实验15 DNA的细胞化学——Feulgen反应

实验15 DNA的细胞化学——Feulgen反应 15 DNAFeulgen 【 】 了解Feulgen反应的原理，掌握有关的操作方法。 【 】 DNA是由许多单核苷酸聚合成的多核苷酸，每个单核苷酸又由磷酸、脱氧核糖和碱基 构成。DNA经1N盐酸水解，其上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的双键打开，使脱氧核糖的第 一碳原子上形成游离的醛基，这些醛基与Schiff试剂反应。Schiff试剂是由碱性品红和偏重亚硫酸钠相作用，形成无色的品红液，当无色品红与醛基结合形成紫红色的化合物。因此凡 有DNA的地方，都能显示紫红色。紫红色的产生，是由于反应产物的分子内含有醌基，醌 基是一个发色基团，所以具有颜色。材料不经过水解或预先用热的三氯醋酸或DNA酶处理，得到的反应是阴性的，从而证明了Feulgen反应的专一性。 图4-1 Feulgen反应 【】 （一） 仪器、用具 显微镜、恒温水浴箱、温度计、解剖针、酒精灯、试管、烧杯、载玻片、盖玻片、吸水纸。 （二） 材料 洋葱鳞茎或根尖 （三）试剂 1．1N 盐酸的配制 取82.5ml比重1.19的浓盐酸加蒸馏水至1000ml。 2．Schiff试剂的配制及保存 称取0.5g碱性品红加入到100ml煮沸的蒸馏水中（用三角烧瓶），时时振荡，继续煮 5分钟（勿使之沸腾），使之充分溶解。然后冷却至50?时用滤纸过滤，滤液中加入10ml 1N HCl，冷却至25?时，加入0.5g NaSO（偏重亚硫酸钠或钾），充分振荡后，塞紧瓶塞，225 在室温暗处静置至少24小时（有时需2～3天），使其颜色退至淡黄色，然后加入0.5g活性炭，用力振荡1分钟，最后用粗滤纸过滤于棕色瓶中，封严瓶塞，外包黑纸。滤液应为无色 也无沉淀，贮于4?冰箱中备用。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许 取200ml自来水，加10ml 10%偏重亚硫酸钠（或偏重亚硫酸钾）水溶液和10ml 1N HCl，偏重亚硫酸钠或钾，使之再转变为无色时，仍可再用。 三者于使用前混匀。 3．亚硫酸水 【 】 1．将洋葱根尖或鳞茎内表皮放在1N HCl中，加热到60?水解8～10 min。 2．蒸馏水水洗。 3．Schiff试剂遮光染色30min。 4．用新鲜配制的亚硫酸水溶液洗3次，每次1min。 5．水洗5min。 6．将根尖放在载玻片上，镊子捣碎，盖上盖玻片，压片（洋葱表皮可省去压片这一步）。 7．显微镜检查。 结果：细胞中凡有DNA的部位应呈现紫红色的阳性反应。 对照片： 方法一 先将材料放在5%三氯醋酸中90?水浴15min，主要把DNA抽提掉，然后按步骤1—7制片观察。 方法二 材料不经1N HCl水解，直接放在Schiff试剂中染色，然后按步骤4—7制片观察。 【 】 1、简述Feulgen反应的原理和实验的关键步骤。 2、绘图示洋葱根尖细胞或鳞茎表皮细胞DNA的分布部位。 23 【】 了解细胞电泳的意义和原理，掌握红细胞的电泳速度测定方法。 【】 在外界附加电场作用下产生多相系统相位移效应，称为电动现象，属于此种电动现象的 包括电泳和电渗透。在电场作用下，液体介质中的悬浮质点与介质间的相对运动，称为电泳。 将细胞制成悬浮溶液，使其单个游离的细胞分散于等渗的介质中，在电场作用下，细胞在电 泳室内发生运动。这种现象称为细胞电泳。 细胞表面具有一定的电荷（通常为负电荷），其表面吸附了一层极薄的水膜，它与介质 间存在着电位差，此电位差称为ζ电位。每种细胞在恒定的条件下（如温度、电压、电流、 介质浓度、pH值等）其电泳速度和ζ电位十分稳定，但在各种有害因子、病理状态的影响 下，可降低其表面电荷，所以细胞电泳速度和ζ电位值也发生改变（降低）。因此，利用细 胞电泳研究生命结构的表面性质、鉴定细胞或单细胞有机体的机能和病理状态具有重要的意 义，这是一种十分有用的方法。 【】 （一）仪器、用具 LIANG-100型细胞电泳仪l台、光学显微镜l台、千分表l只、计算器l只、网格目微尺l个、台微尺l个、细胞电泳架l个、电泳毛细管l支、采血量管l支`样品管l支、lml吸 管l支、5ml注射器l支、50ml烧杯l个、解剖刀、剪刀、镊子各一把。 （二）材料 兔子或罗非鱼血 （三）试剂 氯化钠、蔗糖、肝素、琼脂。 【】 一、准备实验 l.细胞介质的制备 根据实验要求，可选配以下各种介质： （l）生理盐水肝素液：在生理盐水中（0.9%NaCl液），按每ml加入4～5U（国际单位）的肝素，混匀后备用。 （2）8％蔗糖肝素液：在8％的蔗糖液中，加上述（l）含量的肝素，混匀后备用。 （3）50％血清液：用生理盐水将离心后提取的血清配成50%的介质。因血清中含有抗凝物质，在配制此液时不需再加入肝素。 2.样品的制备 根据实验对象（如红细胞、白细胞、血小板、巨噬细胞、癌细胞或植物的原生质体、叶 3，加入上述 3介质中，并混匀。如做红细胞电泳，可直接用采血量管吸取全血10mm，加入所选择的介 绿体等），选择所需介质lml，再用采血量管或微型移液管吸取浓缩细胞10mm质中混匀后即可使用。 3.盐桥的制备 称取9gNaCl加蒸馏水至100ml（即9%的NaCl液），溶解后再加入1.5克琼脂粉加热溶化，在加热时不断用玻璃棒搅动，直至全部溶化为止，此时将已洗净凉干的塑料管插入溶液 内，使管腔内全部被溶液充满，不得留有气栓。塑料管可切成1.3～l.4cm长，如无专用管，亦可用空圆珠笔芯代替，先用碱水煮沸，除去油污，再用清水洗净晾干，使用效果良好。 4.网格目镜测微尺的校正 在显微镜载物台上放置物镜测微尺（又名台微尺），转动显微镜镜筒的目镜并移动物镜 测微尺，调整目镜测微尺网格的纵线与物镜测微尺刻度线平行并重合，将网格的一条细线与 物镜测微尺的一条细线重合在一起。然后确定被一定数量的目镜测微尺网格刻度数所包含的 物镜测微尺的刻度数，根据下式进行计算： n?a ?= ——— m 式中 X：网格的实际刻度值（mm或μm）； a：物镜测微尺的刻度值（通常为0.0lmm）； n：物镜测微尺的刻度数； m：网格刻度数。 注意： （l）对网格目镜测微尺刻度值的校正，应选择在显微镜视野中部进行，因偏边缘具有 相差，使测量不准确。 （2）进行校正的放大倍数应足以保证能够进行实验观察，普通4～8μm的细胞可选择放大400～450倍的物镜进行校正。 5.毛细管电泳室静止层（即测量层）的计算 毛细管电泳室是长6cm的管腔，呈正方形（有的为等边三角形）以玻璃制成毛细管， 电泳室的制作工艺比较复杂，在其中相对应的内壁中线处，各刻有一条与内壁长轴一致的平 分线，此线是在电泳测量时，观察一定深度的细胞移动的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。 根据流体力学原理，液体在管腔内流动，因为管壁对流体有吸附作用和摩擦力，其管腔 内不同深度的质点的运动速度是不一致的，管腔的中心处最快，紧贴管壁处最慢。 在做电泳速度测量时，因为毛细管内不同深度点的运动速度差别极大，所以在其它因素 （如温度、黏度、电压、电流强度、细胞浓度、pH值等）相对稳定的条件下，必须选择固 定的深度进行测量，否则，因深度的变化而测定的电泳速度，将不能表示出正确的实验数据。 但是，当电流通过电泳毛细管小室时，除了发生细胞和介质间的相对运动之外，同时发 生介质连同介质中离子与毛细管壁的相对运动，这种现象称为电渗透。这时阴离子连同介质 在管腔的中部向正极方向移动，阳离子连同介质在管腔的边缘向负极方向移动。因此，由于 电渗的存在，所测得的数值是电泳和电渗的总和。 电渗能够直接影响测定细胞的真实电泳速率。因为在测量时电泳小室两端是封闭的，根 据流体力学原理，室中液体的总流量等于零，由于毛细管腔中间的介质与边周介质间存在着 向相反方向运动着的电渗现象，所以在彼此向相反方向运动着的介质的交界处其移动速度等 于零，我们把这一层深度称为“静止层”或“测量深度”。在这一层进行细胞电泳测量，受 电渗的影响最小，能够较准确地反映出电泳的速度。 对于不同大小和形状的毛细管电泳室管腔的横截面其“静止层”深度是不一致的，国产 的外方内方毛细管，内径为800～1000μm，其静止层深度，经测定为内径深度的0.l～0.15处。在实际测量中，要不断的改变电流方向，测定往返运动着的不同细胞，如果电流方向不 变，只测定向某方向移动的细胞。则由于电渗的作用，使质点运动速度加快，以至造成“环 流”，此时将不能进行电泳速率的测定。 静止层（测量层）的测定：首先测出在划有刻度线的毛细管所对应二壁间的距离d（即毛细管内径）。在靠近观察壁划线的0.ld～0.15d深度处，即为静止层或测量层。 其测量方法有两种：一种是用显微镜的低倍物镜（×10），先把细调焦旋扭的指示箭头 对准刻度盘的“O”处，然后慢慢调整粗调焦旋钮把焦面对准靠观察面一侧壁的划线处，这 时再旋转细调，使焦面逐渐向管腔内部延伸，直到调到对面壁划线的焦面时（视划线清楚为 止），记下细调旋转的圈数和最后不满一整圈的刻度数，则可算出从第一条划线焦面至第二 条划线焦面间物镜镜头前伸的距离，即为电泳毛细管管腔的直径d。再用微调调焦旋钮（即 与上反方向）使焦平面落在读数值为0.1d～0.15d处即为测量层的位置。 另一种方法是用千分表进行测量。此法较第一种测量数据更为准确。 （1） 用低倍物镜和粗调焦旋钮寻找电泳毛细管的前内壁黑线。 （2） 把千分表的前端与显微镜的移动台接触后，调千分表的指针至零。 （3） 利用微调焦旋钮找到后内壁黑线，读下千分表指针的读数，该读数就是毛细管的 内径（如显示值为600，则这支毛细管的内径就是600μm）。 （4） 用微调调焦旋钮（即与上反方向）使焦平面落在读下千分表数值的0.1～0.15比例处，即为测量层的位置。 6．样品的灌注 （l）用吸头与洗耳球连接装置盛上蒸馏水冲洗电泳毛细管（要小心，以免损坏毛细管）。 （2）将毛细管斜插入装有被测样品的小烧杯中，由于毛细作用，则整个管腔内充满了 被测液体。 （3）先在电极两端装上盐桥.然后把装好样品的毛细管平放在显微镜插板的测量槽中。 装电极时，插板要一端倾斜一些，电极先从低端装入，然后把插板平稳地插入恒温装置内。 （4）用鱼头夹连接电压电极（注意，切勿两夹碰撞或接触，以免损坏仪表）。 （5）寻找测量层区域内的清晰的细胞进行测量。 二、细胞电泳速度的测定的操作步骤 1.连接电压输出引线和加热接口引线。 2.打开电源开头（在机的右侧），预置温度选25?（拨盘置于“250”，不能拨在“025”）。 3.选择电泳电压40V，按A键D2显示电压（电压调节开关在机的左侧），A键放开D2显示电泳室内的温度。 4.按D键测量红细胞电泳（10个有效红细胞〉 按C键测量血小板电泳（100个有效血小板） 按B键测量淋巴细胞电泳（100个有效细胞） 5.按L和R上的移位键（MOVE），将不在网格线上的细胞移到线上。 6.按L和R下方的计时键（TIME），观察在线上清晰细胞向左移动2小格，再向右移 动2小格。D1显示左计和右计的时间，两时间相等计时器自动接受，D2减去1，显示还要 测9个细胞，如为无效就自动剔除。 7.测满10个有效细胞后， D2回复到温度显示。 D1的时间为总时间被自动封住，再 按计时键也无反应。按D键后显示电泳时间，按C键显示电泳率。 8.重新测定按复位E或R键。 三、电泳速度的计算 根据所测得目镜测微尺上网格的实际刻度值，实验测定的l0个细胞共走了40个方格，为所测电泳距离的总和S，Dl显示的时问为所测时间的总和t，电泳速度以下式表示： V =?S/t V为电泳速度，即细胞在总时间（t ）内移动的距离（S），S可用μm或mm表示。 【】 （1）电路接通后要迅速进行测量，以防时间拖长，细胞沉降。 （2）用鱼头夹连接电压电极时，注意切勿两夹碰撞或接触，以免损坏仪器。 （3）上机测量时，电泳毛细管两端应调至水平位置。 （4）电极夹—银电极—盐桥—毛细电泳室间都要接触紧密，盐桥及毛细管电泳室的腔 内不得造成气栓，以免产生断路。 （5）每次实验结束后，应清洗电极和毛细电泳室，干燥后放入小盒内。 26 【 】 学会鉴别外界条件诱变染色体改组的各种类型，为进行环境监测和诱变育种提供细胞学 方面的依据。 【 】 目前，由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排放等都存在 污染环境的可能。欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害，就需要一套高度灵敏，技术简单 易行的系统来监测环境的变化。而生物监测技术是目前进行环境污染，化学诱变物质以及辐 射对机体损伤程度监测的一个主要指标。同时，它也为进行辐射防护、新药试验、食品添加 剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面提供了很好的手段。 用于进行环境因素、诱变物质、辐射损伤的生物检测方法包括染色体畸变类型的检测和 微核的检测等。常用于测试的材料有鸭跖草、水葱花、韭菜花等的花穗，以及蚕豆根尖和小 白鼠等。一般来说，处于分裂过程的细胞，对环境因素最敏感，尤其是处于减数分裂时期的 花粉母细胞。诱变物质、环境污染及辐射对人类和其它高等生物的遗传损伤，在细胞水平表 现为染色体畸变，遗传损伤不仅表现在体细胞，而且也通过生殖细胞扩散和积累。 【】 （一） 仪器、用具 显微镜、解剖针、酒精灯、载玻片、盖玻片、吸水纸等 （二）材料 水葱花、韭菜花或紫露草花穗 （三）试剂 无水乙醇、冰醋酸、改良苯酚品红染色液 【】 （一）污水对花粉母细胞减数分裂期染色体的作用 1．取材 选取处于减数分裂期的花穗若干，剪下5～8cm的花序。部分插在自来水中作对照，另一部分插在污水中，处理12～24h，再移到自来水中恢复培养24h。 2．固定 用卡诺氏固定液固定12h，经95%、85%乙醇各30min，70%乙醇4?保存。 3．制片 剥取花药，用镊子轻轻捣碎，用改良苯酚品红染色5～10min ，去掉残渣， 盖上盖玻片。 4．镜检 用低倍镜找到分裂期细胞，再转用高倍镜，可看到经污水处理过的细胞中， 染色体畸变的类型和微核的数目，分别要比对照组高。微核出现的多少，可作为监测环境污 染程度的指标。 （二）γ-射线对花粉母细胞减数分裂期染色体的作用 1．取材 将未开放的水葱花、韭菜花或紫露草花穗（外面仍有膜状总苞包着）若干， 进行γ射线（剂量为0.258c/kg）辐照处理，处理后在水中恢复培养12h，然后于上午9～11 时把颖花剥下，用卡诺氏固定液固定12h，经95%、85%乙醇各30min，70%乙醇4?保存。 2．制片 方法同前。 激光对花粉母细胞减数分裂期染色体的作用 23．镜检 观察染色体的各种畸变现象。 2 1．取材 取上述小花进行CO激光处理，功能密度为20W/cm，处理1～2秒后放在2（三）CO水中恢复培养12小时，然后用卡诺氏固定液固定12h，70%乙醇4?保存。 2．制片 方法同前。 3．镜检 观察染色体的各种畸变现象。 【 】 经污水、辐照处理的材料，可见到下列畸变类型： 1．染色体团聚：染色体胶连成团块，失去染色体的形态。在细胞分裂的前期、中期、 后期、二分子期、四分子期及单核花粉期均可看到。 2．落后染色体：是由于分裂的细胞受到损伤（多半是由于纺锤体被破坏），而引起染色 体不同步移动或者不移动造成的。多见于分裂中期和后期，这种现象有可能导致染色体数目 的丢失。 3．无着丝粒染色体断片：见于分裂前、中、后期，这种现象多会造成染色体上某个基 因的缺失。 4．染色体环：整组染色体胶连成一个大环或出现小环。 5．染色体桥：在细胞分裂的后期或末期，同源染色体或姊妹染色单体分开时，部分有 染色质丝粘连，使到分开不完全，从而造成染色体桥的出现。这种现象多造成染色体上某个 基因的重复，有一至多桥。 6．不均等分裂：细胞分裂结束时，产生的不是均等的四个子细胞（四分体）而可能是 三分体、五分体、六分体、八分体等。 7．微型小孢子：是由于多分体细胞的胼胝质壁破裂后产生的体积比正常小孢子要小的 一些孢子。 8．微核：由落后染色体形成的核状小块。见于末期、二分子期、四分子期及小孢子期。 微核是游离于主核外，大小是主核的1/3以下，它的折光率和细胞化学反应性质和主核 一样，已经证实微核率的大小是和污染程度、用药剂量或辐射累积效应呈正相关。所以微核 计算已成为灵敏度高、技术简便的一种测试系统。它可用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变、 新药试验研究以及环境污染程度监测的重要指标。 【 】 1． 绘图示各种染色体畸变现象并标明所处的分裂时期。 2． 计算微核率。 35 【】 1．了解和掌握植物组织培养的方法及其要点。 2．将胡萝卜贮藏根培养成为愈伤组织。 3．将菊花花瓣培养成为完整小植株。 【】 植物组织培养的理论依据是植物细胞具有全能性，所谓细胞全能性是指植物体任何一个 细胞都携带着一套发育成完整植株的全部遗传信息，在离体培养情况下，这些信息可以表达， 产生出完整植株。要使细胞所具有的全能性表达出来，除了生长以外，还要经过脱分化和再 分化等过程。分化了的植物根、茎、叶细胞，通过脱分化培养可以产生愈伤组织。愈伤组织 是一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团。愈伤组织经过进一步的分化培养，提供不 同的营养和激素成分，又可再生出完整的小植株。植物组织培养技术，不仅具有重大的理论 意义，而且在生产实践中已显示了广泛的应用前景。 【】 （一）仪器、用具 分析天平、超净工作台、高压灭菌锅、培养箱或培养室、剪刀、镊子、手术刀、电炉、 烧杯、试剂瓶、培养瓶、酒精灯、精密pH试纸 （二）材料 胡萝卜块根、菊花花瓣 （三）试剂 配制培养基的各种化学试剂药品（见表 8-1 ），6-苄基氨基嘌呤（6-BA）、2,4-D、NAA、 1N NaOH、1N HCl、0.1%升汞、酒精、蔗糖、琼脂 【】 （一）胡萝卜块根的脱分化培养 1．母液的配制 在配制培养基时，为了使用方便，避免每次配制称量的麻烦，通常将各种成分配成比培 养基需要量大10～100×的母液（以MS为例，配制方法见下表）。 表8-1 MS培养基配方 类 成分 每升培养基中 配制母母液体扩大倍数配一升培养型 工作浓度液称取积（ml） （×） 基的吸取量 （mg/L） 量（mg） （ml） 大 KNO 1900 19000 3量 NHNO 1650 16500 43 ?7HO 42370 3700 1000 10 100 KHPO 170 1700 24 CaCl?2HO 440 4400 22元 MgSO 微 MnSO?4HO 42素 22.3 2230 ZnSO?7HO 428.6 860 量 HBO33 6.2 620 KI 0.83 83 1000 100 10 元 NaMO?2HO 2420.25 25 CuSO?5HO 0.025 2.5 42素 CoCl?6HO 0.025 2.5 22 铁 Na-EDTA 37.3 37.3 1000 100 10 2 盐 FeSO?7HO 27.8 27.8 42 有 甘氨酸 2.0 100 机 盐酸硫胺素 0.4 20 物 盐酸吡哆素 0.5 25 500 100 10 质 烟酸 0.5 25 肌醇 100 5000 配制母液时必须要注意，各种化学物质必须一一充分溶解后才能混合，以避免药物间 出现化学反应产生沉淀。某些生长素，如2,4-D、IAA、NAA等，应先用少量95%乙醇溶解，最后才加水定溶。Kt、6-BA、2ip、ZT等细胞分裂素，应先用少量1N HCl或NaOH溶解，最后才加水定容。配好的母液要标记好配制日期以及药物的浓度。 2．培养基的配制 把母液按编号顺序排列好，取大烧杯一个，先加入约300ml蒸馏水，按 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 好的培养 基分别吸取母液，最后定容到所需的量。调pH至5.8，每升培养基加入6.5g琼脂粉和30g蔗糖煮溶。分装到培养瓶中，封好瓶口。 基本培养基种类和附加成分是根据培养材料和目的来确定的。下列培养基及附加成分可 作为组织培养实验中参考依据。MS培养基附加2,4-D 2mg/L和6-BA 0.2mg/L，适合胡萝卜块根愈伤组织的诱导； Miller或N6培养基附加2,4-D 0.5mg/L，适合水稻花药愈伤组织诱导； 而附加NAA 0.5-2mg/L和3mg/L 6-BA则适合水稻花药愈伤组织分化为单倍体植株。MS培养基附加NAA 0.1mg/L和6-BA 3mg/L适合菊花花瓣诱导分化。 MS培养基附加NAA 0.5mg/L适合多种花卉植物的根分化。 3．灭菌 2把分装好的培养基及接种用具放入高压消毒锅进行灭菌消毒。当压力升到0.5kg/cm时， 2打开放气阀，放气5min后，再把放气阀关上，当压力升到1.1 kg/cm或0.11 MPa时，开始计时，维持0.11 MPa压力灭菌15～20min。灭菌后应把培养基放在干净处冷却待用。 4．取材与消毒 在自来水中反复冲洗干净胡萝卜块根，切取中间长约50mm一段，在超净工作台中，放入无菌烧杯中，经70%酒精浸泡5min后，再用饱和漂白粉液消毒20～30min。倒去消毒液，用无菌水洗3～5次。 5．接种 在超净工作台中，用经高压消毒过的镊子和解剖刀把材料两端厚约10mm的部分切去不用，中间的一段切成厚约5mm的圆片，最后把圆片切成5mm3的组织块（注意每块都应带有形成层），接种在MS + 2,4-D 2mg/L+6BA 0.2mg/L的培养基中。接种后，要在包头纸上 写清楚材料名称、培养基代号、接种日期、姓名等。 6．培养 接种好的材料放在26～28?条件下黑暗培养2～3周，即可出现愈伤组织，培养4～6 周，愈伤组织达到高峰。每隔一周。观察 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 培养物的形态变化。 （二）菊花花瓣的分化培养 1．配制培养基 适合菊花花瓣分化培养的培养基为MS + 6-BA 3mg/L + NAA 0.2mg/L + 糖3%+琼脂 0.7% pH 5.8。 2．外植体的灭菌消毒 2选取新鲜的菊花花瓣，用洗衣粉洗净表面，自来水冲洗30min，再用吸水纸吸干水分。溶液消毒10min。最后用无菌水洗5～6次，灭菌过的滤纸吸干水分。 然后移入超净工作台，用70%乙醇消毒30sec，接着用饱和漂白粉液消毒20min或0.1% HgCl 3．接种培养 用灭菌的剪刀把花瓣头尾剪去，剪成一至两段，接种在MS+6-BA 3mg/L+ NAA 0.2mg/L 的培养基中，经26～28?，光照强度1000～2000勒克斯，每天照光12h，培养14d左右，就可诱导出愈伤组织，再培养10～15d便可分化出不定芽。当芽长到1～2cm时，分割芽转入MS + NAA 0.5mg/L生根培养基中，继续培养10d左右，就可以长出白根，形成完整的植 株。 【】 1．接种用的工具、器皿、培养基必须要经过高压灭菌。 2．接种前要用紫外消毒接种室20min，接种者要用肥皂洗干净双手，然后用沾以70％酒精棉球把手和指尖消毒1次。 3．严格按照无菌操作的要求进行操作，尽量减少污染。 【】 1． 接种后一周，观察记录培养物有无污染。 2． 每隔一周观察记录培养物的生长情况。