毕赤酵母表达系统使用心得

毕赤酵母表达系统使用 心得 信息技术培训心得 下载关于七一讲话心得体会关于国企改革心得体会关于使用希沃白板的心得体会国培计划培训心得体会 PichiaPichiaPichiaPichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高但是在实际操作中并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题收集了部分用户在使用EasySelectPichiaExpressionSystem这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中XiangYang是来自美国乔治城大学 GeorgetownUniversityLombardi癌症中心LombardiCancerCenter部分用户来自国内。甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统具有一定的蛋白质翻译后加工有利于真核蛋白的表达优点-2.AOX强效启动子外源基因产物表达量高可以达到每升数克表达产物的水平3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物远较真核系统简单非常适合大规模工业化生产。4.可以诱导表达也可以分泌表达便于产物纯化。5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源生产成本低表示优胜于-表示不如表示差不多EasySelectPichiaExpressionSystem产品性能优点——使用简单表达量高His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 及心得体会巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种一方面由于其是属于真核生物因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰另一方面毕赤酵母生长速度快可以将表达的蛋白分泌到培养基中方便蛋白纯化。毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点MCR3端带有his-tag和c-mycepitopes这些tag有利于常规检测和纯化而且在MCR5端引入了alphafactorα-factor用以增加表达并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候如果你选择的是EcoRI那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。第一步————————构建载体XiangYangpPICZ系列有许多克隆位点可供选择同时也有三种读码框以便不用的用户需要。红叶山庄有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列pPIC9K属于穿梭质粒也可以在原核表达而pPICZ系列比较容易操作大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选PIC9K操作麻烦一点大肠用amp抗性而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆在利用G418筛选多拷贝而且对于大小合适30—50KD的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。leslie要做毕赤酵母表达实验首先当然就要了解这个可爱的酵母了椭圆形肥嘟嘟的十分可爱她和大肠杆菌长得有较大区别大肠杆菌是杆状的因此在培养的过程中要区别这两种菌体除了气味浓度颜色以外也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧表达过程中染菌我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌那真是一段可怕的经历如果在不知情的情况下继续做下去那可以就是浪费大把的时间了。基本熟悉了毕赤酵母了解了她生长的喜好多糖偏酸环境生长的周期等等情况后当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上我的表达蛋白有些恐怖有100KD本来当然应该放在大肠杆菌中表达但是为了分泌表达其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错和糖基化修饰主要是这个方面因为我的蛋白是人源的表达出来用于酵母双杂因此需要有完备的糖基化修饰。这样我的DNA片段由于较长所以在做克隆的时候也要非常小心需要注意的是?酶切位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免可以采用平末端连接?虽然α-factor可以自动切除但是在设计表达的时候如果在N端不能出现任何多余的aa比如 药物蛋白表达需要特别留意说明书上有详细说明P13?有三种不同的读码框对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确这可是致命的问题?无论pPICZ还是pPICZα都有TGA终止密码子但是pPICZ系列没有ATG起始密码子有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利?如果不希望有c-myc和His-tag可以在基因片段末尾加入终止密码子?Pichia的密码子与酿酒酵母的相似有关基因表达偏好密码子的问题有人认为没有必要更换有人认为一定要换个人认为以产量为主要目的的可以考虑更换基因密码子而如果片段过长就比较麻烦不过有许多真核保守蛋白其实是和酵母密码子相似的?克隆菌株需要有recAendA试剂盒带有的TOP10挺好用的其它像是DH5α都行但是要注意带有筛选抗生素Zeocin的培养基要用低盐培养基NaCl减半这主要是因为怕影响到抗生素作用Zeocin平板要避光保存?测序引物可以用α-factor信号引物也可以用5AOX1引物?如果需要高量表达可以考虑做克隆的时候串联基因片段进行表达另外也可以在转化酵母的时候重复转化。?目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr这样的序列因为这个序列是激活蛋白水解酶的作用底物会影响表达另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x这样的序列x任何氨基酸因为这些序列容易受到容酶体的切割而且目的蛋白末端最好是alaaspvalser这样的氨基酸。除此之外许多高AT含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录也需要多加注意。第二步就是将线性化的DNA转化入Pichia酵母中。XiangYangEasySelect试剂盒准备了三种菌株X33GS115和KM71H。我倾向于选择X33因为这个菌株转化率和表达量相对而言较高如果你有电转仪electroporator可以尝试一下。如果没有的话EasySelect也准备了化学转化试剂——EasyCompTransformation但是由于转化率的缘故我建议使用电转仪。leslie在得到了正确的序列之后就可以准备转化毕赤酵母了试剂盒携带有的是X-33GS115和KM71H这三种毕赤酵母另外常用的还有SMD1168每种酵母的特点有些不尽相同Manual上写的很清楚其中X-33由于是野生型因此耐受性比较好如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌而GS115与X33一样都是属于MUT表现型也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长但是据说会对外源基因表达有影响KM71是MUT-型酵母在甲醇培养基中生长缓慢但是也有利于翻译后加工比如形成二硫键糖基化等等另外SMD1168则是基因组中的Pep4基因发生突变造成蛋白水解酶活性的丧失可以保护表达产物免受降解促进表达量的提高。一般来说如果是胞内表达应尽量用Mut细胞这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多约占Pp总分泌蛋白量的30-90如人乙酰胆碱酯酶B变异链的含量占到90使下游纯化更易进行。而对于分泌蛋白的表达无论是甲醇利用慢Mut-还是甲醇利用快Mut的细胞都可应用如在人血清白蛋白HSA为分泌型蛋白的表达中就看不出两种类型的细胞之间有什么明显差别。所以一般手册都会建议同时在这几种菌株中进行转化这主要是因为不同的基因在不同的酵母菌中可能表达量截然不同因此在最开始的时候建议多用几种酵母菌实验。另外有个保存问题原始酵母菌一定要保存好因为酵母在传代多次后会影响其转化率和表达量所以一方面分多管分装保存于-80?另一方面如果出现了转化或者表达的问题在其它方面都没有出错的前提下可以考虑重新取出新菌液每次都要涂平板挑菌。在准备酵母菌的同时也需要准备质粒由于酵母菌转化对转化质粒的要求较高量也较大5-10ug因此许多时候都会用PEG大提质粒或者用大提试剂盒总而言之要准备好足够量的质粒并且不要忘记也要同时准备空载体以做对照。 在转化前质粒需要进行线性化这主要是为了增加重组率EasySelect试剂盒表达量高的一个重要原因也就在于其原理是将目的片段整合到载体上大大的增加了目的片段的表达。线性化位点个人认为也会影响到表达量对于基因片段不大的蛋白可以考虑用几个线性化位点同时进行转化筛选但是如果片段大就有可能供选择的机会少而且也有可能遇上没有合适的线性化位点的情况这个时候也不是说不能进行表达但是准备的质粒就要增加10倍另外也可以进行部分酶切即先进行预实验掐定时间和酶量保证被切开的质粒有部分是在线性化位点切开而基因片段保存完好。在线性化之后的质粒就可以酒精沉淀回收了——中间步骤需要使酶失活说明书建议是热失活或者EDTA个人认为前者比较好主要是担心EDTA对于转化的影响另外这三种酶失活的温度都是65?/20min。沉淀回收之后是离心10分钟用80的酒精洗涤后风干这一步需要多加注意保证风干完全因为有实验证明残留的酒精对于转化的影响颇大。接下来就是酵母转化了这是令许多人头疼的一步也是影响实验决定表达的关键步骤。转化方法有不少例如电转化学转化原生质体转化其方法的难易程度和转化率高低呈反向递减的也就是说电转最容易转化率较高但要求有电转仪而原生质体最麻烦而且效果不好比较传统因此不建议使用EasySelect说明书上这么建议并且也详细说明了电转化学转化EasyComp和LiCl方法的过程可以按部就班。需要注意的是电转过程?最好每次都从平板上挑酵母菌用培养过的酵母放置时间不要超过一个星期?扩大培养的浓度一定要控制好个人认为不需要OD600达到1.3-1.51.0-1.3的就好这个时候的酵母比较新鲜转化率比较高?整个感受态制作过程中一定要在冰上操作离心最好也用冷冻离心机这是影响转化的关键——为了进一步保证这一点无菌水可以是冰水混合物另外山梨醇和电转杯都要预冷?电转仪需要预热所以准备感受态的时候就可以把电转仪打开了电转后山梨醇的加入要快曾有人做实验证明晚一秒就会降低转化的数量级虽然不一定可信但是我个人也认为这个过程要快电转后可以看看时间如果时间过短比如〈4就可能说明杂质较多会影响转化率?转化后温育是个增加同源重组增加存活率的过程需要注意不要感染了大肠杆菌再加入培养基30?摇一段时间可以取部分涂板不同浓度抗生素或者也有人将菌短暂离心弃去上清剩余全部涂板以保证转化率。化学转化如果没有电转仪LiCl转化是一种可供选择的方法转化率是102到103cfu/ug。主要过程为取过夜活化培养的菌液按11000接种于15ml新鲜的YPD液体培养基30?培养至OD600达到0.8-1.04?4500rpm离心5分钟用8ml冰预冷的无菌水洗涤菌体倾除洗涤液用1mL4?4500rpm离心5分钟沉淀用50μl冰预冷的100mmol/LLiCl悬浮最后定容至80-90ml。LiCl转化取适量单链鲑精DNA2mg/mL煮沸5min立即置于冰上备用取上述制备好的感受态细胞12000rpm离心15s吸弃LiCl溶液按顺序依次加入50PEG240ml1mmol/LLiCl36ml单链鲑精DNA25ml线性化质粒DNA10ml约10mg用吸头反复吹打使细胞沉淀与加入的溶液混匀30?静置温育30min42?热击20-25min4500rpm离心10min吸弃转化液细胞沉淀加1mlYPD培养基于30?200rpm培养2-4hr取转化混合液100ml涂布含100??g/mLZeocinTM的YPDS平板30?培养2-3天。第三步————————挑克隆筛选XiangYang在protocol中用了许多篇幅来指导这一步包括如何去通过平板筛选观测生长速率来确定Mut表现型等。这个过程需要3到5天而我一般只用用了4个小时进行PCRAOX引物筛选。leslie完成转化后就是克隆鉴定的过程了包括高拷贝筛选PCR鉴定和表型鉴定的过程其中我做的比较多的是PCR鉴定因为比较快具体过程protocol上说的很清楚其实也很简单就是冻融破菌进行菌 落PCR但是其中许多具体细节问题也挺让人头痛的第一就是破壁的问题许多人用PCR方法进行鉴定都无法得到结果甚至在表达出了以后还是无法得到这张鉴定图片主要原因之一就是无法正常释放酵母基因组一般通过培养菌然后进行沸水和-20?冷冻循环过程裂解细胞在目的蛋白片段比较合适的范围以内是可以得到好的结果的但是有时候片段过长模壁就会阻碍扩增所以我们实验室会用蜗牛酶很便宜的酶来的来帮助溶菌我看许多实验室也会这么做不过加入的时间不同而已其次也有奢侈的用试剂盒的。第二就是是模板量个人建议模板真的不要加太多了按照说明书的上的5ul我觉得还是多了而且建议总体积不用这么大当然加入模板的量也与自己培养菌的浓度以及用来冻融的菌数量有关。其次是假阳性和假阴性结果在Mut-和Mut情况是不一样的如果用的是5AOX引物KM71H会出现3.6kb的片段而Mut则会出现AOX1基因原本长度的片段——大约长2.2kb因此如果的基因片段长度相似要注意区分。建议PCR过程中使用多对引物进行反应包括自己基因的α-factor的5AOX的都可以反正各种对照多了有利于比较——当然前提是你不能晕了头。掉了毛的鸵鸟巴斯德毕赤酵母包含醇氧化酶-1AOX1基因的启动子的转录终止子5’AOX1和3’AOX1他们被多克隆位点分开外源基因可在此插入此外载体中还包含组氨酸脱氢酶基因HIS4选择标记HIS4区的整合方式为位点特异性单交换引起的基因插入整合后使组氨酸缺陷型宿主his4恢复野生型.HIS4区或AOX1区位点的整合都使转化子具有HIS4基因因而可利用表型差异进行筛选酵母GS115具有组氨醇脱氢酶缺陷型基因his4可接受含HIS4的载体而具有HIS表型以筛选转化子.及3’AOX1区当整合型载体转化受体菌感受态细胞时他的5’AOX1和3’AOX1能与染色体上的同源基因重组从而使整个载体和外源基因插入到受体菌染色体上在加入甲醇作为唯一碳源的培养基中外源基因在5’AOX1启动子的控制下表达.在载体中引入Tn903Kanr基因抗G418有助于筛选高拷贝转化子转化子的拷贝数与抗G418的能力有关通过筛选抗G418能力强的酵母即可获得高拷贝转化子.外源基因是以同源重组的方式插入到酵母菌的染色体中因此不易丢失多次传代后酵母仍能稳定表达外源蛋白具有良好的遗传稳定性.第四步————————表达XiangYang将你的克隆在YPD培养基中培育到OD600值达到6.0就可以离心收菌。用表达培养基比如BMMY重悬沉淀在30??C培育过夜。leslie筛选鉴定出自己的重组子可以说什么都不能证明还是要看这一步的酵母表达有许多人在酵母表达上花费了大量的时间——不同于大肠杆菌的两天出结果一次毕赤酵母的表达就需要起码一周的时间筛选了上百上千的克隆但是仍然是竹篮打水一场空我个人建议如果在筛选完3批以上就可以放弃这一批转化的酵母菌另外调整进行重新转化。另外刚开始的时候可以用小量表达可以用5ml生长慢型生长快型阴性对照空质粒阳性对照可以是曾经表达成功的重组子和没有进行转化的酵母菌的单克隆BMGY中培养到OD值2-6离心收菌如果怕污染或者麻烦可以放置酵母菌一段时间一半为20-30分钟让菌沉淀下来小心倾倒去上清培养基获得菌转入BMMY中诱导表达这些步骤都需要在超净工作台里进行如果要区分是否染菌可以取一些到显微镜下观察或者闻气味酸甜的是酵母观颜色乳白色的是酵母。除此之外如果是小量表达有可能会在没有达到4天的时间培养基就干了所以可以适当补充一些以及在摇床里放置盛有无菌水的深口瓶来保持摇床里湿度。诱导物甲醇注意要在超净台中打开可以分装到灭过菌的瓶子中——当然甲醇是不能灭菌的而且也要注意在用酒精灯过甲醇瓶口的时候要小心如果真的引起爆炸那可就损失大了。另外如果觉得每天添加甲醇麻烦也 有人用一次性注射器透过纱布添加甲醇这个方法可能会造成染菌慎选。说到纱布就想到了通气性问题酵母在无氧和有氧的情况下都可以存活但是在甲醇诱导的情况下毕赤酵母用的是醇氧化酶自然氧气量对于这一基因的表达影响重大但是由于害怕感染大肠杆菌纱布裹的也不能太少最好专辟出一个摇床进行三十度酵母表达这样可以考虑将纱布减少到3—5层同时需要注意的是摇瓶内菌液体积不要超过10-30。每天取样出来进行SDS-PAGE电泳鉴定能这样最好不过每天做胶跑胶染色真的很麻烦可以汇集一批同时跑不过样品一定要煮过冻存而且每次取样不要反复冻融最好分装保存——因为蛋白经煮沸变性会不稳定容易降解。另外为了防止蛋白在分泌出来的过程就降解了特别是小分子蛋白也可以通过调节培养基pH值抑制蛋白水解酶的活性这一方面说明书讲解得详细还可以加入酪蛋白氨基酸等保护物质竞争性抑制蛋白水解酶的活性来防止表达产物降解。如果使用的是分泌型培养基按道理收集培养基上清就可以进行下一步分析了但是由于培养基中的蛋白浓度PAGE胶一般是检测不出来的——除非你的表达蛋白量非常大。所以需要进行浓缩方法有TCA法硫酸氨盐析PEG沉淀透析超滤等等当然最简单的就是煮沸蒸发水分浓缩了。另外跑胶的时候同时对照酵母胞内蛋白以防没有分泌出来。SDS-PAGE的配置参见分子克隆注意你的蛋白大小与胶的浓度的对应性如果小到20kD以下可以考虑用tricine胶不过是个需要全盘重新准备的过程要考虑清楚。如果选用的载体是带有信号肽的虽说是分泌表达好纯化但实际上毕赤酵母本身还是有本底表达的而且有时候会造成假阳性所以最后表达过程需要用Westernblot或者Elasa通常都是用WB具体的细节可见WesternBlotting前传想成为高手吗系列文章另外要提一句的是如果本身蛋白没有合适抗体如果是利用从大肠表达出来的蛋白做出的抗体也有可能与用真核系统表达出来的蛋白无法发生免疫作用可以选用anti-myc或者anti-his的前提当然是你的蛋白没有提前终止。其它在表达中可能出现的情况包括表达量低没有分泌表达针对pPICZa系列头两天蛋白量较大无法重复表达出来的蛋白偏大等等需要分各个方面分析原因比如蛋白明明加上了信号肽但是就是无法分泌出来这可能是蛋白结构在通过细胞膜的时候受到了阻碍可能需要重新转化更换线性化位点或者更换菌株如果蛋白表达第一天较高但是之后越来越少这很有可能是蛋白降解了或者产生了竞争表达毕赤酵母无法重复的问题比较严重许多情况下在第一次获得了高量表达之后就再怎么也重复不了这个结果遇到这种情况真是令人非常痛苦可是除了重新摸索条件还能怎么样呢而表达出来的蛋白分子量偏大则是个正常现象除了糖基化以外还有其它原因比如二聚体这些需要进行WB或进一步实验验证。第五步————————发酵和产物纯化XiangYang我用的是HisTraPColumnsGEHealthcare经过简单的纯化之后我可以得到90的目的蛋白。我的目的蛋白是一个大小为45kDa可以通过二硫键形成反向平行二聚体antiparallelhomodimer的糖蛋白经过纯化我通过一个细胞增殖实验cellproliferationassay检测了其活性结果表明表达出来的蛋白在体外有完全的活性。并且我也在体外利用受体分析了蛋白结合活性与对照通过大肠杆菌和Bacular细胞未带tag的蛋白相比his-tag有一点副作用。伊可丽由于在摇瓶培养中巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的水平往往不能准确地反映罐发酵中的表达情况使之成为令人头痛的问题。主要原因是在摇瓶培养中培养液的pH值无法控制培养物通气不充分及无法控制添加碳源的最适速率。但是为了避免对每一个表达菌株进行繁琐的发酵罐培养条件的实验仍需摸索表达菌株的摇瓶培养条件使其产物的表达量与预期的发酵罐培养 结果相近。总而言之EasySelect系统是一个便于操作的酵母表达系统我已经使用这一 系统表达过15个类似物了每一个我都获得了超过1mg/1升培养液的纯化蛋白。