医药学论文-肠道病毒71型分子生物学研究

医药学论文-肠道病毒71型分子生物学研究 作者:林馨 韩关根 【摘要】 就有关EV71病毒生物学特征、病毒的复制、诊断技术、EV型别鉴定及分子流行病学等方面作一综述。 【关键词】 肠道病毒 71型 基因型 分子流行病学 Abstract: It makes review on EV 71 intestinal virus about its biological characteristic, replication, diagnosis technology, EV type identification and molecular epidemic science. Key words: intestinal virus; EV 71; gene type; molecular epidemic science 近年，肠道病毒71型(EV71)感染在世界各地不断出现爆发流行的报道。EV7I感染主要引起手足口病，但所致的神经系统并发症可导致死亡或永久性肌麻痹。本文从有关EV71病毒生物学特征、病毒的复制、诊断技术、EV型别鉴定及分子流行病学等方面作一综述。 1 病毒的一般特征 1.1 病毒颗粒结构及理化性质 肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员,1,。EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24,30nrn，核酸为单股正链RNA。病毒粒子的衣壳组成非常复杂，首先由VPI、VPZ、VP3和VP4四种外壳蛋白构成原聚体(Protomer)，再由5个原聚体拼装成具有五聚体样结构的亚单位(Pentamer)。四种结构蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其他三种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于VPI.VP3上(见图1)。由于病毒颗粒没有类脂性的包膜，所以对去污剂、乙醚、脱氧胆酸盐以及弱酸有抵抗力，此外，该病毒还能抵抗70%乙醇和5%甲酚皂溶液等常见的消毒剂，这些都决定了该病毒较强的野外生存能力。EV71病毒对高温(50?以上)及紫外线的抵抗能力较差。 图1 肠道病毒粒子及外壳蛋白的结构(略) 1.2 基因组结构,2, EV71基因组为7408个核苷酸的单股正链RNA，腺嗓吟核苷酸和尿嘧啶核苷酸丰富(A+U=52.8)，病毒的的单链具有侵染性。基因组中仅有一个开放阅读框(ORF)，编码含2193个氨基酸的多聚蛋白(Polyrotein)，在其两侧分别为746个核苷酸的5’-非编码区(UTRs)和83个核苷酸的3’-非编码区。在3’-非编码区的末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴(poly A)，而其5’末端共价结合有一个小分子量的蛋白(VPg)。该多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P3三个前体蛋白，Pl前体蛋白编码IA(多肽VP4)、IB(多肽VP2)、IC(多肽VP3)、ID(多肽VP4)四个病毒外壳蛋白;P2前体蛋白编码ZA(特异性蛋白酶)、2B、2C;P3前体蛋白编码3A、VPg(5’末端结合蛋白)、3C(特异性蛋白酶)、3D(RNA多聚酶组份)。病毒的单链RNA具有感染性。病毒RNA正链和负链的5’末端和3’末端非编码区中分别含有多肽翻译的起始信号以及RNA合成起始信号。VPg蛋白通过其酪氨酸残基的轻基基团与RNAS’末端的pUPU形成磷酸二酷键与基因组RNA结合。5’ UTR通常折叠成多个特异性的空间结构，这些结构通过与宿主细胞蛋白因子的结合在起始病毒基因组RNA的合成以及病毒蛋白的翻译的过程中发挥重要作用。此外，5’UTR结构还涉及病毒的宿主范围和病毒的毒力等多个方面的功能。EV71病毒基因组3‘UTR区和多聚腺苷酸尾的功能目前尚不清楚。 2 病毒的复制 EV71基因组的复制类似于其它正链RNA的病毒。当病毒基因组编码的RNA聚合酶3C完成翻译和加工后，病毒基因组便开始进行复制。病毒基因组RNA首先作为mRNA合成病毒蛋白，然后再作为模板在病毒RNA聚合酶的作用下合成负链RNA。后者又作为模板在细胞内质网进一步合成大量的正链RNA。体外实验证实:病毒基因组的复制至少需要病毒RNA聚合酶3C、末端结合蛋白VPg以及一种以上的宿主细胞蛋白。随着大量病毒正链RNA在细胞浆内的堆积，病毒开始进入子代毒粒的组装阶段。由于蛋白酶3C或3CD的增多以 及活性的增强，加速了Pl前体蛋白的切割。其产物构成的原聚体组成五聚体，并进一步包装病毒VPg一阴A形成病毒子粒,2,。一般情况下，肠道病毒的原病毒毒粒无感染性，经过蛋白酶的再加工(水解切割P1，产生钾1一4多肽)才产生有感染性的病毒粒子,3,。 3 EV的诊断技术 3.1 核酸杂交技术 由于EV各型间存在序列高度保守区,利用针对此保守区的通用互补脱氧核糖核酸(cDNA)核酸探针可进行大范围的EV诊断,4,。杂交技术已能成功地检测出可疑病例临床标本中的EV RNA,5,,而且原位杂交技术可以提供病毒感染的组织细胞分布及其与炎症和坏死之间的关系的信息,6,。但是核酸杂交技术过程较复杂,且敏感性不太高,特别当用于检测脑脊液中RNA时。 3.2 逆转录(RT) PCR技术 根据EV属特异性的高度保守序列设计其通用引物,为提高其检测敏感性,进行套式PCR能够检出包括无法进行细胞培养和定型的大部分EV分离物,还可直接从临床标本中检测EV核酸,整个过程一般在5h左右完成,7,。周世力,8,利用逆转录聚合酶链式反应(RT PCR)方法扩增得到肠道病毒71型(EV71SHZH03)外壳蛋白VP1基因,经序列测定证实后,构建重组表达质粒VP1/pPIC9K,转化Pichiapastoris酵母宿主菌GS115,以Myc Tag多克隆抗体作为一抗,利用双层滤膜法筛选酵母转化子,甲醇诱导表达。SDS PAGE分析显示:表达产物的分子量约为30 000,与天然VP1大小一致;表明,表达上清液可与EV71患者急性感染期血清呈阳性反应,表明重组蛋白VP1具有免疫原性。 作者:林馨 韩关根 4 EV型别鉴定 诊断后其型别鉴定的方法主要有:将PCR结合细胞培养进行型别鉴定或者对PCR产物进行限制性酶切片段长度多态性分析或进行单链构象多态性分析(PCR SSCP)或进行基因序列测定与遗传性分析等来定型分类。而在结构蛋白编码区,据Oberste等研究,VP1区核酸序列与决定血清型的抗原决定因子密切相关,根据VP1区序列进行分型结果与中和试验鉴定结果一致性较好,与血清型相关性较其它结构蛋白编码区高,9,。但也有研究表明VP4的分型结果与血清也较一致,且因其核酸序列较短(VP4207nt,而VP1834,951nt),应用更为便利,10,。Oberste等根据对EV遗传性分析的结果,提出根据VP1基因全长或部分序列同源性大小进行型别判定的标准。将被检序列与含所有EV血清型参考株序列的数据库(如Genbank)进行比对,如果被检株序列与某一型参考株同源性最高且>75%,同时与同源性位居其次的另一型参考株同源性<70%,则可判定被检株与最高同源性参考株为同一血清型;如果最高同源性<75%或者第二同源性>70%,则型别判定有待于进一步研究确定;如果最高同源性<70%,则为一新血清型,11,。周世力,12,将扩增得到的肠道病毒71型外壳蛋白VP1基因克隆到测序载体pGEM T,测序验证该序列为目的片段后,将目的基因克隆到原核表达载体pGEX 5x 1中,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,产物经SDS PAGE分析和Western blot验证。结果表明,在经IPTG诱导的BL21中检测到分子量与预期大小相符的大约60kDa的融合蛋白。利用表达产物作为抗原,对EV71感染病人阳性血清的检测初步证实,重组蛋白VP1可以作为检测EV71感染的检测用抗原。见图2,4。唐启慧,13,在成功克隆肠道病毒71型广州株EVGZ06全长VP1蛋白基因并测序的基础上,将部分VP1蛋白基因克隆到表达载体pET28a(+)上,构建了重组表达质粒pET28a(+)/(502,891)VPI,转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,利用Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western blotting和ELISA方法检测其抗原性。结果重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达,SDS PAGE显示其相对分子质量为19 000,与预计大小一致。ELISA和Western blotting实验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。 图2 重组表达载体pGEX 5x 1/VP1结构(略) 图3 SOS PAGE电泳分析表达(略) 图4 Western Blot鉴定原核表达的EV71 VP1蛋白(略) 5 分子流行病学 目前EV71分子流行病学主要研究 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 是VPI基因、VP4基因 和5’价R区的变异。其中，VPl基因最具研究价值，这是因为:(1)VPI蛋白是主要的病毒中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性(Oberste等，1999);(2)VPI基因具有与病毒血清型完全对应遗传多样性;它不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据，而且可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考。周世力,14,对SHZH03株、SHZH98株、亚洲流行株(台湾98年、日本99年、及新加坡2000和2001年流行株等)以及一部分欧洲流行株等的结构蛋白基因进行遗传进化分析。方法在对肠道病毒71型中国(深圳)分离株SHZH03进行全基因组序列测定的基础上,利用DNA STAR软件对结构蛋白基因进行遗传进化分析。结果SHZH03和SHZH98与亚洲流行株中的台湾98流行株、日本99流行株的遗传距离较近,而与新加坡2000和2001年流行株的遗传距离较远;SHZH03株与一些欧洲流行株有较大的差异。结论我国深圳地区流行的肠道病毒71型有可能来源于台湾1998年EV71大规模流行时的毒株。崔爱利,15,2002,2003年从上海市和重庆市手足口病患儿的疱液标本中分离到10株病毒,其中上海9株,重庆1株。利用两对分别针对EV71和Cox.A16病毒VP1区的特异性引物,用RT PCR方法对病毒进行初步鉴别。根据PCR所用引物及PCR扩增出的产物片段大小不同,可初步判定出EV71和Cox.A16病毒的血清型别。提示,上海分离到的9株病毒中,有2株为EV71,其余7株病毒为Cox.A16;重庆分离到的1株病毒为EV71。10株病毒的RT PCR产物经序列测定和分析证实,PCR定型结果正确,说明PCR法具有很高的特异性,可作为EV71初步鉴定的首选方法。对所分离的3株EV71病毒进行VP1区编码基因全序列的测定和遗传学分析,通过同源性比较和构建系统发生树发现,此3株EV71病毒和中国大陆已发表的7株EV71病毒(SHZH03、SHZH98、SH F1、SH F2、SH H25、SH H26和CHN 87)全部属于C基因型,与该型代表株比较,同源性为89.3%,94.6%;与A、B基因型代表株比较,同源性为81.3%,84.0%,差异较大。在C基因型中,此3株EV71病毒和中国大陆先前分离的6株病毒(SHZH03、SHZH98、SH F1、SH F2、SH H25、SH H26)的同源性较高,在94.5%,100%范围内。在系统发生树上,这9株病毒形成一个较独立的分支。与CHN 87株的同源性在92.1%,93.6%之间。与已知的C1、C2、C3亚型代表株比较,同源性在89.3%,92.9%,差异?7%,因此认为可将这9株病毒划分为C4亚型。上海、重庆和深圳的EV71病毒有较高的同源性,提示该病毒EV71 C4亚型在中国大陆1998,2003年间有较广泛的传播。杨帆,16,对肠道病毒71型中国(深圳)分离株SHzH98基因组建立了覆盖全基因组的5个首尾重叠的克隆，并在此基础上进行了全基因组(未包括多聚腺普酸尾)7408个碱基的核普酸序列测定。数据分析表明，SHZH98株与其他EV71毒株相比，5‘UTR和3’UTR的长度和序列有一定的差异。同源性分析发现，与免疫源性密切相关的PI结构蛋白基因与台湾流行株的同源性最高，与欧美流行株的同源性较低，PZ，P3区非结构蛋白基因的同源性与CoxsakiEVirusA16及MS，BrCr株较高，而与台湾流行株相比则较低。遗传进化分析发现，SHZH98株结构蛋白基因与台湾流行株亲缘关系较近，而非结构蛋白基因与CoxsakiEVirusA16及MS，BrCr株的亲缘关系较近。见图5。 图5 EV71 SHZH98株基因结构示意图(略) 综上所述，目前EV71感染仍然是全球威胁性较大的病毒性疾病之一，尤其在东南亚其危险性更大，但到目前为止，病毒的变异较大，其不同型别或同一型别在不同时间、不同地区乃至不同个体引起了不同的临床表现，EV71众多的病毒型别是怎么形成的，其基因组测序的结构的差别和病毒功能的关系是什么尚不清楚。目前不同型别病毒全基因测序在增多，病毒基因结构和功能的关系应是当前的热点。 【参考文献】 ,1, 金奇.医学分子病毒学,M,.北京:科学出版社,2001:606 613. ,2, 周世力.肠道病毒71型基因组研究和sARs冠状病毒结构蛋白的鉴定与分析,D,.华中农业大学,2003,11. ,3, Zoll 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