甲苯咪唑急性毒性及在异育银鲫体内药动学与残留的研究

甲苯咪唑急性毒性及在异育银鲫体内药动学与残留的研究 甲苯咪唑急性毒性及在异育银鲫体内药动学与残留的 研究 华中农业大学 硕士学位 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 甲苯咪唑急性毒性及在异育银鲫体内药动学与残留研究 姓名:郭东方 申请学位级别:硕士 专业:水产养殖 指导教师:艾晓辉 20090601 甲苯咪唑急件毒性及在异育银鲫体内药动学和残留研究 摘要 本文研究了甲苯咪唑对异育银鲫的急性毒性;建立了高效液相色谱同时测定异 育银鲫肌肉组织中甲苯咪唑及其代谢物氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑法;研究了25 ?水温下甲苯咪唑在异育银鲫体内的药代动力学及残留消除规律。 1(研究了甲苯咪唑浸泡和口灌对异育银鲫的急性毒性。浸泡组浓度分别为O(5、 1、2、4、8 mg,L，96h观察异育银鲫各组死亡情况，得到LCso I(05mg,L，安全浓 00、200、400、800、1600 度为0(333 mg,kg体 重给药， mg,L。口灌组剂量分别按1 96 h观察异育银鲫各组死亡情况，得到LD50 244(2 mg,kg，安全量为68(68mg,kg。 2(建立了一种用高效液相色谱 HPLC 同时测定异育银鲫肌肉组织中甲苯咪 的方法。异育银鲫肌肉组织用乙酸乙酯提取，萃取物旋转蒸发至干后用1mL二甲基 甲酰胺_o(05mol,L磷酸盐缓冲液 3:7，v,v 定容。色谱条件:WaterssymmetryC18 mmx4(6n'lnl，5 反相色谱柱 250 mol,L磷酸二氢铵溶液 gm i流动相:乙腈_0(05 33:67，v,V ;流速:0(8mL,min;检测波长为298nlTl;检测温度为室温。在10"-" 120 出限为3ttegkg。 3(采用高效液相色谱法检测甲苯咪唑 MBZ 在异育银鲫血浆及组织中的浓度， 数据经3P97药动学程序分析。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:a 25+1?的水温条件下，异育银鲫单剂 量口灌MBZ 20mg,kg，血药经时过程符合二室开放式模型。主要药代动力学参数为: 52(26 180(07 吸收速率常数磁0(235 h;药时曲线下面积AUC h1;消除半衰T 1,2 p 1 pg??h,mL;表观容积分布Vd伊2(47L,kg:清除率CL s O(11 mL,h ,kg;达峰时间,ealc 6(20 h;浓度Cm般4(14 I-tg,mL。b 异育银鲫多剂量 20mg,kg 给药后，以MBZ 残留物，其在异育银鲫肝脏中浓度最高，消除时间最长。以肝脏为靶组织， 254-1? d。 的水温条件下，建议休药期为18 关键词:甲苯咪唑;羟基甲苯咪唑;氨基甲苯咪唑;异育银鲫;急性毒性; 药代动 力学;标示残留物 华中农业大学2009届硕士学位论文 ABSTRACT In mebendazoleto auratus this of johnnycarp Carassius paper,Acutetoxicity gibelio wasinvestigated;Ahighperformanceliquid UV detectionfor ofresiduesofmebendazoleandits methodthesimultaneousdetermination metabolite in auratus carp Carassius hydroxymebendazole，aminomebendazolejohnny has on andtissueresiduesof been gibelio musculeestablished;Studiespharmacokinetics mebendazolein auratus 25?( johnnycarp Carassiusgibelio at 1(Theacute of to auratus mebendazole toxicity johnnycarp Carassiusgibelio Was mebendazoleWastaken atthe resultsshowedthat soaking experimented(The concentrationofO(5,8 96 ofmebendazoleon mg,L(Afterh，TheLC50 johnnycarp auratus than1(05 concentrationof is Carassiusgibelio isbigger mg,L(The security 0(333 wastaken atthedoesof0(1-16 mg,L。mebendazoleorally mg,l gbodyweight( After96 ofmebendazoleon auratus LDs0 gibelio is h，The johnnycarp Carassius than244(2 Safedoseis68(68 bigger mg,kg(The mg,kg( 2(A forthe simplehigh-performanceliquid determinationof itsmetabolites mebendazole MBZ and auratus gibelcarp Carassiusgibelio MBZ--OH ，aminomebendazole MBZ-NH2 in muscle(Musclewereextractedwim extractswere to and ethyl(the evaporateddryness in thentheresiduesweredissolved1 mL phosphate extractwas onareversed reversion C18 buffer 3:7，“v ，Theseparated phase mmx4(6 room column 25011111"1，5lam size attemperature， chromatogramphic particle whichWasthenelutedwithacetonitrile―O(05mol,Lammoniumbuffer 33: 67， phosphate aflowrateof0(8mL,min(TheUVdetectionWas foaificationlevels v, at at如98姗(At of recoverieswere81(2,-86(3,forMBZ(70(6,, 75(O,for 10,120 tg,kg,mean of Was2 86(5,-93(O,for detection MBZ-NH2，and MBZ-OH，respectively(Limit forMBZand3 forMBZ-OHand pg,kg I，tg,kg MBZ-NH2( 3(Theconcentrationsof determinedthe mebendazole MBZ wereby High using Performance were witllthe LiquidChromatography(Dataanalyzed 3P97(Theresultsindicatedthat:曲The auratus computerprogram carp Carassius Johnny oralMBZ20 at25+1?(The gibelio single-dosemg,kg plasma courseMBZCanbedescribeda model(Themain of by two―compartmentopen II 甲苯咪唑急性毒性及往异育银鲫体内药动学和残留研 究 wereasfollows:The rate MBZ parameters absorptionconstant 酗of pharmacokinetic Wasfoundtobe0(235 theelimination was52(26h( h一，whereas drug half-life TI,2p ofthe undertheserumconcentraction-time180(07 Thearea cure AUC WasPg‘h,mL，The was 2(47 totalclearanceof distribution MBZ as volume VdF ofcomputedL,kg，The estimatedtobeO(11 ofimum MBZ CLs Was 1 mL,h ,kg,Thetime―point plasma of theimum concentractionthe drug Tpeak andplasma calculatedas6(20hand4(14 sumofMBZanditsmetabolites pg,mL(b The MBZ-NH2， weretakenmarkerresidueafter MBZ-OH administration 20 multiple-dose mg, kg (The inliverWas thanother resultindicated廿lattheconcentrationofmarkerresidue higher takeliveras tissueinthis withdrawlshouldnot tissues(If target experiment(Theperiod belessthan18dunder25+1?( Key carp auratus residue Carassiusgibelio ;Acutetoxicity;Pharmacokinetics;Marker III 华中农业大学2009届硕十学位论文 缩略语表 IV 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 历 如需保密，解密时间 年 月 日 是否保密 'q4- 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名:嚷专?易 帆珈产乡月,日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本;学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注:保密学位论文 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文 在解密后适用于本授权书。 „„始锨豸锄张删 蛳期:q年,月酝 签名魄叩年‘月 日 注:请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 甲苯咪唑急性毒性及在异育银鲫体内药动学和残留研究 第一章文献综述弟一早义陬综尬 酮咪胺酯，安乐士，是一种常见的广谱驱虫类药物。1971年由VanGeldev首次化学 始生产。甲苯咪唑既是人用药，也是兽用药，具有高效广谱杀虫性质，对哺乳动物 低毒，适合作为控制动物及鱼体消化道寄生虫病的药物。下面对甲苯咪唑的研究概 况作一综述。 1甲苯眯唑及其代谢物的名称和化学结构 量分别为297(31，238(30。三种物质的结构式见图1―1。 O MBZ NH ?一NH2 N MBZ-NH2 奄、? MBZ(OH 图1-1甲苯咪唑及氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑的化学结构图 1-1(Molecularstructuresof andMBZ-OH MBZ,MBZ-NH2 Fig respectively l 华中农业大学2009届硕士学位论文 2甲苯咪唑药效学研究进展 2(1甲苯咪唑杀虫作用机理 甲苯咪唑的作用机理是通过抑制寄生虫对葡萄糖的吸收，导致虫体糖原耗尽， 同时抑制延胡索酸还原酶系统，阻碍ATP的产生，最终使寄生虫衰竭而死 亡，它不 但能驱除成虫、幼虫，而且能抑制虫卵的发育。 2(2甲苯咪唑在人体中的运用概述 et 甲苯咪唑作为一种广谱杀虫药，可以治疗人体内鞭虫 Milleral， 1974 ;蛲 et etal，2004:Luderet al， 虫 蒿红梅等，2007 ;囊虫 Kaya al，1986: Teggi et 1993 ;蛔虫 Albonico et et a1，1989 ;麦地那龙线虫 Kale et 儿童蠕虫感染和肠道原生动物 Gutierrezal，2002 等多种人体寄生虫病。杨维 平等 1995 采用试管滤膜培养法比较观察了甲苯咪唑对蛔、鞭、钩虫卵的体外作 用，发现该药对3种虫卵的发育都有抑制作用，有效浓度分别是25、25和50 pg,mL。 张进顺等 1998 运用形态学方法，对比观察了吡喹酮，甲苯咪哗和阿苯达唑对微 小膜壳绦虫的杀伤作用。结果表明:甲苯咪唑对短膜壳绦虫具有一定损害作用。安 春丽等 1990 观察到复方甲苯咪唑对旋毛虫虫体琥珀酸脱氢酶 SDH 和苹果 酸 脱氢酶 MDH 的活性有抑制作用，虫体囊色周围出现显著的以嗜酸粒细胞为主的 炎性细胞浸润，终至填充了整个囊包，在电镜下也发现相应的组织学改变。陈亚伟 等 1990 报道了治后钩虫卵阴转率，提出复方甲苯咪唑组优于复方噻嘧啶组，虫 卵减少率均在95,以上，治疗十二指肠钩虫和美洲钩虫阴转率分别为100,及77(5,。 曹滇英等 1996 根据国内医学报道甲苯咪唑对蛲虫有较高的疗效，提出该药适合 群体大面积使用，建议幼儿应每年服用两次甲苯咪唑和左旋咪唑治疗。弥散性包虫 22 周， 病引起再发性水肿同时还导致过敏性休克，病人持续口服甲苯咪唑1200mg,d et 症状得到缓解，没有副作用发生 Werczberger 苯咪唑治疗贾第虫感染56例，包囊阴转率为92(3,，未见明显药物反应，表明甲苯咪 哗对贾第虫感染有良好效果。服用甲苯咪唑后，采用改良加藤氏法检测蛔虫、钩虫、 地患寄生虫病人口服甲苯咪唑500 mg，对蛔虫病的治愈率达到93(2,，同时减少了虫 卵量，虽然对鞭虫病和钩虫病治愈率较低，但是对虫卵的杀灭率很高。Cowden等 2000 报道了甲苯咪唑可以治疗儿童和孕妇的土源性蠕虫感染。 2 甲苯咪唑急性毒住及柏!异育银鲫体内药动学和残留研究 2(3甲苯咪唑在哺乳动物中的应用概况 Terada等 1993 报道了脊形管圆线虫感染小鼠，单剂量口服甲苯咪唑5 mg ,kg， 连续用药5d，虫卵得到很好的抑制。受旋毛虫感染沙鼠，经阿苯达唑和甲苯咪唑治 疗后，小肠雌虫产蚴减少且在组织、器官移行的幼虫和骨胳肌内寄生的囊包受到抑 制和杀灭，组织的损伤逐渐减少并修复，血清酶恢复正常 黄学贵等，2003 。罗 勇生等 1995 用50条广州管圆线虫第3期幼虫感染大白鼠6d后口服甲苯咪唑50 mg,kg ,d。结果显示:该药物有良好的杀虫效果，虫减少率达100,。肥育犬的消化 道寄生虫普遍存在，常见的有蛔虫，球虫，钩虫，绦虫，服用复方甲苯咪唑后临床 症状消失，体温、食欲恢复正常，无继发感染，驱虫效果较好 吴忠等，2006 。 刘向东等 2007 报道了甲苯咪唑和阿苯达唑治疗可以减轻旋毛虫感染小鼠的病变 程度，使因感染所致的鼠毛中Zn、Cu、Fe3种微量元素的含量的降低得到不同程度 的恢复。刘晖等 2003 报道了沙鼠受旋毛虫感染，经甲苯咪唑治疗后显微观察发 LDH活性增高，甲苯咪唑可以破坏旋毛虫囊包的囊壁，损伤虫体，可抑制旋 毛虫幼 虫的有氧代谢。李学伍等 1992 研究了105只人工感染旋毛虫的大白鼠较经济的 给药时间为:感染期40----90d，给药10d;感染期90--一165d，给药15d;感染165 d以上，给药20d。陈代雄等 2005 报道了广州管圆线虫感染大鼠70d后，用灌 d，减虫率为28(32,。薛弘燮等 2000 胃的方法给予甲苯咪唑50mg,kg，1次,d，连续2 报道了将甲苯咪唑微丸制成100、50和25 mg,kg三个不同剂量悬液，对感染细粒棘 球蚴6个月的小鼠经口灌胃，结果表明甲苯咪唑微丸在体外对原头节有直接 致死作 et 甲苯咪唑治疗鼠类弓形蛔虫病，有效的抑制了虫体生长 Bard6nal，1995 。 小鼠 感染旋毛虫3d后，口灌甲苯咪唑6(25 et d 后水泡 al，1978 。Pandey等 1998 报道了山羊口服甲苯咪唑50mg,kg，14 绦虫和囊尾蚴可以完全被杀死，单剂量皮下注射山羊50 m眺g也可以达到好的 驱虫 效果。Karr等 1980 报道了野生猕猴肠道感染毛圆线虫，类圆线虫，链咽 线虫， 结节线虫，类毛体线虫，通过甲苯咪唑治疗可以有效的抵制了这些虫病的发生。甲 苯咪唑对哺乳动物的杀虫试验，均显示其在哺乳动物寄生虫防治方面有较好的效果。 2(4甲苯咪唑在水产中的应用概况 李志青等 2000 研究了复方甲苯咪唑、甲苯咪唑、左旋咪唑对拟指环虫的杀 灭率，结果表明甲苯咪唑对拟指环虫具强杀灭能力，左旋咪唑对拟指环虫无杀灭能 3 华中农业大学2009届硕士学位论文 力，可用甲苯咪唑替代复方甲苯咪唑。李海燕等 2005 报道用浓度为0(2、0(4和0(8 h后其阳性检出 率分 mg,L的甲苯咪唑药浴患伪指环虫病 染率为92, 欧洲鳗，120 别为54,、10,和O,，甲苯咪唑对欧洲鳗伪指环虫病有显著疗效。通过对伊维菌素， 敌百虫和甲苯咪唑三种药物治疗异育银鲫指环虫效果比较，发现甲苯咪唑的效果最 好 稽爱华等，2007 。林炫峰等 1998 报道了甲苯咪唑对指环虫、三代虫等单殖 吸虫类有快速杀灭的作用。甲苯咪唑对欧洲鳗的安全浓度为32(8mg,L，欧洲鳗鲡经 1 h可有效杀灭伪指环虫及虫卵，并防止继发性烂鳃病发生 张宝忠等， metE药浴24 mg,L和10mg,L浓度的甲苯咪哗浸 泡鳗鲡10 1997 。Szekely等 1987 分别采用100 min和24 h，对治疗短钩伪指环虫 Pseudodactylogyrus 效果很好。甲苯咪唑通过浸泡可以用来治疗鳗鲡鳃的伪指环虫，甲苯咪唑的效果与 et 水温有关，水温越低效果越差 Buchmann 1998 研究了粗皮鲷口服甲苯咪唑可以有效治疗单殖吸虫。红鲷药浴甲苯咪唑可 et 消除多微小吸盘吸虫的感染 Kathariosal，2006 。甲苯咪唑对水产动物寄生虫 防治试验表明，甲苯咪唑在防治水产动物寄生虫疾病上有较好的效果。 3甲苯咪唑毒理学研究进展 3(1甲苯咪唑对人体的毒性 席成亮等 1997 报道了服用甲苯咪唑后患者全身不适，搔痒、躯干及四肢迅 速出现散在性大小不等之凤团。白玲等 1999 报道服用甲苯咪唑出现皮疹，视神 经视网膜病变，出现血尿现象。景宝洁等 2007 报道了1例肝包虫病患者，术后给 U,L。大剂量的甲苯 予口服甲苯咪唑200 d后，患者ALT升高到101 mg，2次,d，10 etal，1986 。 咪哗治疗肝病患者的肝棘球囊病，易引起骨髓发育不全 Bafiares 3(2甲苯咪唑对哺乳动物的毒性 长期饲喂性成熟大鼠甲苯咪唑60mg,l g，以治疗短膜壳绦虫和四翼无刺线虫， , 经过三代研究发现其产子数量减少，尾部扭结病发生率很高，最高达到46 Baskervilleet 为1434 mg,kg。雌性紫藤鼠 mg&g，雄性为714mg,kg;其它啮齿类和兔的LDso 1280 投喂甲苯咪唑151(6 mg&g，雄性127(3mg,l g，13周后出现血清碱性磷酸酶 增高现象， 同时雄性睾丸受到损伤，有肝细胞液泡化和胆管增生。甲苯咪唑 0(39,---,0(78J(tg,mL 培养24h和48h对CHL细胞所诱发的染色体变化率显阳性，说明甲苯咪唑具有损伤小 4 甲苯咪唑急性毒性及在异育银鲫体内药动学和残留研究 鼠骨髓细胞染色体和诱发CHL细胞染色休畸变的遗传物质存在 张辉等，1992 。 Higa等 1992 研究调查了甲苯咪唑对人，小鼠和大鼠肝脏细胞系的毒性。指出人 体肝细胞对甲苯咪唑的敏感性要比鼠的强，以0(25,O(50 h， mgm的浓度培养细胞 42 导致毒性产生，O(008 mg,L会抑制细胞生长。这种抑制作用在临床上可导致肝脏细 胞中毒和骨髓细胞生长受到抑制。EMEA 2001 报道了怀孕期小鼠服用甲苯咪唑 也导致胎儿畸形产生。 3(3甲苯咪唑对水生动物的毒性 甲苯咪唑对欧洲鳗的毒性随水温不同而不同。水温为26?，28?时处理24h试 验组鱼体无死亡，而水温为30?时，浓度为4(8，9(6mgm组处N24h均出现大量死 亡，浓度为0(6 h组亦出现大量死亡;而26?，28?条件下鱼体基本 mg,L，处理72 无死亡，甲苯咪唑对欧洲鳗毒性随水温升高而增强 李志青等，2000 。李海燕等 2005 报道了甲苯咪唑浓度为0(4 mg,L和0(8mg,L时，日本鳗、欧洲鳗，翘嘴鳜， 红剑和建鲤是安全的;浓度为2mg,L时，前3种试验鱼全部存活，而红剑和建鲤的死 亡率为6,和4,。指环清的浓度达到2 mg,L时，翘嘴鳜、日本鳗和欧洲鳗尽管没有出 现死鱼现象，但已表现不适应的症状，而红剑尾鱼和建鲤已开始出现少量的死鱼， 存活的鱼也表现出不适，这说明2mg,L的指环清对鱼类产生毒害作用。林炫峰等 1998 研究发现甲苯咪唑易引起鳗鱼中毒，中毒鳗鲡于池边处缓游，反应迟钝， 鳃、皮肤上的粘液分泌增加，鳍条充血，解剖可见肝脏充血，胆囊肿大。镜检可见 鳃丝充血，有血窦，鳃瓣增生。 4甲苯眯唑检测方法概况 对于甲苯咪唑的检测方法，因研究的目的与检测要求的不同所采取的方法亦有 所不同。国内外甲苯咪唑的检测有滴定法、光谱法和色谱法。 4(1滴定法 取药品约250 mL，微热使其溶解，冷却后，按照电位滴定法，用 mg，加冰醋酸30 高氯酸滴定液滴定，并把滴定的结果用空白试验校正。Wahbi等 1978 用直接和 间接非水滴定法测定了制剂中的MBZ的含量，两种方法的回收率分别为100(2,和 率为101(3,，并与紫外分光光度法测定结果一致，片剂中辅料对测定无干扰。 5 华中农业大学2009届硕+学位论文 4(2光谱法 4(2(1紫外分光光度法 nlTl处 Wahbi等 1978 用紫外分光光度法对MBZ片剂的含量进行了测定，测定288 的吸收度，得到70,的高氯酸水溶液是紫外法测定MBZ片剂的最好的溶剂系统之一。 4(2(2比色法 利用在碱性条件下MBZ，水解成2一氨基一5一苯甲酰基苯并咪唑显色的原理， 用比色法测定了MBZ的含量。测定420nln处的吸收度，浓度在25,250 mg,L的范围 et 内，符合Lambert--Beer定律，平均回收率为98(36, Patel 5(24和温度30-士2?时反应形成可溶解于丙酮的稳定的橙 利用MBZ与碘化铋钾在pH 色复合物，在430nin处有最大吸收，此法比药典法灵敏，取样量少，且制剂 片剂 和混悬剂 中的辅料不干扰测定。Ram等 1981 用盐酸羟铵、二环已基碳二亚胺 和三氯化铁为显色剂，与MBZ反应，结果在520nlTl处有最大吸收，浓度在0(4(-一2(0 mg,L的范国内与吸收度呈良好的线性关系。 4(2(3磷光分光光度法 Baeyens等 1 混悬剂的含量测定方法。吸收波长322nlTl，发射波长454nnl。检测艰为10 p‖L。 浓 度在10--一8000 p‖L范围内呈线性关系。片剂和混悬剂的平均回收率分别为98,和 99(9,，RSD分别为2(86,和2(65,。 4(2(4荧光分光光度法 1,13的各种有机溶剂中很少或几乎没有荧光，可能是由于荧光被其 MBZ在pH 分子结构中的羰基猝灭。用碱水解后，其荧光行为得到了一定程度的改善。Fattah 等 1983 用此性质测定了MBZ片剂和混悬剂的含量。在460nnl处测定荧光强度 激 发波长365nm 。检测浓度O(1,10 mg,L范围内线性很好 r:O(998 ，检测限为0(1 成荧光衍生物，测定MBZ制剂的含量。在360rlrfl处测定荧光强度 激发波长为300 nm 。供试液浓度在0(01,6 L范围内线性关系良好 r O(9956 。片剂和 mg, 混悬剂 6 甲苯眯唑急性毒性及在异育银鲫体内药动学和残留研究 12(5时反应形成具有较强的荧光强度的衍生物，对MBZ进行测定。测定波长为396 nln，激发波长为282nln。供试液浓度在0(04--一12 mg,L范围内线性良好，检测限为40 1(64,。 4(3色谱法 4(3(1薄层色谱法 TLC 法 1978 用薄层色谱(紫外分光光度法测定了MBZ原料和制剂的含量。 4(3(2高效液相色谱 HPLc 法 中的MBZ及羟化甲苯咪唑的浓度。MBZ矛I羟化甲苯咪唑分别在20"--160 gg,L和40"-" 320肛‖L范围内线性关系良好，检测限分别为5p‖L和2(5p‖L，回收率分别为 7(0磷酸盐缓冲液， 流速: 96(7+3(9,和68(4+7(9, n 50 。流动相:20,异丙醇的pH 2(5mL,min;电化学检测器。Allan等 1 Pak 979 报道了用SepCls柱快速分离血样， 然后用等度洗脱和梯度洗脱的HPLC法测定血浆样品中的MBZ的方法。等度洗脱和 mL用乙酸乙酯提取，色谱 梯度洗脱的检测限分别为20肛‖L和10p‖L。人血浆血浆2 mmx3 C18ODS柱 300mm ;检谢波长:313nm;内标:氟苯咪 条件:Bondapak 唑 O(15 etal，1979 。Mourot mg,L ;检测限为10“‖L;回收率为75(9+3(8, A1ton 等 1978 报道了用正相等度和反相梯度沈脱系统法测定咪唑类药物制剂的含量， 认为电化学检测器显著地改善了高效液相色谱法测定MBZ的专属性和灵敏 度。 Bettor等 1991 进一步将检测限提高到了0(25 mol,L mL,min。 nlTl。柱温为室温;流动相为甲醇一O(05NH2H2P04 50:50 流速为l MBZ在25"-250(g,L范围内的平均回收率为84(4+4。4,，最低检测限为6p‖L。以阿 苯达唑为内标，采用反相高效液相色谱测定血中的甲苯咪唑浓度。流动相:甲 mol,L硫酸铵缓冲液 58:42 ;流速1mL,min，检测波长为24711n1。标准 醇一O(01 ng,mL， 7 华中农业大学2009届硕十学位论文 血浆加入阿苯哒唑为内标，以0(5mol,L的硼砂―-NaOH缓冲液3mL碱化后经乙醚提 BDS 取，固相萃取，进行HPLC沏,4定，采用Hypersil C18色谱柱，流动相为甲醇一O(1 mL,min;检测波长310nl,l。方法平均 mol,L NH4 2S04溶液 60:40，V,?;流速1(0 回收率为97(21,。平均RSD为3(56,，最低检测限为0(02 mL。杨方等 2004 gg,, 采 用乙酸乙酯,氨水作为提取溶剂，方法在1,500 rig之间呈线性相关，回归方程r 6832(4 X-1810(3，相关系数r 0(9999，检出限为0(4 ng。对于0(025、0(050、O(10mg,kg 检测肌肉组织中的甲苯咪唑，氨基甲苯咪唑和羟基甲苯咪唑。乙酸乙酯提取，经氨 测限为1(4，O(7，1(5 pegkg，三者的回收率依次 Og,,kg;定量限分别为2(3，1(1，2(1 et 为:90,，92,，74, Hajee mol,L磷酸二氢铵，检测波长 经乙酸乙酯提取，由硅胶柱净化，流动相:乙腈一O(05 311 2003 采用液相色谱一质谱联用测定绵羊肌肉甲苯咪唑及其代谢物的含量，用碱化 后的乙酸乙酯提取药物，流动相A液含有0(1,的甲酸溶液，B液为乙腈。采用梯度洗 7:3 ，检测波长290 系数r 0。984，线性范围为200--一800 长下检测，甲苯咪 nn-i检测 唑的达 等 1997 以磷酸二氢钠一乙腈为流动相，在290 峰时间为12(81min，线性范围为30--一240 0(999 ，回收率98(5,。 5甲苯眯唑的药代动力学研究概况 王长虹等 1999 报道了家兔口服甲苯咪唑乳剂和片剂后的药物动力学 参数。 0(28和0(18 乳剂和片剂的药动参数分别为:Ke0(16和O(12h,;Ka h,;t I,2l‘c 2(5和 AUC6544(5 (8hl 5(1和6(2hl 3 t 1,2l a 为4(5和6(3h;C懈484(4和86(3ng,mL;T 和1545(8 15(0和74(0m。新西兰种兔服用甲苯咪唑片剂 40 h??ng,mL;CL mg ,kg 和甲苯咪唑p(CD包合物 40 mg,kg 血药参数经3P87分析发现它们都符合 单室模 O(514和0(185h,; 型。饱和物与片剂的主要药动参数分别为:Ke0(141和0(125h,;Ka T 4(48和6(67 h;C础572和86(33ng,mL;AUC 饱和物在兔体内的利用效果较好 罗兰等，2000 。李岩等 1999 研究了给家兔口 服甲苯咪唑微丸和片剂两种形式下的药物动力学和生物利用度，得出的药动模型均 甲苯咪唑急件毒性及在异育银鲫体内药动学和残留研究 符合一室模型，微丸的吸收较快，达峰时间短，峰浓度高，AUC明显高于片 剂，表 包虫病人口服甲苯咪唑10 h达峰时 mg,kg的药物动力学，得到消除半衰期2(8---(9(0 间从1(5,7(25h达峰浓度从17(5"--500 ng,mL，初期剂量为 69(5ng,mL 长期治疗 137(4 物很难消除，由于甲苯咪唑与血浆蛋白有很强的结合作用，因此在使用方式上应该 考虑是否有肝脏疾病。Pandey等 1998 静脉注射羊5mg,kg的甲苯咪唑的到药动 模型符合二室模型，主要参数:a1(33+0(31 0(04+0(01 h,;tv2。0(65士O(13 h,;p h;tl,2B 23(15+6(71 0(07+0(02;Vd0(21+0(02 h;K120(7+0(18:K210(59士O(14;Kel mL;CL O(11+0(04 mL,kg ,min;单剂量口服40 mg,kg得到血浆中C有两个值分别为 5(8+0(8和6(1士0(56 gg,mL，奶中C为10(05+0(8I-tg,mL，胃液中为40(104-1(80 14(71+0(84 rtg,mL。血浆tl,2h为3(2-4:0(06 h;h,2p 0(04+0(02h,，Vd37(67+24(34 B mL。符合二室开放模型，在静脉注射后a值较小 1(334-0。31 h-1和tl，2。0(654-0(13 服用两种不同包衣的甲苯咪唑药片，结肠定向甲苯咪唑药片和迅速释放甲苯眯唑药 片。口服每人50 1(O和528(3+86(10 mg。前者和后者AUC分别为554(0-J:21 ng??h,mL， 消除半衰期为13(24-5(6和8(24-2(9 h。ta分别为9(2+1(7，4(14-0(9h;C瑚x分别为25(7士2(6， 37(24-6(8 ng,mL。 6甲苯咪唑残留研究概况 h，分 Allan等 1982 研究了小鼠静脉注射甲苯咪唑得到其消除半衰期为3(2 布半衰期为O(4h，主要代谢物为羟基甲苯咪唑。Iosifidou等 1997 用1mol,L的 甲苯咪唑浸泡欧洲鳗鲡24 h后 h后研究其残留消除规律，肌肉中甲苯咪唑在浸泡4 1 浓度开始低于代谢物，MBZ最高数值2(1 h;MBZ(OH在浸 mg,kg，半衰期为3(2 泡结束后12 h时还可以检测到O(05 h内能测到，MBZ―NH2在312 mg,kg，半衰期为 171 h，浸泡24 h后MBZ―NH2最大值达到3(82 h，在用药后120 mg,kg，半衰期为22 h达到最低检测线，MBZ(OH在用药12h时候，达到最高1(38 mg,kg，用药停止72 h仍可达到2(15 h内可以侧到。MBZ-NH2在停止用药72 mg,kg。肝脏中MBZ-OH 在浸泡12h达到最高3(57 h仍然能检测到。肾脏中的代谢物 mg,kg，MBZ在312 最高值低于肝脏中，肾脏和肝脏是药物残留的主要器官。Ruyck等 2003 研究了 羊单剂量口服甲苯咪唑20 m北g，提取羊的大腿肌肉，肋骨肌肉，肝脏，肾脏 和背 部脂肪用来检测。得到甲苯咪唑及其两种代谢物三者混合浓度在大腿肌肉和肋骨肌 9 华中农业大学2009届硕上学位论文 肉中最高。甲苯咪唑在肝脏，肾脏和背部脂肪组织中的浓度最高值分别为:1160， 1628，778 pg,kg，氨基甲苯咪唑在这三种组织中的最高值分别为:237，47，28pe,,kg。 7d后三种药物的总和低于MRL值，14d仍然能在肝脏中检测到羟基甲苯咪唑3 oeCkg，建议羊的休药期为1周。 7研究目的及意义 2000年起，我国的水产品出口进入了一个新的快速增长阶段，出口额首次超过 畜产品，在整个农产品中列第一位，出口增幅仅次于粮食列第二位，是1995年以来 万吨，总额160(2亿美元，同比分别增长4(9,和10(7,。当前，全球金融危机持续 蔓延，世界经济下行的趋势更加明显，水产品出口贸易面临更为严峻的挑战。受国 内外经济形势不断变化，食品质量安全事件频发，2007年美国对我4种水产品全面 采取限制进口措施，以及2008年初日本媒体炒作“毒饺子事件”等影响，我国水产品 出口贸易一度陷入困境。由于水产养殖业趋向于高密度精养以及种苗流通所带来病 原扩散，水产动物病害日益严重。为了预防及治疗鱼类寄生虫和细菌性疾病，人们 大量使用抗菌，杀虫药物。同类药物的经常反复、超量使用，导致原来使用的药物 药效降低，甚至无效，用量也不断加大，不仅直接对鱼类产生毒副作用，而且残留 时间长，对食用水产品的人类也产生潜在危害。水产品药物残留状况，以及由此带 来的贸易出口问题，已经引起我国社会各界的高度重视。我国对鱼药的研究起步较 晚，对大部分鱼药，在药动学、药效学以及毒理学等方面都缺乏研究。 本研究的目的旨在评价甲苯咪唑对水产动物的毒副作用;建立准确、快速、灵 敏度高、重现性好的可同时检测甲苯咪唑及其代谢物的高效液相色谱紫外检 测 HPLC―UV 法，从而为甲苯咪唑及其代谢物在动物性食品中的残留检测及其在动 物体内的药代动力学研究提供了可靠的分析方法;研究25?下甲苯咪哗在银鲫体内 药代动力学特征及残留消除规律率，以期获得甲苯咪唑在银鲫体内的药物动力学模 型及特征参数 达峰时间、达峰浓度、吸收半衰期、分布半衰期、消除半衰期等 ， 为水产业合理用药提供理论依据，阐明25?水温下甲苯咪唑经连续给药在银鲫组织 中的分布和消除规律，为我国水产养殖业建立HACCP系统、合理安全地使用药物、 制定休药期、控制药物残留提供理论依据。 lO 甲苯眯唑急性毒性及在异育银鲫体内药动学和残留研究 第二章甲苯眯唑对异育银鲫的急性毒性试验 auratus 异育银鲫 Carassius gibelio 体形及体色与普通鲫鱼极相似，生长速度 较鲫鱼快，个体也较大，具有食性广、易饲养、繁殖简便、生命力强、病害少、肉 味佳、营养丰富、经济价值高等优点，近几年随着养殖规模扩大，寄生虫对异育银 鲫的危害日益严重。通过研究甲苯咪唑对异育银鲫的毒性试验，为异育银鲫的规模 养殖和鱼病防治提供合理用药依据。目前，国内外有关甲苯咪唑对异育银鲫的急性 毒性试验的研究尚未见报道。 l材料与方法 1(1材料 (1(1试验鱼 1 异育银鲫体重50-土5 g，由中国水产科学研究院长江水产研究所窑湾实验场提供， 运输至实验室后，用3,食盐消毒10min，然后放置于已清洗并用高锰酸钾消毒水族 cm×80cm×80 箱 122 cm 中暂养1周，试验用水为经活性炭脱氯的自来水，采用连 续充氧，保持水中溶氧大于5(0 mg,L，水温25? 自然水温 ，暂养期间按鱼体重的 3,投喂配合饲料。每天换水1次，暂养结束后，选择无病无伤个体，规格均匀的银 鲫进行试验，试验前停饲1d。 1(1(2药品与试剂 甲苯咪唑原料药 纯度99,，武汉九州神农有限公司提供 ，二甲基亚砜 分析 纯，国药化学试剂公司 。 1(1(3药液的配制 用适量的二甲基亚砜将甲苯咪唑溶解后，用蒸馏水水稀释至终浓度1000 mg,L。 1(2试验设计 1(2(1浸泡用药 将健康无伤的异育银鲫随机分为6组5个浓度组和1个对照组，各浓度组设3 个平行，每组10尾异育银鲫。试验用池为140L的玻璃钢水族箱，用水为经活性炭 脱氯的自来水，水中溶氧大于5(0 h。 mg,L，水温25(0? 自然水温 ，每日光照12 待鱼稳定后加入不同浓度的甲苯咪唑。设置浓度为0(5、1(0、2(0、4(0和8(0 mg,L， 对照组浸泡配制最高药物浓度的二甲基亚砜水溶液。试验期间不换水，不投饵，连 h。 续充气，每日观察鱼死亡情况，及时捡出死鱼并作记录，连续观察96 华中农业大学2009届硕士学位论文 1(2(2灌胃用药 将健康无伤的异育银鲫随机分为6组5个浓度组1个对照组，各浓度组设3个 平行，每组10尾异育银鲫，试验用池为140L的玻璃钢水族箱，用水为经活性炭脱 氯的自来水，水中溶氧大于5(0 h。 m‖L，水温25(0? 自然水温 ，每日光照 12 待鱼稳定后，给鱼灌胃分别为100、200、400、800和16005个浓度梯度， 对 mga,g 照组灌胃配制最高药物浓度的二甲基亚砜水溶液。灌胃时用带有导管注射器 通过口 腔将药液送入异育银鲫体内。试验周期为96h，详细记录每天银鲫的中毒反 应及死 亡情况。 1(3数据处理 试验期间，统计24，48，72，96h的死亡数。采用直线内插法，以浓度的常用 对数为横坐标，死亡率的概率单位为纵坐标，求出概率单位与试验液质量浓度对数 的回归方程，进而求出半数致死浓度LD50。按照水生生物毒性试验方法 周永欣， 1989 计算安全浓度:安全浓度 Sc 48hLD50x0(3LC50,24h x 48h LD50 2 2结果 2(1浸泡用药对异育银鲫的毒性 率随着MBZ浓度的增加和处理时间延长而增加，见表2(1。MBZ浓度与异育银 鲫死亡率的线性回归分析见表2―2，安全浓度为O(333mg,L。 表2-1异育银鲫浸泡于不同浓度的MBZ中的平均死亡率 Table rateof immersionindifferentconcentrationsof 2-1The averagemortalityJohnnycarp MBZ 12 甲苯咪唑急性毒性及在异育银鲫体内药动学和残留研究 MBZ浓度与异育银鲫死亡率的线性回归分析 表2-2 MBZconcentrationandthe rateof linear Table2-2 carp regressionanalysis mortalityJohnny 时间 h 回归方程 相关系数 r LD50安全浓度Sc Correlationcoefficient Time Linear mg,L meCL equation 24 Y 1(76X+3(5680(9288 6(48 48 Y 2(33X十3(704 0(9823 3(60 0(333 72 Y 4(57X+2(9140(9882 1(40 1 0(9990 1(05 96 Y 4(91X+4(55 2(2灌胃用药对异育银鲫的毒性 各浓度的三个平行处理组间的毒性实验结果差异不显著 P O(05 。异育银鲫的 死亡率随着MBZ浓度的增加和处理时间延长而增加，见表2-3。MBZ浓度与异育 银鲫死亡率的线性回归分析见表2(4，安全量为68(68mg,kg。 表2-3异育银鲫口灌不同浓度的MBZ的死亡率 ofMBZ Table2-3The rateof oraldifferentconcentrations mortalityJohnnycarp average rate 浓度 mg,kg 平均死亡率 , Averagemortality Concentration24h 48h 72h 96h 对照组0 0 0 0 100 0 0 0 2(5 6 200 17(5 24(7 27(5 39( 400 24(8 30(8 52(1 83(3 800 52(O 68(6 95(0 100 1600 70(0 100 100 100 表2―4 MBZ浓度与异育银鲫死亡率的线性回归分析 linear MBZconcentrationandthe rateof regressionanalysis Table2-4 Johnnycarp mortality 安全量 Sd 时间 h 回归方程 相关系数 r LD50， coefficient Time Linear Correlation mg,kg mg,kg equation 24 Y三1(692X+o(08230(9900 806(67 48 Y I(943X(0(28930(9279 526(97 68(68 72 Y I(821X(0(03480(8682 318(76 1 244(21 96 Y 4(862X(6(608 0(9956 13 华中农业大学2009届硕士学位论文 3讨论 国内外关于甲苯咪唑对水产养殖动物的急性毒性试验的报道较少，李志青等 2000 报道了甲苯咪唑对欧洲鳗的毒性随水温不同而不同。水温为26?，28?时 处理24h试验组鱼体无死亡，而水温为30?时，浓度为4(8，9(6 h均 mg,L组处Y-里24 出现大量死亡，浓度为0(6 h组亦出现大量死亡;而26?，28?条 mg,L，处理72 件下鱼体基本无死亡，甲苯咪唑对欧洲鳗毒性随水温升高而增强。李海燕等 2005 报道了甲苯咪唑浓度为0(4 mg,L和0(8mg,L时，日本鳗、欧洲鳗，翘嘴鳜，红剑和建 鲤是安全的;浓度为2mg,L时，前3种试验鱼全部存活，而红剑和建鲤的死亡率为6, 和4,。甲苯咪唑的浓度达到2 mg,L时，翘嘴鳜、日本鳗和欧洲鳗尽管没有 出现死鱼 现象，但已表现不适应的症状，而红剑尾鱼和建鲤己开始出现少量的死鱼，存活的 鱼也表现出不适，这说明2mg,L的甲苯咪唑对鱼类产生毒害作用。由试验结果看出， 甲苯咪唑对银鲫的毒性随药浴时间延长、浓度升高而加强。中毒鱼体表粘液脱落， 体色变浅，躯体颤抖，头仰摇后下沉。死亡鱼胆囊肿大，肝脏色加深。在养殖生产 中除注意使用浓