthin,reachingtheextractionrateat1.51%.Besides.themethodislessexpensiveandsimplesothatitis applicableforlarge— scaleproduction.Theonlysideeffectistheheatthatproducedduringthegrinding,which coulddestroythebiologicalactivityofastaxanthin.Toavoidit,liquidnitrogenwasappliedduringgrindingto reducetheairoxidationofastaxanthin,whichenhancedtheextractrateto3.21%.Thus.thegri ndingmeth— odatlowtemperatureisrecommended.Infuture,thefollow— upworkwilltestthecombinationofthegrinding withcarbondioxidesupercrlticalfluid,toprotectinmaximumthebiologicalactivityofastaxa nthin. KeywordsHaematococcuspluvialis,Astaxanthin,Cell— wallbreaking.Astaxanthinextraction