微丝骨架解聚剂在小麦-黄瓜白粉菌非寄主互作中的作用（可编辑）

微丝骨架解聚剂在小麦-黄瓜白粉菌非寄主互作中的作用（可编辑） 微丝骨架解聚剂在小麦-黄瓜白粉菌非寄主互作中的作 用 中国农业科学 2011,442: Scientia Agricultura Sinica 微丝骨架解聚剂在小麦-黄瓜白粉菌非寄主互作中的作用 郝心愿,李红莉,禹 坷,宋晓贺,马 青 (西北农林科技大学植物保护学院/陕西省农业与分子生物学重点实验室,陕西杨凌 712100) 摘要:【目的】阐明微丝骨架在小麦非寄主抗病性中的作用。【 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 】以小麦-黄瓜白粉菌非寄主互作体系为 研究对象,通过台盼蓝、DAB 和考马斯亮蓝染色法研究了小麦叶片经微丝骨架解聚剂处理后过敏性坏死、H2O2及乳 突形成的变化。 【结果】黄瓜白粉菌在小麦叶面上萌发明显滞后且附着胞多畸形。药剂处理后,过敏性坏死反应和 H2O2的产生及乳突的形成均明显受抑,产生率均显著降低。白粉菌的侵入率明显提高,并且能形成吸器,偶尔还产 生次生菌丝。【结论】微丝骨架参与了小麦的非寄主抗病性反应,骨架的聚合为抗病性反应的发生所必须。 关键词:细胞骨架;微丝解聚剂;非寄主;小麦;过敏性坏死反应;H2O2 Roles of Actin Polymerization Inhibitor in the Non-Host Interaction of Wheat-Sphaerotheca fuliginea HAO Xin-yuan, LI Hong-li, YU Ke, SONG Xiao-he, MA Qing College of Plant Protection, Northwest Agriculture and Forestry University/Shaanxi Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture, Yangling, Shaanxi 712100 Abstract:【Objective】The roles of microfilaments in the non-host resistance of wheat were elucidated in the study.【Method】 Hypersensitive response HR, H O and papilla formation of the wheat leaves treated with actin polymerization inhibitor before 2 2 inoculation of Sphaerotheca fuliginea conidia were investigated in the non-host interaction of wheat-S. fuliginea through trypan-blue, DAB, and coomassie brilliant blue staining, respectively. 【Result】 The results showed that the conidial germination of S. fuliginea was significantly delayed on the wheat, and the majority of the appressoria were malformed. Treated with cytochalasin A, the production of HR and H O , and the papilla formation on wheat leaves were severely suppressed and the incidences of them were 2 2 markedly reduced, but the penetration incidence of S. fuliginea conidia was greatly increased and the conidia were able to form haustoria, even to form secondary hyphae occasionally【Conclusion】 It was concluded that the microfilaments are concerned with the non-host resistance response of wheat, and the polymerization of the microfilaments is essential to the resistance responseKey words: cytoskeleton; cytochalasin; non-host; wheat; hypersensitive response; H O 2 2 [3-4] 聚集,呈辐射状 。对细胞骨架在非寄主互作中作用 0 引言 的研究将以全新的角度揭示抗病机制乃至非寄主抗病 【研究意义】细胞骨架是近年来新发现的在植物 性的本质。【前人研究进展】 为深入研究细胞骨架在植 细胞防卫反应中起重要作用的三维网状结构,主要由 物抗病反应中的作用, 细胞骨架抑制剂如 Cytochalasins、 [2] 微丝、微管和中间纤维构成,在植物生命活动中担负 Phalloidin 和 Oryzalin 等被广泛应用 。Kobayashi [1-2] [5] 着复杂的生理功能 。细胞骨架的聚合状态与植物抗 等 利用多种微丝、微 管抑制剂处理大麦胚芽鞘细胞, 病反应的发生密切相关。在非寄主及非亲和互作中, 结果均能使非致病菌豌 豆白粉菌(Erysiphe pisi)成功 [6] 被侵染细胞的骨架结构会发生明显重排,在侵染点处 侵入,且微丝解聚药物的效果更加明显。Yun 等 用 收稿日期:2010-06-29;接受日期:2010-10-08 基金项目:国家自然科学基金(30771398)、高等学校学科创新引智计划项目(B07049) 联系方式:郝心愿,E-mail: haoxy2005@126。通信作者马 青,Tel:;E-mail:maqing@//0>.中 国 农 业 科 学 44卷 Cytochalasin E 处理拟南芥后接种小麦白粉菌(Blumeria 下培养。 graminis f. sp. tritici),发现药物处理显著降低了拟南 1.5 黄瓜白粉菌的侵染过程观察 芥的非寄主抗病性反应,使得小麦白粉菌成功侵入。 用黄瓜白粉菌分别接种长春密刺和水源 11,23 ? 笔者用微管骨架解聚剂 Oryzalin 处理小麦后接种非 保湿 24 h,然后取出继续培养。于接种后 6、8、12、 [15] 致病菌黄瓜白粉菌(Sphaerotheca fuliginea),结果黄 18、24、48、96 h 取样,采用马青等 方法进行处理 瓜白粉菌能够成功侵入小麦 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 皮细胞且明显降低了互 和观察。 [7] 作中过敏性坏死反应的发生 。近期在微丝相关蛋白 1.6 小麦与黄瓜白粉互作中 HR、H2O2及乳突的染色观 基因的研究中发现微丝骨架在寄主抗病性中的作用更 察 大(另文发表)。非寄主抗病性作为植物抵御病原菌 分别于接种后 18、24、36、48、72、96 h 取样, [8-9] 最普遍、最持久的抗病形式,有着复杂的抗病机制 。 剪去叶片两端后,将剩余叶片切成 1.5 cm长的叶段, [16] 过敏性坏死反应、 H O 积累及乳突的形成是寄主和非 采用 Faoro 等 方法观察过敏性坏死反应,产生 HR 2 2 [10-13] [17] 寄主抗病性的重要特征 。【本研究切入点】自然 的细胞将被染成深蓝色;采用 Wang 等 方法观察 界中非寄主抗病性的表达较寄主抗病性的表达更为 H O 积累,产生 H O 的细胞显示红褐色。采用胡东 2 2 2 2 [18] 普遍。已有研究表明,非寄主抗病性的机制是以细胞 维等 方法观察乳突形成,由于乳突的高折光率在光 骨架为基础。但有关微丝骨架在小麦非寄主抗病反应 镜下很容易检出。 中作用的研究未见报道,微丝骨架在 H O 积累过程 试验使用 Nikon-i50 微分干涉显微镜进行观察。 2 2 中的作用也鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究 统计过敏性坏死反应、H O 积累及乳突产生率。每个 2 2 拟利用微丝解聚药物 Cytochalasin A(CA)处理小 处理观察 5 片叶,每个叶片至少观察 50个侵染点。 麦叶片后接种黄瓜白粉菌,检测 CA 处理对黄瓜白 2 结果 粉菌的侵染过程以及互作体系中 HR、H O 以及乳 2 2 突形成的影响,揭示微丝骨架在小麦非寄主抗病性中 2.1 黄瓜白粉菌在寄主和非寄主上的侵染过程 的作用。 在黄瓜叶面上,接种后 8 h,白粉菌已基本萌发(芽 管长度超过孢子短径一半即为萌发)完毕。产生 2?6 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 条芽管,多为 3?4 条(图 1-A)。第一个芽管顶端膨 1.1 供试病菌 大形成附着胞,附着胞中部生出初生吸器,其余芽管 黄瓜白粉菌采自田间发病的黄瓜叶片,接种感病 依次产生并形成菌丝和次生吸器,之后菌丝不断扩展。 品种长春密刺,选单菌落扩大繁殖。接种前 24 h,抖 接种后 48 h,可观察到极少数畸形附着胞。 落陈旧孢子,将新鲜孢子用于接种。 在小麦叶面上,白粉菌在接种后 10 h 左右开始萌 1.2 供试植物 发,与在寄主上相比延后约 3 h,但最终萌发率与在寄 小麦品种为水源 11,播种于直径为 10 cm的小花 主上差异不大。一般只形成 1?2 个芽管(图 1-B)。 盆中,在温度为 20?23?、光强为 8 000?10 000 Lx、 接种后 18 h左右,附着胞逐渐形成,但形成率略低于 16 h 光周期的温室中培养。将 7 日龄小麦幼苗刚展开 寄主,且多为纤细和分瓣(多为二分瓣)的畸形附着 的第一片真叶用于试验。 胞。之后病菌开始侵染小麦表皮细胞。在侵染点周围 1.3 药物配制及注射浓度 明显出现小泡状物质聚集、细胞壁加厚和乳突积累。 -1 将 CA(Sigma-Aldrich,USA)配成 2 mg?mL 的 病菌很难侵入,偶尔形成初生吸器,不能形成菌丝和 母液(DMSO溶解),-20 ?储存备用。注射前,用蒸 次生吸器。 -1[5] 馏水稀释至注射浓度 1 ?g?mL 。注射药物中 DMSO 在 CA 处理中,白粉菌可以产生初生吸器,最高 的浓度小于 0.1%。以 0.05% DMSO溶液为对照液。 吸器形成率约 12%,吸器体积也大于对照。而在对照 1.4 注射方法与病菌接种 中吸器形成率极低,小于 1%。且吸器很快被胞内 分 [14] -1 参照徐建强等 的方法于接种前将 1 ?g?mL CA 泌物所包裹,外壁加厚,染色加深,生长受抑,进而 注入小麦叶片,以注射对照液的叶片为对照。用棉棒 畸形坏死甚至被瓦解,病菌无法形成菌丝和次生吸器。 滚动式接种,孢子密度为每视野 20?30 个。于 23 ? CA 处理后,虽然绝大多数受侵细胞迅速发生坏死, 黑暗保湿 24 h,之后在相同温度、上述光强和光周期 吸器也逐渐畸形坏死,不能进一步发展,但在极少数 2期 郝心愿等:微丝骨架解聚剂在小麦-黄瓜白粉菌非寄主互作中的作用 A:接种后 36 h,黄瓜白粉菌在寄主上的侵染结构;B:接种后 24 h,小麦表皮细胞出现轻微的台盼蓝染色(CA处理);C:接种后 48 h,整个细胞 发生过敏性坏死反应,细胞核靠近侵染点(对照);D:接种后 48 h,小麦表皮细胞局部出现台盼蓝染色,黄瓜白粉菌成功侵入并产生吸器(CA 处 理);E:接种后 72 h,与附着胞接触的细胞及其相邻的细胞出现台盼蓝染色(对照);F:接种后 72 h,黄瓜白粉菌成功侵入小麦表皮细胞并产生 吸器(CA处理);G:接种后 96 h,黄瓜白粉菌成功侵入小麦表皮细胞并产生次生菌丝(CA处理)。标尺长度为 25 ?m;H:吸器;Co:分生孢子; App:附着胞;HR:过敏性坏死反应;N:细胞核;Hy:菌丝 A: Infection structure of S. fuliginea on its host cucumber, 36 hai hours after inoculation; B: Weak trypan-blue staining in wheat epidermal cells CA treatment, 24 hai; C: The whole cell had hypersensitive response with the nucleus close to the infection site CK, 48 hai; D: Partial hypersensitive cell death in wheat epidermal cells, showing the successful invasion of S. fuliginea with the haustorial formation CA treatment, 48 hai; E: Wheat epidermal cells in contact with appresorium and the neighbouring cells were stained by trypan-blue CK, 72 hai; F: Successful invasion of S. fuliginea and haustorial formation on wheat epidermal cells after CA treatment. 72 hai; G: Successful invasion of S. fuliginea and hyphal formation on wheat epidermal cells after CA treatment, 96 haiBars 25 ?m; H: Haustorium; Co: Conidium; App: Appresorium; HR: Hypersensitive response; N: Nucleus; Hy: Hypha 图1 CA处理后接种黄瓜白粉菌的小麦叶片过敏性坏死反应的发生 Fig. 1 Hypersensitive response in wheat leaf cells by CA treatment before inoculation with non-pathogen S. fuliginea 2期 郝心愿等:微丝 骨架解聚剂在小麦-黄瓜白粉菌非寄主互作中的作用情况下,白粉菌可成功侵入, 产生次生菌丝(图 1-G)。 最高,之后不断下降。但 CA 处理后染色程度明显较 可见,微丝骨架在植物抵御非致病菌侵入过程中起着 对照轻(图 4-B,D),出 现整细胞 DAB染色的侵染 重要作用。 点较少。接种后 36 h,最高点仅为对照的 60.41%,接 2.2 CA 处理对非寄主互作中 HR的影响 种后 96 h,H O 产生率也仅为对 照的 52.43%。表明 2 2 CA 处理后,细胞骨架被解聚,坏死率明显低于 微丝骨架在胞内聚集是 H O 产生所必须的。 2 2 对照(图 2),且台盼蓝染色范围也较小。表明微丝 骨架的聚合与过敏性坏死发生密切相关。 在对照及 CA 处理中坏死率均随时间延长不断升高,对照中,接种 后 18 h,坏死率低于 10%,此时台盼蓝染色浅,只在 侵染钉周围出现染色。接种后 48 h,坏死率迅速升高, 染色面积增大,很多侵染点出现整个细胞的坏死(图 1-C)。接种后 96 h,对照中坏死率高达 54.51%,坏 死面积较大,染色程度也较深。CA 处理后,坏死率 明显低于对照。接种后 48 h,只在个别侵染点出现整 个细胞的坏死,坏死率仅为对照的 51%。接种后 96 h, 坏死率仅为 32.86%,坏死程度也低于对照。由此可见,微丝骨架参与了过敏 性坏死反应的发生。 图3 CA处理对H2O2积累的影响 Fig. 3 Effect of CA treatment on the accumulation of H O 2 2 2.4 CA 处理对非寄主互作中乳突形成的影响 CA 处理后,乳突形成率明显降低,且乳突物质 积累也明显减少。在对照和处理中,乳突形成率均随 时间的延长不断升高(图 5)。对照中,接种后 18 h, 侵染钉周围有小泡样物质及小而致密的乳突形成。随 着时间的延长,乳突逐渐增大,小泡样物质逐渐向侵染点聚集。接种后 48 h,乳突积累已十分明显,侵染点周围可见明显的泡状物质。在接种后期,在大多数 图2 CA处理对于过敏性坏死反应发生的影响 的侵染点周围都形成了大而致密的乳突, 一些发生 HR Fig. 2 Effect of CA treatment on the occurrence of HR 的细胞,周围细胞壁也出现了一定的加厚。乳突物质 往往会被台盼蓝和 DAB染色。CA处理后,胞内微丝 2.3 CA 处理对非寄主互作中 HO 积累的影响 骨架解聚,不能发生定向重排。与对照相比,乳突物 2 2 小麦叶片经 CA处理后, H O 积累明显受到抑制, 质积累较少,泡状物质很少产生。可见,微丝骨架的 2 2 产生率显著低于对照(图 3)。对照中,接种后 18 h 定向排布,是乳突物质能够在侵染点周围准确积累的 开始出现 DAB 染色,但染色面积小,一般不超过整 主要原因。 个细胞的三分之一。接种后 24 h, H O 积累增强, DAB 2 2 3 讨论 染色范围扩大,相邻细胞壁染色程度加深。接种后 36 h 出现整个细胞的 DAB染色,且染色较重,相邻细胞 本研究通过微丝骨架解聚剂 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 了细胞骨架在小 也开始出现 DAB 染色。接种后期,染色范围进一步 麦非寄主抗病性中的重要作用。发现黄瓜白粉菌在非 加大,出现整细胞染色的侵染点比例也进一步增加。 寄主小麦上萌发明显滞后,只形成 1?2个芽管(多为 H O 产生率在对照和处理中变化趋势相同(图 3), 1 条),且附着胞多畸形,无法成功侵入。说明白粉 2 2 接种后 18 h到 36 h,H O 产生率逐渐升高,36 h 达到 菌的萌发和侵入可能与被侵染植物的表皮结构和成分 2 2 2期 郝心愿等:微丝骨架解聚剂在小麦-黄瓜白粉菌非寄主互作中的作用 A:接种后 24 h,附着胞周围表皮细胞及乳突可见红褐色 DAB染色(对照);B:接种后 24 h,仅与附着胞接触的细胞壁出现 DAB染色(CA处理); C:接种后 48 h,被 DAB染色的小泡样物质向侵染点处聚集,细胞核靠近侵染点(对照);D:接种后 48 h,黄瓜白粉菌成功侵入并形成吸器(CA 处理);E:接种后 72 h,与附着胞接触的整个表皮细胞出现 DAB染色(对照);F:接种后 96 h,与附着胞接触的细胞及其相邻细胞出现 DAB染 色(对照);G:接种后 96 h,黄瓜白粉菌成功侵入并形成吸器(CA处理)。标尺 长度为 25 ?m;H:吸器;Co:分生孢子;App:附着胞;HR: 过敏性坏死反应;N:细胞核;Pa:乳突 A: The epidermal cells and papilla around the appressorium was stained into reddish-brown with DAB CK, 24 hai; B: Only the anticlinal cell wall in contact with the appresorium was stained by DAB with CA treatment, 24 hai; C: Vesicular structure stained with DAB accumulated toward the infection site, which was approached by the nucleus CK, 48 hai; D: Successful invasion of S. fuliginea with haustorial formation CA treatment, 48 hai; E: The whole cell in contact with the appresorium was stained by DAB CK, 72 hai; F: The cells in contact with the appresorium and the neighbouring cells were stained by DAB CK, 96 hai; G: Successful invasion of S. fuliginea with haustorial formation CA treatment. Bars 25 ?m; H: Haustorium; Co: Conidium; App: Appresorium; HR: Hypersensitive response; N: Nucleus; Pa: Papilla 图4 CA处理后接种黄瓜白粉菌的小麦叶片H O 积累的胞间定位 2 2 Fig. 4 Subcellular localization of H O in wheat leaf cells by CA treatment before inoculation with non-pathogen S. fuliginea 2 22期 郝心愿等:微丝骨架解聚剂在小麦-黄瓜白粉菌非寄主互作中的作 用乳突作为植物抵御病原菌侵入的基本形式,在植 物与病原菌的互作中均明显发生。原生质凝集一直被 认为是植物抗病性的一种表现。细胞壁加厚及多层次 结构乳突的形成是抵御黄瓜白粉菌侵入的有效防卫反 [24] [3] 应结构 。Opalski等 用荧光标记观察到,在大麦白 粉菌与非亲和大麦品种互作过程中,微丝骨架在侵染 点处聚集,而感病品种微丝聚集的频率较低且滞后。 微丝骨架在细胞中参与核糖体、线粒体等细胞器的运 [2] 动过程 。本试验用 CA 处理小麦叶片后,乳突形成率及乳突的体积都明显小 于对照。这表明微丝骨架可 能参与了侵染点处原生质体凝集过程,与乳突形成密 [5] 图5 CA处理对乳突形成的影响 切相关。Kobayashi等 用 CA 处理大麦后接种非致病 Fig. 5 Effect of CA treatment on the papilla formation 菌豌豆白 粉菌,在侵染点处胼胝质、糖类和蛋白的积 累减少近 60%?95%。细胞骨架可能通过指导分泌的囊 [19] 有一定的联系 ,附着胞的形成需要一定的接触刺 泡携带某些物质到加厚的 细胞壁位点或者能够指导在 [18] 激 。另外,由于黄瓜白粉菌分生孢子的芽管是次序 细胞膜的特异位点启动必要的合成机制,以此来向真 产生的,非寄主上,首先产生的附着胞无法形成有功 菌侵袭部位添补与防卫反应相关的成分,形成机械的 能的吸器并获取营养,这可能是阻止其它芽管次序生 或化学的屏障以抵抗病原物的侵染。 出的原因。 黄瓜白粉菌为专性寄生菌,吸器的形成是其成功 过敏性坏死反应是植物最重要的抗病性表现特 侵染的标志。小麦经 CA 处理后,黄瓜白粉菌能够成 [20] 征,也是非寄主抗病性的典型反应 。小麦叶片经 CA 功侵入小麦表皮细胞,且具有很高的吸器形成率。虽 处理后,HR 的产生受到了很大程度的抑制,特别是 然大部分吸器会很快畸形坏死,但在极少数情况下, 在接种后期,坏死率仅为对照的 50%左右,表明其抗 可形成有功能的吸器,使白粉菌进一步发展。表明微 病性受到明显的抑制。微丝骨架参与了小麦抵抗非致 丝骨架在小麦的非寄主抗病性表达中起着非常重要的 病菌黄瓜白粉菌侵入过程中过敏性坏死反应的发生。 作用。微丝骨架有时不仅仅被动感受病原菌的侵袭, [21] [25] 侯春燕等 在小麦和叶锈菌非亲和互作研究中,给小 还能在病原菌侵入之前发生主动的、精细的重组 , 麦叶片预注射不同浓度的 Cytochalasin D,同样使发生 可见,微丝不但参与了抗病反应的发生,可能还参与 HR 的细胞数目明显减少,且注射药物浓度越大,效 了防卫信号的识别和传递。对微丝骨架在非寄主抗病 果越明显。表明侵染点处微丝骨架特定分布格局的形 反应中动态变化的检测以及微丝骨架重组机制的深入 成是植物抵御病原菌侵入的关键因素。 研究,将对揭示非寄主抗病性的本质具有重要的意义。 活性氧迸发被认为是过敏性坏死反应的特征性反 4 结论 应,是植物对病原物应答的最早期反应之一。H O 能 2 2 够引起细胞壁成分交联从而增强植物抵御病原菌侵入 小麦与黄瓜白粉菌的非寄主互作中,黄瓜白粉菌 的能力,且活性氧本身还可直接作用于病原菌,起到 在小麦上的萌发与在寄主上相比明显滞后且附着胞多 抗菌因子的作用。 Thordal-Christensen 等在大麦与大麦 畸形。小麦叶片经微丝骨架解聚剂处理后,互作中过 白粉菌互作研究中证实,H O 首先在侵染点下方积 敏性坏死反应、H O 及乳 突的发生受到明显抑制,且 2 2 2 2 [22] 累 ,而微丝骨架也在病菌侵染点处聚集。H O 的产 白粉菌可以成功侵入小麦表皮细胞并具有很高的吸器 2 2 [11] [23] 生需要细胞骨架的参与 , Mathur 等 进一步研究证 形成率,偶尔还产生次生菌丝。表明微丝骨架参与了 明,植物体内过氧化氢酶体的产生与微丝骨架有关, 小麦的非寄主抗病性反应,但对微丝骨架的相关调控 而与微管无关。笔者用 CA处理小麦叶片后,H O 的 机制还有待于更深入的研究。 2 2 积累明显减少,特别是在接种后期,区别更加明显。 References 说明微丝骨架参与了小麦非寄主抗病反应中 H O 的 2 2 [1] Wasteneys G O, Yang Z B. 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