脂肪酶酶活测定方法
脂肪酶是一种特殊的水解酶，广泛地存在于动物组织、植物种子和微生物体中，是能水解甘油三酯或脂肪酸酯产生单或双甘油酯和游离脂肪酸，将天然油脂水解为脂肪酸及甘油，同时也能催化酯合成和酯交换的酶。其在轻工、化工、医药、食品等行业有广泛的用途。近年来，随着非水酶学和界面酶学的不断深入，脂肪酶应用也不断地扩展，被广泛应用于酯合成、手性化合物的拆分、化工合成中间体的选择性基团保护、高聚物的合成、肽合成等方面，应用前景广阔。
水?甘油二酸酯+游离脂肪酸?甘油酸酯+游离脂肪脂肪酶在微生物中有广泛的分布。脂肪酶催化的反应是:甘油三酸酯+
?甘油+游离脂肪酸。脂肪酶只能在异相系统，即在油-水界面上作用，对水溶性底物无作用，这一点在有机合成中合酸
成手性中间体方面具有很多的优越性。
1 滴定法(参照国家
标准
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，适用于脂肪酶制剂)
1.1 脂肪酶活力定义
为1g固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度的pH条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为一
表示。 个酶活力单位，以u/g(u/mL)
1.2 测定原理
脂肪酶在一定条件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，所释放的脂肪酸可用标准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞指示反应终点，根据消耗的减量，计算其酶活力。反应式为:RCOOH+NaOH?RCOONa+HO。 21.3 仪器设备
恒温水浴箱，移液枪，高速匀浆机，pH计，电磁搅拌器
1.4 试剂溶液
95,酒精
4%聚乙烯醇(PVA，聚合度1750?50):称取4g PVA，加蒸馏水80mL，沸水中加热，并不断搅拌，使其完全溶解，慢速搅拌，以免产生过多气泡，冷却后定容至100mL，用双层纱布过滤后备用。
橄榄油(
分析
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纯)
底物溶液:按4%聚乙烯醇:橄榄油=3:1比例混合，用高速匀浆机处理6min(分两次处理，间隔5min，每次处理3min)。
pH7.5磷酸缓冲液:称取十二水磷酸氢二钠39.62g，磷酸二氢钾1.96g，用水溶解并定容至500mL，调节溶液的pH到7.5?0.05。
0.05mol/L氢氧化钠按GB/T601配制与标定。使用时稀释10倍。
10g/L酚酞指示液:GB/T603配制。
1.5 待测酶液的制备
2g，精确至0.0002g，用磷酸缓冲液溶解并稀释。如果是粉末，可加少量缓冲液研磨再稀释。测定时称取酶样品1g~
控制酶液浓度，样品与对照消耗碱量之差控制在1mL~2mL范围内。
测定 1.6
1.6.1 电位滴定法
?按pH计使用说明书进行仪器校正;
?取两个100mL烧杯，分别作为空白A和样品B，分别加入底物溶液4mL和缓冲液5mL，再于A中加入95,酒精15.00mL，于40??0.2?水浴中预热5min，然后各加1mL酶液，立即混匀计时，准确反应15min后，于B中立即补加15.00mL 95,酒精终止反应，取出。
?在烧杯中加入一转子，置于电磁搅拌器上，边搅拌，边用氢氧化钠标准溶液滴定，至pH10.3，为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。
1.6.2 指示剂滴定法
?取两个100mL三角瓶，分别作为空白A和样品B，分别加入底物溶液4mL和缓冲液5mL，再于A中加入95,酒精15.00mL，于40??0.2?水浴中预热5min，然后各加1mL酶液，立即混匀计时，准确反应15min后，于B中立即补加15.00mL 95,酒精终止反应，取出。
?于A、B瓶中各酚酞两滴，用氢氧化钠标准溶液滴定，直至微红色并保持30s不退色为滴定终点，记录消耗氢氧化钠标准溶液的体积。
1.6.3 计算
脂肪酶制剂的酶活力按以下公式计算:
式中:
X——样品的酶活力，u/g; 1
V——滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(mL); 1
V——滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积，单位为毫升(mL); 2
c——氢氧化钠标准溶液，单位为摩尔每升(mol/L)
——0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00mL相当于脂肪酸50μmol; 50
n——样品的稀释倍数; 1
0.05——氢氧化钠标准溶液浓度换算系数;
15——反应时间15min，以1min计算。
4 讨论
影响脂肪酶测定结果有很多因素，其中底物、反应温度和pH因素影响最大。
在滴定法中，以前国外有报导测定脂肪酶酶活时，不将底物制成乳化液，直接在搅拌状态下对油脂进行酶解反应，然后用碱滴定生成的脂肪酸。不乳化测得的结果平行性较差，这可能是反应过程中的随机误差引起的。因为不乳化时，反应体系是酶的水溶液加入底物橄榄油中，水与油是互不相溶的，必然造成体系的不均匀，酶不能与底物充分接触，反应不完全，因此测定的平行性较差，可比性也差。
酶都有其最适的反应温度，在不同温度下酶所表现的活性也不同，温度的升高可以加快反应速度，但会引起酶蛋白变性失活。
同一浓度的碱性脂肪酶在相同的温度下，对同样的底物作用，在不同的pH环境中，所测得的酶活也不同。
浙公网安备 33021202002483