柱层析方法
硅胶柱层析的方法
1( 称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量;如果极难分，也可以用100倍量的硅胶
H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。
2。搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙
酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌;如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能
搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色
谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如
果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。
3。装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚(氯仿)，装上蓄
液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球
内，用石油醚(氯仿)将其冲入柱中。
4。压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱
床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高
很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。
5。上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱
脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。
6。过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，
推荐用梯度洗脱。收集的例子:10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分;1-2g上样量，
50g硅胶(200-300目)，20-50ml收一馏分。
7。
检测
工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训
。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏
度一般比喷显剂底1-2个数量级。
8。送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过
一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。 关于柱层析的实验方法和技巧
(注意:有机溶剂对身体特有害别是心肺;肝脏等所有过柱操作都要在通风橱里进行～～——gemmy edited)
常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。
1、柱子可以分为:加压，常压，减压
压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发(有时在柱子外面有水汽凝结)，以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气(很大的噪音，而且时间长)。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵(给鱼缸供气的就行)。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。
2、关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好
柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小(反映在柱子上就是样品层比较薄)，这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了(有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费)。现在见到的柱子径高比一般在1:5,10，书中写硅胶量是样品量的30,40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分rf在0.2,0.4，杂质相差0.1以上)，就可以少用硅胶，用小柱子(例如200毫克的样品，用2cm?20cm的柱子);如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。
3、关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品
可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问
题
快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题
，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱，需要六个schlenk，现在只一个就能把所要的全收集到。无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容易是样品分解，特别是金属有机化
合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但是比硅胶要贵些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过。哪位做过可以提出来大家参详参详。 4、关于湿法、干法上样
湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了。很多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。可是有的上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固体才会发生，这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱(比如DMF,DMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾)，这时就必须用干法上柱了。样品和硅胶的量有一种说法是1:1，我觉得是越少越好，但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒(那说明有的样品没有吸附在硅胶上)。溶剂的选择。当然是最便宜，最安全，最环保的了。所以大多选用石油醚，乙酸乙酯。文献中有写用正己烷的，太贵了，除非特别需要不要用不然银子哗哗的，流的比淋洗剂还快，不过因为极性很小，有时还是非它不可。乙醚也可以用，但是就是容易睡觉，注意保持清醒别让溶剂流干了，那样柱子也就不爽了。二氯甲烷也有用的，但是要知道，它和硅胶的吸附是一个放热过程，所以夏天的时候经常会在柱子里产生气泡，天气冷的时候会好一些。甲醇，据说能溶解部分的硅胶，所以产品如果想过元素分析的话要留神，应该经过后继处理，比如说重结晶等。其他的溶剂用的相对较少，要依个人的不同需要选择了。由于某些原因，用到的淋洗剂多是大包装的(便宜嘛)，我们这里是用10升或25升的塑料桶装的，就要注意这些工业品的纯度是较低的。经常能够从送来的大桶底部看见有色的杂质，其他的杂质就可想而知了，所以在比较严格的柱分时就要对溶剂重蒸。当然过原料时就可以免去这一步了，反正下面还有提纯的方法。另外溶剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另一方面也能节省部分经费，缺点是要消耗一定的人工。这里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，石油醚和乙酸乙酯的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适，正好极性越来越大了。在过完柱子后，溶剂最后回收要采用常压，因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一起出来，常压时就会减少这种现象，如果杂质和你下面要过的样品有反应那就惨了。
5、关于操作问题。
5.1 装柱。
柱子下面的活塞一定不要涂润滑剂，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟节门的。干法和湿法装柱觉得没什么区别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧密(太密了淋洗剂走的太慢)，一定要均匀(不然样品就会从一侧斜着下来)。书中写的都是不能见到气泡，我觉得在大多数情况下有些小气泡没太大的影响，一加压气泡就全下来了。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了。但是柱子更忌讳的是开裂，甭管竖的还是横的，都会影响分离效果，甚至作废～
5.2 加样。
用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂面时，再加少量的低极性溶剂，然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有一段距离(2,4cm就够了)，再加压，这样避免了溶剂(如二氯甲烷等)夹带样品快速下行。
5.3 淋洗剂的选择。
感觉上要使所需点在rf0.2,0.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开，过柱子就用那种极性，如果rf在0.6，即使相差0.2也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的状态，可以通过公式的比较:0.6/0.8一次的分离度，肯定不如(0.2/0.3)的三次方或四次方大。
5.4 样品的收集。
用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。
另外，收集的试管大小要以样品量而定，特别是小量样品，如果用大试管，可能一根就收到了三个样品，wuwu。如果都用小试管那工作量又太大。
5.5 最后的处理。
柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送分析，最好用少量的溶剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的，一洗基本就没了，必要时进行重结晶。
另外，再过柱的时候，有时会出现气泡，一是和使用的溶剂有关，如果是易挥发的溶剂，如乙醚、二氯甲烷等，在室温稍高的情况下，很容易出现这种现象，因此，在室温高的时候，可以选择沸点较高，挥发相对小的溶剂。还有，使用混合溶剂时，使用的两种溶剂的沸点应该相差不大，如:乙酸乙酯和石油醚(60~90),而乙醚却要选择30,60的石油醚。二是:不
论是用带砂板的还是塞棉花的，在装柱之前，都要将空气用加压的方法将空气排干，这样就可避免柱中有空气～过柱子需要耐心，不要着急。
《天然药物化学实验讲义》
实验须知
实验一 薄层板的制备、活度测定及应用
实验二 粉防已生物碱的提取、分离与鉴定
实验三 掌握掌叶防已碱的提取及硫酸延胡索乙素的制备
实验四 虎杖中游离羟基蒽醌成分的提取和分离
实验五 芦丁的提取、分离与鉴定
实验六 秦皮中七叶苷、七叶内酯的提取、分离和鉴定
实验七 薯蓣皂苷元的提取和鉴别
实验八 中草药成分鉴别法
附录一 常用试剂及配制方法
附录二 常用有机溶媒的性质及回收方法
实验须知
天然药物化学实验教学是天然药物化学课程的重要组成部分，是使学生进一步理论联系实际，掌握天然药物有效成分提取、分离和检定的基本操作技能，提高学生分析和解决问题能力。养成严密科学态度和良好工作作风必不可少的教学环节。为此，提出下列实验须知:
1(遵守实验室制度，维护实验室安全，不违章操作，严防爆炸、着火、中毒、触电、漏水等事故的发生。若发生事故应立即报告指导教师。
2(实验前作好预习，明确实验内容，了解实验的基本原理和方法，安排好当天
计划
项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载
，争取准时结束。实验过程应养成及时记录的习惯。凡是观察到的现象和结果及有关的重量、体积、温度或其他数据，应立即如实记录，实验完毕后，认真总结，写好报告，提取纯化所得单体产物包好，贴上标签(日期、样品名称、纯度、mp、bp、TLC、重量)交给老师。
3(实验室中保持安静，不许大声喧嚷，不许抽烟、不迟到、不随便离开，实验台面应保持清洁，使用过的仪器及时清洗干净，存放在实验柜内，废弃的固体和滤纸等丢入废物缸内，绝不能丢入水槽、下水道和窗外，以免堵塞和影响环境卫生。
4(公用仪器及药品用完后立即返还原处，破损仪器应填写破损报告单，注明原因。节约用水、用电、药用试剂。严格药品用量。
5(保持实验室内整洁，学生采取轮流值日，每次实验完毕，负责整理公用仪器，将实验台、地面打扫干净，倒清废物缸，检查水、电和门窗是否关闭。
实验一 薄层板的制备、活度测定及应用
一、目的要求
1(掌握薄层板的制备及薄层层析的操作方法
2(掌握吸附剂活度测定的原理及方法
3(应用薄层层析法检测识中草药化学成分
二、薄层板的制备
1(不加粘合剂的薄层涂布法
(1)氧化铝薄层
将吸附剂置于薄层涂布器中，调节涂布器的高度，向前推动，即得均匀薄层。本实验主要用下述简易操作涂布薄层，取表面光滑，直径统一的玻璃一支，依据所制备薄层的宽度、厚度要求，在玻璃棒两端套上厚度为0.3~1mm的塑料圈或金属环，并在玻璃棒一端一定距离处套上较厚的塑料圈或金属环，以使玻璃棒向前推动时能保持平行方向，操作时，将氧化铝粉均均地铺在玻璃板上，匀速向前推动。
(2)纤维素薄层
一般取纤维素粉1份加水约5份，在烧杯中混合均匀后，倒在玻璃板上，轻轻振动，使涂布均匀，水平放置，待水分蒸发至近干，于100?2?干燥30~60分钟即得。
(3)聚酰胺薄层
取锦纶丝(无色干净废丝即可)用乙醇加热浸泡2~3次，除去腊质等。称取洗净的锦纶丝1克，加85%甲酸ml，在水浴上加热使溶，再加70%乙醇6ml。继续加热使完全溶解成透明胶状溶液。将此溶液适量倒在水平放置的，用清洁液洗净的玻璃片上，并自然向周围推匀，厚度约0.3mm，薄层太厚时，干后会裂开。将铺好的薄层水平放在盛温水的盘上，使盘中的水蒸汽能熏湿薄层，盘子加玻璃板盖严密，薄板放置约1小时完全固化变不透明白色，再放数小时后，泡在流水中洗去甲酸，先在空气中晾干，后在烘箱中0?恒温加热活化15分钟，冷后置干燥器中贮存备用。
2(加粘合剂薄层的涂布法
(1)硅胶G薄层 取硅胶G或硅胶GF一份，置烧杯中加水约5份混合均匀，放置片刻，随即用药匙取一定量，分别倒在一定大小的玻璃片上(或倒入涂布器中，推动涂布)，均匀涂布成0.25~0.5mm厚度，轻轻振动玻璃板，使薄层面平整均匀，在水平位置放置，待薄层发白近干，于烘箱中100?活化0.5~1小时，冷后贮于干燥器内备用。活化温度和时间可依需要调整，一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时，所用薄层板只在空气中自然干
燥，不经活化即可贮存备用。
(2)硅胶(H)羧甲基纤维钠(CMC-Na)薄层 取羧甲基纤维素0.2g，溶于25ml水中，在水浴上加热搅拌使完全溶解，倒入烧杯中，加薄层层析用硅胶(颗粒度10~40μm的约6~8g)。激光照排系统混成均匀的稀糊，按照硅胶G薄层涂布法制备薄层，或取0.8%羧甲基纤维纳10ml，倒入广口瓶(高约10~12cm)中，然后逐步加入薄层层析用硅胶3.3克，不断振摇成均匀的稀糊，把两块载玻片面对面结合在一起，这样每片只有一面与硅胶糊接触，使薄片浸入硅胶稀糊中，然后慢慢取出，分开二块薄片，将未粘附硅胶糊的那一面水平放在一张清洁的纸上，让其自然阴干，100?下烘30分钟。冷后于干燥器内备用。未消耗的硅胶稀糊可贮存在广口瓶内，以供再用。
氧化铝薄层，氧化铝羧甲基纤维钠薄层的制备方法同上，一般所需要氧化铝比硅胶稍多。
目前国内外市场有预先制好的薄层板，底板用玻璃、塑料、铝片等。可按需要用玻璃刀划割，也有用剪刀剪成所要的大小，使用方便，价格贵些。
3(特殊薄层的制备
根据分离工作的特殊需要，可制成以下几种特制薄层。
(1)酸、碱薄层和pH缓冲薄层
为了改变吸附剂的酸碱性，以改进分离效果，可在吸附剂中加入稀酸溶液(如0.1~0.5N草酸溶液)代替水制成酸性氧化铅薄层使用，硅胶微呈酸性，可在铺层时用稀碱溶液(如0.1~0.5N氢氧化钠溶液)代替水制成碱性的硅胶薄层。当用醋酸钠、磷酸盐等不同pH的缓冲液代替水铺层，制成一定pH缓冲的薄层。
羧甲基纤维素钠的溶液一般用0.5~1%浓度，宜预先配制后静置，取其上层澄清溶液应用，则所制备的薄层表面较为细腻平滑。常用0.8%浓度。CMC-Na系中粘度。300~500厘泊(粘度单位)。CMC-Na系碳水化合物，调制时应在水浴上进行。活化温度不应过高，防止碳化。
(2)络合薄层
硝酸银薄层的制法，可在吸附剂中加入5~25%硝酸银水溶液代替水制成均匀糊状，再按常法铺成薄层，制成薄层避光阴干，于105?活化半小时后避光贮存，制成的薄层以不变成灰色为好，在三天内应用。也可先把硝酸银用少量水溶解，再用甲醇稀释成10%溶液，把预先制好的硅胶G薄层浸入此溶液中约1分钟，取出避光阴干，按上法活化，贮存。
三、吸附剂的活度测定
1(氧化铝活度的测定
一般可用4~5种偶氮染料以薄层层析法进行测定。
染料试剂的配制:取偶氮苯(Azobenzene)50mg，对甲氧基偶氮苯
(P-Methoxyuzobenzene),苏丹黄(Sudan I, Benzeneazo-β-naphthol)，苏丹红(Sudan ?
Tetrazobenzol-β-naphthol)，对氨基偶氮苯(P-Aminoazobenzene)各20mg，分别溶于50ml重蒸馏的四氯化碳(经氢氧化钠干燥)中。
常法制备不含粘合剂氧化铝薄层，以铅笔尖或毛细管尖在薄层板一端2~3 cm处间隔1cm左右轻轻点上5个可以看清的小点，各吸取约0.02ml染料试剂分别点滴于原点上，以四氯化碳为展开剂，展开时薄层板与容器底部交角为10~40?之间，展开后测出各斑点的Rf值，
?级活度使用本法时，结果往往偏低)。 从表1确定氧化铝的活度(一般高活性氧化铝?~
另取不含粘合剂氧化铝薄层板一块，置于水蒸汽饱和容器内，2~3小时后取出，按上述方法测定活度。观察有无变化。
表1 氧化铝活度与偶氮染料外值关系
氧化铝活度级Rf值
偶氮染料
二级 三级 四级 五级 偶氮苯 0.59 0.72 0.85 0.95 对甲氧基偶氮
0.16 0.45 0.69 0.89 苯
苏丹黄 0.02 0.25 0.87 0.98 苏丹红 0.00 0.10 0.35 0.50 对氨基偶氮苯 0.00 0.05 0.08 0.19
2(硅胶活度的测定
一般选用三种染料的薄层层析法进行测定。
欧洲药典1969年记载用0.01%二甲基黄(Dimethy-yellow. P-Dimethylaminoazobenzene)。苏丹红(Sudan ?)，靛酚蓝(Indophenol blue 4-Tapnthoquinone-4-dimethyl aminoaniline)的苯溶液各10μl点滴于硅胶G或硅胶H薄层上，以苯为展开剂，展开10cm(约20分钟)，三种染料应明显分离，靛酚蓝斑点接近于起始线。二甲基黄斑点在薄层的当中。苏丹红斑点与二甲基黄斑点之间，则认为薄层板活性符合要求。
国内青岛海洋化工厂出售薄层层析用的硅胶在吸附剂名称之后加几个字标明的意思是:硅胶G(G是Gypsum石膏的缩写。表示加了石膏)，硅胶H(H表示不加石膏)，硅胶GF254(F254表示加石膏和波长254显绿色荧光的硅酸锌锰)。硅胶GF365(表示加石膏和波长365nm显黄色荧光的硫化锌镉)。氧化铝则类推。
四、薄层层析的应用
薄层层析法在天然药物化学成分的研究中，主要应用于化学成分的预试、化学成分的鉴定及探索柱层分离的条件。用薄层层析进行中草药化学成分检识，可依据各类成分性质及熟
知的条件有针对性地进行。由于在薄层上展开后，可将一些杂质分离，选择性高，可使预试结果更为可靠，不仅可通过显色获知成分类型，而且可初步了解主要成分的数目及其极性大小。
例一:湖北贝母生物碱成分的TLC检识
吸附剂:硅胶CMC- Na薄层
样品:湖北贝母总生物碱氯仿溶液
展开剂:CH-EtoAc-NHEt(6:4:1) 652
显色剂:改良碘化铋钾喷雾
例二:丹参色素的TLC检识
吸附剂:硅胶G-CMc-Na板
样品:丹参乙醚提取液
展开剂:石油醚-醋酸乙酯(9:1)
记录TLC结果
实验二 粉防己生物碱的提取分离与鉴定
汉防己为防己科千金藤属物Stephania tetrandra S. Mcore的根，是祛风解热镇痛药物，其有效成分为生物碱。主要是汉防己甲素和汉防已乙素。临床上除用作治疗高血压、神经性疼痛、抗阿米巴原虫外，还将粉防已生物碱的碘甲基、或溴甲基化合物作为肌肉松弛剂应用，此外汉防已甲素在动物实验中有抗癌和扩张血管的作用。
一、目的要求
通过汉防己中几种生物碱的提取分离和鉴定，要求掌握下列知识和技能。
1( 生物碱的一般提取方法。
( 用低压柱层析分离，纯化单体的方法及薄层层析鉴定 2
二、已知生物碱的结构和性质
汉防已根中总生物碱含量为1.5~2.3%，主要为汉防已甲素，含量约1%，汉防已乙素，含量约0.5%;轮环藤酚碱，含量为0.2%;以及其它数种微量生物碱。
1(汉防已甲素(Tetrandrine，汉防已碱，粉防已碱)
无色针晶，不溶于水和石油醚，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和氯仿等有机溶剂及稀酸水中，可溶于苯，mp 216?，有双熔点现象，自丙酮中结晶者，150?左右熔后加热又固化，至213?复熔。
OCH3CHO3
NNCHCH3OR3OHH
O
OCH3
R=CH3 汉防己甲素
汉防己乙素R=H
2(汉防已乙素(Fangchinoline, 又称防已诺林碱，去甲粉防已碱)
溶解行为与汉防已甲素相似，因有一个酚羟基，故极性较汉防已甲素稍高，在苯中的溶解度小于汉防已甲素而在乙醇中又大于汉防已甲素。籍此可以相互分离，用不同溶剂重结
昌时，其晶形和溶点不同:
乙醇 细棒状结晶 mp 245~40?
甲醇 细棒状结晶 mp177~9?
丙酮 六面粒状晶 mp134?
吡啶-甲醇 mp 121~2?
环已烷-EtocAc mp 156?
3(轮环藤酚碱(Cylanoline)
为水溶性季铵生物碱，不溶于极性溶剂，氯化物为无色，八面体状结昌，mp 214~6?，
碘化物为无色绢丝状结晶，mp185?;苦味酸盐为黄色结晶，mp154~6?。 CHO3
OHNCHHO3
OH
OCH3
三、生物碱的提取分离
1(总生物碱的提取和亲脂性与亲水性生物碱的分离
汉防己药材粗粉100g
SO液渗漉(注一)0.5%H24
酸水渗漉液(为原料的3~10倍量V/V)
加新鲜石灰乳调pH9~10，静置，抽滤
碱水液泥黄色沉淀
(水溶性季铵碱及水溶性杂质)
将沉淀与静砂拌匀(注二)
80?烘干，置索氏提取器中用乙醚(约180ml)提取至
提尽生物碱(注三)
回收乙醚(注四)
乙醚提取物
用95%乙醇40~60ml回流热溶后
倾入500ml水中，加30gNaCl盐析
水溶上加热至凝结，静置
抽滤
白色沉淀(亲脂性叔铵总碱，以汉防己甲素、乙素为主)
注一:将汉防已粗粉加适量酸水液，以能将生药粉末润湿为度(约150ml)，充分拌匀，放置半小时，均匀而致密地装入渗筒内，用锥形瓶底部或其它平底工具压紧，供渗漉用，流速约1.5ml/分。
注二:净砂必须事前洗净烘干，拌和量最好不要超过120g，以免索氏提取器一次装不下或装得过多。提不尽生物碱。
注三:检查生物碱是否提尽的方法，是取最后一次乙醚提取液约数滴，挥去乙醚，残渣加5%HCl 0.5ml溶解后，加改良碘化铋钾试剂一滴，无沉淀折出或明显浑浊时，表明生物碱已提尽，或基本提尽。反之，应继续提取。
注四:先将提取器内滤纸筒取出。然后将提取玻筒内最后一次乙醚提取液倾出(另器贮存)，再将提取玻筒安装好，继续加热，回收烧瓶中乙醚于玻筒中，至烧瓶内的乙醚提取液体积较小时，停止回收，将烧瓶中乙醚提取液倾出。
2(低压柱层析分离汉防已甲素和乙素
22低压柱层析在低压下(0.5~3kg/cm，一般0.3~1.2 kg/cm)采用颗粒直径介于经典柱层析(100~200μm)和HPLC(~37μm)之间的薄层层析用硅胶(或氧化铝)H或G(50~75μm)作为填充剂的一种柱层析柱，其基本原理与HPLC相同，分离效果也介于经典柱与HPLC之间，用减压干法装柱，铺层紧密均匀，层析带分布集中整齐，同时薄层层析的最佳分离溶剂系统可以直接用于低压柱层析，它是一种分离效果较好，设备简单，操作方便，快速的方法。适宜和于天然产物的常量制备性分离。
(1)装柱 减压干法装法，层析柱规格:柱长30cm，内径2cm，共装硅胶约30g(高约22cm)。
(2)拌样加样 取汉防已碱约150mg，加少量丙酮热溶(刚溶为度)用滴管加到1.5g硅胶上，仔细拌匀，水浴上蒸干，碾细，通过一个长颈漏斗小心加在柱顶，轻轻垂直顿击，待样品表面平整不拌动时，上面再盖约1~2cm高的空白硅胶，再加盖一园形滤纸片，压紧。
(3)洗脱 先检查从空压机至层析柱各阀门管道是否正常，关紧各个阀门，开动空压
2机至额定压力(5.8kg/cm)待用。用滴管顺层析柱柱壁仔细加入少量洗脱剂(环已烷-惭酸乙酯-二乙胺/6:2:0.8)，当液面达到一定高度时，再一次加入其余洗脱剂(共约250ml)，迅速在柱顶上装上玻璃标口塞接头，用铁夹压紧(防加压时接头冲开)，小心开启空压机阀门，再开针形阀和空气过滤减压器，(注意:压力过大。玻璃柱会炸，一般2kg是安全的，
2必要时可戴防护面罩)调动所需压力，0.6~1.2kg/cm，约40分钟后流出，控制流速1ml/分，每10分钟左右一管，收12~15份，洗脱全过程约3小时。
(4)检查 各流份分别移入小玻璃蒸发器中，于水浴上浓缩，分别通过TLC检查，吸附剂:硅胶G，展开剂:环已烷-乙酸乙酯-二乙胺/6:3:1，改良碘化铋钾试剂喷雾显色，以汉防已甲素、乙素为
标准
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品对照，合并相同组分，分别获得甲、乙素粗品，用丙酮重结晶，测定mp。
四、鉴定方法
1(衍生物制备
取汉防已甲素0.2g，溶于2ml(丙酮中，滴加苦味酸饱和水溶液至不再折出黄色沉淀为止，抽滤收集沉淀，顺次以少量水乙醚洗涤，乙醇重结晶，得汉防已甲素苦味酸盐，mp 235~242?(dc)。
2(有机胺碱的TLC
吸附剂:青岛海洋化工厂薄层层析硅胶G，用0.3%CMC-Na水液制板，110?活化1小时。
样品:分出的汉防已甲素?、乙素?、总碱?
展开剂:环己烷- EtoAc-NHEt(6:2:1) 2
显色剂:改良碘化铋钾试剂(展开后用电吹风吹干再喷显色剂，以免二乙胺干扰)
现象:甲素显色后呈淡棕色，2小时左右就褪色，而乙素呈棕色，久置不褪色，可帮助其辨认。
实验三 掌叶防己碱的提取与分离及延胡索乙素制备
掌叶防已碱又称巴马汀(palmatine)，硫酸延胡索乙素又称消旋四氢巴马汀硫酸盐(dltetrahydro palmatine sulphate)。
延胡索乙素(Corydalis B)为镇静安定药，用于缓解胃系统的疾病所引起的疼痛，临
产阵痛、头痛、失眠等。
中药延胡索(元胡，Corydalis yanhusuo W.T. Wang的块根)中含延胡索乙素的量很少，而其脱氢化合物巴马汀在某些植物中含量却很高。在中国华南一带的防已科植物黄藤(Fibreursa recisa paerre)的根茎中含巴马汀，再经氢化反应，制备延胡索乙素。
黄藤曾列入《本草纲目》，李时珍谓“藤生生岭南，状若防已，但人常服此藤，纵饮食有毒，亦自然不发”。现代民间作为清热消炎药。常用于外伤感染、扁桃体炎、咽喉炎、结膜炎、热痢及黄疸等。
一、实验的目的要求:
1(掌握季铵生物碱的一种提取方法。
2(掌握生物碱的一般理化性质及其结构与性质的关系。
3(了解黄藤生物碱的结构与性质的关系。
4(熟悉生物碱沉淀反应的条件和方法。
5(掌握制备生物碱结晶性盐的方法和精制。
6(掌握四氢巴马汀的制备方法。
二、黄藤中已知成分的理化性质:
黄藤根茎及根中所含成分主为巴马汀。尚含少量药根碱、黄藤素甲、黄藤素乙、内脂及甾醇。又谓在根茎、根及树皮中含小檗碱。
1( 掌叶防已碱(巴马汀，Palmatine)
CHO3
OHN2OCH31
3OCH
OCH3
本品系季铵生物碱，溶于水、乙醇，几乎不溶于氯仿、乙醚、苯等溶剂，掌叶防已碱盐酸盐即氯化巴马汀(palmation Chloride)CHON ?Cl?3HO为黄色针状结晶，熔点205?212242
(分解)。其理化性质与盐酸小檗碱类似。巴马汀氢碘酸盐(palmatine icdide)CHON?I?2HO为橙黄色针状结晶，熔点241?(分解)。 212242
2(药根碱(雅托碱?Jatrorrhizine)
本品系具酚羟基季铵盐，其理化性质与巴马汀类似，但较易溶于苛性碱液中，其盐酸在水中的溶解度亦比盐酸巴马汀为大，可籍此性质予以分离。药根碱盐酸盐(Jatrorrhizine Chloride)CHON?Cl?HO为铜色针状结晶，溶点204~206?，其苦味酸盐(Jatrorrizine 202042
picrate)CHO4N?CHON为橙黄色柱状结晶，溶点217~220?(分解)。 20206272
HO
OHN1CHO33OCH
OCH3
3(小檗碱(黄连素Berberine)
1
2本品系季铵生物碱，其游离碱为黄色长针状结晶，CHON?OH?5HO，溶点145?，201842在100?干燥，失去结晶水转为棕黄色。小檗碱能缓缓溶于水(1:20)，乙醇(1:100)，较易溶于热水、热乙醇、微溶于丙酮、氯仿、苯、几乎不溶于石油醚中，小檗碱与氯仿、丙酮、苯均能形成加成物。小檗碱盐酸盐(Berberine Chloride)CHON?ClHO，熔点205?2016422(分解)，微溶于冷水，较易溶于沸水，其硝酸盐及氢碘酸盐，极难溶于水(冷水约1:2000)。小檗碱的中性硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐在水中溶解度较大，小檗碱的盐类在水中的溶解度:
o
OHNo
3OCH
OCH3
盐酸小檗碱 1:500
硫酸小檗碱 1:30(酸性盐1:100)
枸橼酸小檗碱 1:125
磷酸小檗碱 1:15
4(四氢巴马汀(Tetrahydropalmatine):
延胡索乙素为消旋四氢巴马汀，系叔胺碱，其游离碱CHON溶点146~148?，不溶于21254
水，能溶于热乙醇(在冷乙醇中溶解度较小)，易溶于氯仿、苯、乙醚中，延胡索乙素的酸性硫酸盐为无色针状结晶，溶点245~246?，在冷水中溶解度较小，在热水中较大，其中性硫酸盐为长柱状结晶，熔点220?，在水中溶解度较酸性硫酸盐为大，其盐酸盐难溶于水。
CHO3
NCHO33OCH
OCH3
16左旋四氢巴马汀即颅痛定(Rotundine)熔点141~142?[α]D-257.5?(C=1.1氯仿)。本品在华千金藤(Stephania sinica Diels)及圆叶千金藤(S. rotundalour)的块根(山乌龟)中含量较多。
5(黄藤素甲
本品为制备氯化巴马汀的乙醇母液中的少量成分，为季铵碱盐的盐酸盐
15DCHON?HCl?HO熔点196~198?。[α]+273.3?(C=1，乙醇)，其还原物为白色针状结262972
15D晶，熔点134~186?[α]+146.6?(C=1，酸)。
6(黄藤素乙
本品系粗制巴马汀氢化、碱化分去四氯巴马汀后;母液中的微量物质，溶于氯仿。以
15D氯仿一乙醇重结晶得黄色结晶，熔点192~193?，[α]+233.3?(C=1，氯仿)。 7(黄藤内酯
本品得自粗氯化巴马汀重结晶进的不溶于水物质中，反复以酒精、丙酮重结晶，得光
15D亮棱状结晶，CHO，熔点273?，[α]+36.60 ?(C=1，乙醇)。 27239
8(黄藤甾醇
本品得制备氯化巴马汀的乙醇母液中，分出的少量油层经10%KOH皂化得到的白色针晶，
15D熔点136~137?，[α]+24.51 ?(C=1，氯仿)。
三、巴马汀提取及延胡索素制备的方法
巴马汀为季铵生物碱，溶于水和极性大的有机溶剂(如甲醇、乙醇等)所以可用甲醇、
乙醇或水进行提取。然后通过盐析，降低其在水中的溶解度而沉淀，与其它杂质分离。巴马
汀是有机碱，尽管它带正电荷，但和水的亲和力仍小于NaCl，NaCl和水的强亲和力，降低
了巴马汀在水中的溶解度，使它被“挤”出。
巴马汀盐酸在冷水中溶解度小(比盐酸小檗碱略大)可以利用此性质进行分离。 方法:(一)
1.流程
(精制)(中和，盐析)(浸出)
浸出液黄藤粗粉巴马汀 1%HAc NaOH NaCl80%乙醇热溶后加盐酸
2.
33OCHOCH
OCHOCH33
氢化HCL.100Zn.HSO24HHSO4NNCHO3CHO33OCH3OCH
四氢巴马汀酸性硫酸盐氯化巴马汀33OCHOCH
OCH33OCH
成盐游离
NHOH4HSO241/2 HSON24NCHOCHO3333OCHOCH
四氢巴马汀延胡索乙素中性硫酸盐
2(工艺
(1)浸出:取黄藤粗粉100g，用1%醋酸冷浸(以浸没原料为度，约500ml)1~2天，尼龙布过滤，药渣再加15醋酸冷浸一天，合并滤液(留取1ml作生物碱定性反应)。
(2)盐析、中和:滤液用40%NaOH液调节至pH9同时加入7%精制食盐，即有黄色不溶物析出，80?保温，使沉淀凝聚，静置，倾出上层清液，用菊形滤纸过滤，得巴马汀游离碱粗品，烘干。
(3)精制:将粗巴马汀，加80%乙醇100ml，加热回流使溶，约十分钟，乘热抽滤，残渣再加少量乙醇同法处理一次，抽滤最后用滴管取乙醇淋洗布氏漏斗上不溶物，合并滤液并向滤液中滴加6N盐酸至PH2放置，即有金黄色针状结晶析出，抽滤，再用乙醇重结晶一次，方法，将氯化巴马汀粗晶置三角烧瓶内，用滴管加入95%乙醇使结晶恰溶解(在水浴上加热)，抽滤得澄清液，加塞放置析晶。若滤液在抽滤时已析出结晶，可将它在水溶上加热结晶全溶再加瓶塞放置，这样析出的晶形好。若滤液体积太大，可溶缩至瓶壁边沿略显固体时加塞析晶。母液适当浓缩，又可析出一部分氯化巴马汀。
(4)还原:取氯化巴马汀精制品1g。置50~100ml园底烧瓶中加蒸馏水10ml，浓硫酸0.5ml，锌粉0.7g(工业生产应分批加入锌粉)，直火加热保持沸腾，反应4~5小时(反应过程加溶液颜色逐渐变淡直至无色)，反应完毕，趁热倾出上层清液，再用蒸馏水少许(1~2ml)稍加热洗涤反应瓶及锌渣1~2次，合并溶液放冷即有延胡索乙素酸性硫酸盐析出。抽滤，取结晶置25ml锥形瓶中，用70%乙醇10ml加热溶解。趁热抽滤，再用少量乙醇(1~2ml)洗涤容器，向热溶液(约60?)中滴加氨水至PH9，立即析出鳞片状结晶，抽滤，用蒸馏水洗(此处所得结晶加水能否溶解,加氯仿能否溶解,)干燥得延胡素乙素游离碱。烘干。
(5)成盐:称取延胡索乙素游离碱0.5克。置于25毫升锥形瓶(或小烧瓶)中加90%乙醇4毫升，在水浴上加热使溶解，用粗毛细管滴加5%硫酸乙醇液至刚果红试纸呈淡蓝色
(PH约5)放冷析晶。将微黄柱状结晶，抽滤干50?以下干燥，即延胡索乙素中性硫酸盐。可用水重结晶一次，干燥后测熔点。溶点 ?，得率 。
以醋酸水小样提取，一般得率1~2%，用乙醇回流浸取得率3~4%，取黄藤粗粉100g，用95%乙醇回流浸取三、四次合并乙醇至约120ml，即可按(3)精制项下操作，加盐酸得氯化巴马汀。
3(提取工艺说明
(1)黄藤中含有多糖类物质溶于水，往往影响水浸液盐析及中和后的过滤，故宜在静置后先倾泻去大部分澄清液再用布袋过滤收集沉淀，原料药材亦不宜粉碎太细。
(2)氯化巴马汀为金色针状结晶，并有强烈的黄色萤光。四氯巴马汀为先无色片状结晶，不具萤光。因此，反应液的颜色可作为还原终点的判断。还原开始时，反应液为橙黄色，随着还原反应的进行，反应液的色逐渐退去，至淡米色或无色即可作为反应的终点。
(3)四氢巴马汀较易氧化成巴马汀，所以制备过程中应尽快连续操作。
(4)四氢巴马汀的盐酸盐及酸性硫酸盐在水中的溶解度较小，故一般制成水溶性较大的中性硫酸盐，供配制注射剂使用。
方法二
1( 流程
分离(提取)
乙醇液巴马汀粗晶黄藤粗粉
95%EtOH回流 浓缩，析晶O溶H2
不溶物(主含黄藤内酯)黄藤内酯粗晶
丙酮结晶
(成盐，盐析)(重结晶)
精制氯化巴马汀氯化巴马汀水液
加NaCl放置，抽滤加HCl至PH270%EtOH热溶放置析晶，抽滤
(重结晶)(氢化)
延胡索乙素精品延胡索乙素粗晶-溶于50%MeOH加固体KBHHOEtOH42
2(工艺
(1)提取:黄藤粗粉20g，用95%EtOH回流提取2次，每次1小时，乙醇用量为100ml，合并二次醇提取液，浓缩至3~4ml，用吸管转移到5ml小锥形瓶中，放置，析晶，抽滤得巴马汀粗晶。
(2)分离:将巴马汀粗晶用10ml水溶解后，抽滤。不溶物主要为黄藤内酯。滤液滴加 HCl至PH，再加10%NaCl进行盐析放置，析出黄色不溶物，抽滤得氯化巴马汀粗晶。 2
(3)精制:用70%EtOH热溶氯化巴马汀粗晶，过滤，滤液析晶，抽滤，得精制氯化巴马汀。干燥称重 克，测溶点 ?。
(4)氢化:精制氯化巴马汀用50%甲醇溶液，加入因体KBH约0.2g，直到甲醇液迅速2
由黄变白或微黄色。滴加HCl至PH并加热使多余的KBH分解，再趁热滴加NHOH使反应液244呈碱性，立即析出鳞片状四氢巴马汀粗晶，抽滤得结晶，红外线灯下干燥，再用EtOH-HO2重结晶，得精制四氢巴马汀。干燥称重 克，薄层层析检查纯度。熔点 ?。
3(巴马汀原位还原反应
在硅胶CMC- Na薄层板的起始线上点自制的巴马汀乙醇液，及对照品巴马汀乙醇液及四氢巴马汀乙醇液。然后再在自制的巴马汀的原点加点2%KBH甲醇液2~3次，吹干，氨缸4
中饱和后，以CHClOH(3:1)展开，改良碘化铋钾试液显色。巴马汀Rf值0.4左右，四氢巴2
马汀Rf值约0.9，进行原位反应的巴马汀如氢化彻底，应和对照品氢巴马汀的Rf值一致，如反应不彻底则出现二个斑点，其Rf值分别与对照品巴马汀及四氢巴马汀一致。
四、黄藤中生成碱的检识:
1(生物碱沉淀反应
取黄藤的15醋酸浸出液每份1ml，置小试管中，分别滴加下列各试剂2~3滴，观察并记录有无沉淀产生及颜色变化。
(1)碘化铋钾试剂
(2)硅钨酸试剂
(3)苦味酸试剂(样品液需调至中性)
(4)鞣酸试剂
2(薄层层析
硅胶-CMC- Na薄层
样品 巴马汀，小檗碱，药根碱，延胡索乙素，制备巴马汀后的母液，盐析后的水母液展开剂氯仿-甲醇(3:1)，展开前薄层板先在氨缸中饱和5分钟。
显色 先在紫外灯下观察萤光下观察萤光，然后再喷以改良碘经铋钾试液显色如果用中性或碱性氧化铝薄层，展开剂可用氯仿。
记录:薄层层析图谱。说明各母液中还有什么化合物。
五、主要提取成分的理化性质:
1(氯化巴马汀:
Mp 209~20?(分解)
MeOHUV λ nm:224,265-273,337-347,430 max
MeOHλ nm:249，302，377 min
KBrIR V
-1cm:2940,1600,1510,1450,1362,1329,1270,1230,1215,1190,1135,max
1105,1062, 1017, 905, 902,882,869,807
3NMR (CFCOOH): 3.97(3H,S,OCH); 4.03(3H,S,OCH); 4.09(3H,S,OCH);3333
4.23(3H,S,OCH); 3.26(2H,t,C-H); 4.39(2H,t,C-H); 356
6.96(1H,S,Ar-H);7.54(1H,S,Ar-H); 7.94(2H,S,Ar-H);
8.44(1H,S,C-H); 9.51(1H,S,C-H) 133
2(消旋四氢巴马汀:
mp 149?
MeOHUV λ(10ge):232(3.835) max
KBr-1 IR Vcm 2935，2915，2320，2780，2715，1605，1505，1487，1448，1420，1335， max
1352，1300，1266，1248，1220，1204，1135，1100，1075，1020，
950，352，890，700
2NMR(CDCl): 3.32(12H,S,4?OCH);3.54,4.22(2H,ABq,J=16Hz C-H);333
6.58(1H,S,Ar-H),
6.70(1H,S,Ar-H);6.75,6.94(2H,ABq,J=8Hz,Ar-H)
3(巴马汀:
MS m/e 353(M+1)，337，332，307
实验四 虎杖中游离羟基蒽醌成分的提取和分离
虎杖为蓼科植物虎杖(Polygonumcus pidatum siedet Zucc)的根及根茎。别名阴阳莲，花斑竹。味苦、性微寒。能清热解毒、祛风利湿、利尿通淋、祛痰、止咳、通经等。主要用于湿热黄疸、风湿痹痛、淋浊带下、经闭、烫伤。
虎杖中含有较多的羟基蒽醌类成分及二苯乙烯类成分。其中主要有大黄素、大黄、大黄素-6-甲醚、大黄素3-D-葡萄糖苷及β-谷甾醇、鞣质等。虎杖得主要药理作用有抗菌、抗病毒及镇咳平喘、常用来治疗急性炎症、烧烫伤、肝炎、气管炎等。
一、虎杖中主要成分的结构与性质
1(大黄素(Emodin):橙黄色长针晶(丙酮中结晶为橙色，甲醇中结晶为黄色)，mp256-257?。几不溶于水，对于下列溶剂的溶介度分别为:四氯化碳0.01%，氯仿0.0718%，二硫化碳0.009%，乙醚0.14%，苯0.0415。易溶于乙醇，可溶于氨水，碳酸钠和氢氧化钠水溶液。
OHOOH
CH3HO
O
2(大黄酚(Chrysophanol):金黄色六角型片状结晶(丙酮中结晶)或针状结晶(乙醇中结晶)。mp 196?，能升华。易溶于乙醚、氯仿、苯、冰乙酸、乙醇, 稍溶于甲醇，难溶于石油醚，不溶于水、碳酸氢钠和碳酸钠水溶液。可溶氢氧化钠水溶液及热碳酸钠水溶液。 OHOHO
CH3
O
3(大黄素6-甲醚，(Emodinmonomethl ether):金黄色针晶，mp207?，能升华。可溶于氢氧化钠水溶液，溶解度与大黄酚相似。
OOHOH
OCHCH33
O
4(大黄素6-甲醚6-D-葡萄糖苷(Anthraglycosibe A):黄色针晶(稀甲醇中结晶)mp230-232?。
gluOOOH
CH3CHO3O
5(大黄素3-D-葡萄糖苷(Anthraglycoside B):浅黄色针晶(稀乙醇中结晶含1分子水mp190-191?。
OHglu OO
HOCH3
O
6(白藜芦醇(Resveratrol):无色针状结晶，mp256-257?，216?升华，易溶于乙醚、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮等。
OH
HOCHCH
OH
7(白藜芦醇葡萄糖苷(polydotinpeceid):无色颗粒状结晶，双熔点分别为130-140?
225,226?，易溶于甲醇、乙醇、丙酮、热水，可溶于乙酸乙酯、可溶于碳酸钠和氢氧化钠水溶液中，稍溶于冷水，难溶于乙醚。
OH
HOCHCH
gluO
8(β-谷甾醇
9(鞣质:属缩合鞣质，可溶于醇及水，不溶于苯、乙醚、氯仿等。
另外。虎杖叶、茎中含少量羟基蒽醌类化合物、有机酸、槲皮苷、异槲皮苷、虎杖黄酮苷、扁蓄苷、金丝桃苷及芸苷、Vtio等。
二、实验原理:
羟基醌类化合物及二苯乙烯类成分，均可溶于乙醇中，故可用乙醇将它们取出来。羟基蒽醌类易溶于乙醚等弱极性溶剂，白藜芦醇苷在乙醚中溶解度很小，利用它们对乙醚的溶解性差异使羟基蒽醌类与白藜芦醇苷分离，再利用各羟基蒽醌类结构上的不同所表现酸性不同，用PH梯度萃取法分离它们。
三、实验方法:
(一)提取
乙醇总提取物的制备:取虎杖粗粉200g，于1000ml圆底烧瓶中回流，第一次加500ml乙醇回流一小时，第二次加300ml乙醇回流30分钟，第三次加250ml乙醇回流30分钟，合并三次乙醇提取液，放置，如有沉淀可过滤一次，滤液减压回收乙醇至干，得膏状物。
(二)分离
1(亲脂性成分与亲水性成分的分离:
将上述膏状物加水10ml，乙醚100ml充分振摇后放置，将乙醚液倾于500ml三角瓶
中(水层不可倒出)，再于烧瓶中加50ml乙醚振摇，放置，倾出乙醚液，同法操作六次，
合并乙醚液即为亲脂性成分——总游离蒽醌，乙醚提取过的剩余物中含水溶性成分。
2(游离蒽醌分离:
(1)强酸性成分的分高:将上述含总游离蒽醌的乙醚液置100ml分液漏斗中，加5%碳酸氢钠水溶液40ml萃取(测5%碳酸氢钠PH值)，放置使充分分层，若提取过程中乙醚挥发可补充，分出碱水溶液同法提取二次，合并碱水提取液，在搅拌下缓缓滴加6N盐酸调至pH2注意观察颜色变化，稍放置即可析出沉淀，抽滤，用水洗涤沉淀中性，将沉淀置表面器上干燥，得强酸性成分。
(2)中等酸性成分——大黄素的分离:碳酸氢钠萃取过的乙醚液用5%碳酸钠溶液(测5%碳酸钠水溶液的pH值)萃取5,9次，每次40ml，直至萃取液较浅为止。合并碳酸钠提取液，小心加盐酸调pH3，放置，抽滤，水洗沉淀至中性，抽干，干燥称重。以甲醇一氯仿或苯一氯仿(1:1)重结晶，得大黄酚和大黄素6-甲醚混合物。
注:大黄酚和大黄素6-甲醚二者相互分离比较困难，在本实验薄层条件下为同一斑点，可用层析用磷酸氢钙进行柱层析，以石油醚洗脱，下层黄色带洗脱后，以甲醇重结晶可得大黄酚，上层黄色带洗脱后以甲醇重结晶可得大黄素6-甲醚。
(3)中性成分——甾醇类化合物分离:氢氧化钠萃取过的乙醚液，用水洗至中性，以无水硫酸钠脱水，回收乙醚得残留物，以甲醇热溶二次(10ml,5ml)过滤合并甲醇液，浓缩，放置结晶，滤取沉淀并用少量石油醚洗涤，再用甲醇重结晶，得β-谷甾醇，mp136,137?，取少许结晶，做醋酐——浓硫酸反应，观察现象。
(三)鉴定
化学检识:分别取大黄素、大黄酚等少许，用乙醚溶解，做如下反应:
A:碱液试验:取试液1ml，加20%NaOH数滴，观察颜色。
B(醋酸镁反应:取试样1ml，加醋酸镁试剂数滴，观察现袋。
2(薄层鉴定:
吸附剂:硅胶—CMC
展开剂:CH—EtoAc(3:2或97:9)。 66
显色剂:(1)氨蒸气熏。(2)5%KOH喷雾。
实验五 芦丁的提取、分离与鉴定
槐花米系豆科槐属植物槐树(Sophora japonica L)的花蕾，自古用作止血药物。治疗吐血，痔疮便血、子宫出血、鼻血等症，所含主要成分为芸香苷，又称芦丁(Rutin，维生素P)，其含量高达12,16%，有调节毛细血管渗透性之作用，临床用作毛细血管止血药，如复方芦丁，也作为高血压的辅助治疗药物。
一、目的要求:
1(掌握酸碱法提取黄酮苷类的原理及方法。
(掌握化学鉴别试验、苷水解、衍生物制备、熔点和薄层层检查等手段在苷类结构鉴2
定上的作用。
3(通过UV、IR、HNMR和MS图谱解析，了解光谱方法黄酮类化合物结构鉴定中的作用。
二、已知重要成分性质:
1( 芦丁(芸香苷，rutin)
淡黄色针晶，水中结晶者含3分结晶水，CHO?3HO 100mmHg和110?加热12小时后，2730162
变为无水物，无水物于25?变棕，115,7?软化，214,5?发泡分解，1g芦丁溶于约300ml冷水，200ml沸水，7ml沸甲醇，溶吡啶，甲酰胺和碱液，微溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯，不溶于氯仿，二硫化碳、乙醚、苯和石油醚。
2( 槲皮素(Guereetin)
为芦丁的苷元，CHO，MW302.23;含二分子结晶水为黄色针晶，(稀乙醇)，5,7?失15107
水，314?解，1g溶于290ml无水乙醇、23ml沸乙醇，溶于冰醋一般在碱水中溶解显黄色，几不溶于水。
OH
HOOOH
ORglurhaR=芦丁
OHOR=OH槲皮素
3( 皂苷(Saponin)
粗品为白色粉末，mp 210?,20?(dec)。易溶于吡啶。能溶于200倍的甲醇，酸水解得下列两种苷元及糖。糖为葡萄糖，葡萄糖醛酸和葡萄醛酸内酯。
(1)白桦酯醇(Betulin)无色针晶，mp215,2?，能溶于醋酸，丙酮、醋酸乙酯、甲醇、乙醇、氯仿、苯等;难溶于石油醚和水。
OHCHOH2
HOHO
槐花二醇(Sophoradiol)无色针晶，mp219~20?或224?，溶于石油醚、苯、丙酮、甲醇、难溶于水。
三、提取分离和纯化
槐花米粗粉(20g)
碱提取
在500ml烧杯中加入水250ml，硼砂1g[注1]在加热至沸腾时，投入槐花米，
继续直火煮沸2~3分钟，在搅拌下小心加入石灰乳，调至8.5~9[注2]保持
微沸30分钟，趁热用尼龙布挤过滤。
滤液滤渣
酸沉淀
在60~70?下用浓盐酸调pH至4[注3]。静置6小时
以上析出沉淀。抽滤，用蒸馏水洗沉淀1~2次至中
性。
沉淀(芦丁粗品)滤液
(弃去)粗称重后按芦丁在热水中1?200的溶解度加
蒸馏水进行重结晶。将沉淀悬浮于蒸馏水中，
加热煮沸15分钟，趁热过滤。
滤渣(弃去)滤液
充分静置，过滤，60~70?干燥，称重。
芦丁(精制品)
注1:硼砂因能与芦丁结合，起保护邻二酚羟基，不被氧化破坏的作用，实验证明，提取时加入硼砂，产品质量要好些。
注2:加石灰乳既能达到碱溶解提取芦丁的目的，还可以除去槐花米中大量的粘液质和酸性树脂(形成钙盐沉淀)，但pH不能过高和长时间煮沸，因为会导致芦丁的降解。
注3:pH过低会使芦丁形成锌盐而降低收率。
四、芦丁的鉴定
定性反应见附录酮苷的鉴别。
(一)芦丁的酸水解
称取精制芦丁约2g，研细，加HSO150ml，投入500ml锥形瓶中，放沸石，直火沸腾24
后，保持2小时，放冷后抽滤，滤液保留作糖份的鉴定，水洗沉淀后，粗品用95%乙醇大约20ml回流溶解，趁热过滤，放置，加水至50%左右浓度，得黄色针晶。
(二)糖的鉴定
1(纸层析鉴定:取水解母液20ml，于水溶上加热，同时于搅拌下加BaCO细粉中和至3中性，滤BaCO后，滤液在水浴上浓缩至2~3ml，得样品液，以葡萄糖和鼠李糖标准品作对3
照。
展开剂:正丁酵一醋酸一水(BAW)(4:1:5)上层，上行展开。
显色剂:苯胺一邻苯甲酸试液，喷后105?烘10分钟。显棕红色斑点。
2(糖脎的制备及鉴定
余下的水解母液小心用45%NaOH液中和、滤除棕红色沉液物，水浴上加热浓缩至约30ml，滤后加1g盐酸苯肼和2gNaAC，沸水浴上加热30~40分钟，析出黄混合糖脎，停止加热冷却，取结晶少许，于是显微镜下观察，鼠李糖脎为簇状针晶，葡萄糖脎扫帚状聚针晶，滤取糖结
丙酮液，即析出葡萄糖脎抽晶，水洗，干燥后，溶于丙酮，滤除不溶物。滤液加水使呈30%
滤后以少量丙酮重结晶一次，mp209?，母液加水稀释，析出鼠李糖脎，稀乙醇重结晶，mp135?。
(三)芦丁和槲皮素的薄层层析鉴定
吸附剂:青岛硅胶G(10~400)以0.4%CMC-Na水液制板，105?活化1小时。
展开剂:(1)CHCL-MeOH-HCOOH(15:5:1) 3
(2)CHCL-丁酮-HCOOH(5:3:1) 3
显色剂:1%FeC和1%K[Fe(CN)]水溶液，应用时等体积混和。 1336
四、槲皮素五乙酰化物的制备
称取精制的槲皮素0.2g，置25ml干燥的锥形瓶中，加6ml醋酐和1滴浓HSO，振摇使24完全溶解，接上空气冷管，于水浴上加热30分钟放冷，搅拌下倾入100ml冰水中，搅至稀油滴消失，得灰白色的粉末沉淀，放置抽滤，洗涤，用95%乙醇将沉淀重结晶，得无色针晶，为五乙酰化槲皮素，mp192~4?。
五、光谱鉴定
(一)紫外光谱
利用紫外吸收光谱，测定黄酮化合物在加入各种电解质或络合剂后吸收峰的位移，根据位移的情况，以判断化合羟基的位置。
1(试剂配制
(1)无水甲醇:用分析纯的甲醇，加入10%CaO，放置24小时后，加热回流1小时，回流时冷凝管顶端应安装CaCl干燥管，然后蒸馏得无水甲醇。 2
(2)甲醇钠溶液:取金属钠0.25g，切碎，小心加入无水甲醇10ml中，此溶液贮存于玻璃瓶中，用橡皮塞密封。
(3)氢氧化钠溶液:取2.0g NaOH，加10ml水溶解。
(4)三氯化铝溶液:2.5g无水三氯铝小心地加入无水甲醇550ml中，放置24小时后全溶即得。
(5)醋酸钠:用无水粉状醋酸钠。
(6)硼酸饱和液:将无水硼酸加入适量无水甲醇，制成饱和溶液。
依照上述方法制备的各贮备液，可存放使用6个月。
2(测定方法
精密称取黄酮样品(槲皮素)约1.2mg，用无水甲醇溶解，再稀释至100ml。
(1)黄酮光谱:取样品溶液约3ml置于石英杯(1cm)中，在200~500nm波段内进行扫描，重测一次，视光谱的重现性。
(2)氢氧化钠光谱:取样品溶液约3ml置于石英杯中，加入氢氧化钠2~3滴后，立即进行测定。放置5分钟后，再测定一次。
(3)甲醇钠光谱:取样品溶液约 3ml置于石英杯中，加入甲醇钠溶液5~7滴后，立即进行测定。放置5分钟后，再测定一次。
(4)三氯化铝光谱:在盛有约3ml样品溶液的石英杯中，加入AICI溶液6滴，放置3一分钟后进行测定。测定后，加入3滴盐酸溶液(浓盐酸:水=1:1)，再测定一次。
(5)醋酸钠光谱:取样品溶液约3ml置于石英杯中，加入适量的无水醋酸钠固体，杯底剩有约2mm的醋酸钠时，二分钟内进行测定。
实验六 秦皮中七叶苷、七叶内酯的提取、分离和鉴定
秦皮为本樨科白蜡树属植物白蜡树(Fraxinus Chinensis Poxb)或苦沥白蜡树(F.rhynchophylla Hance)或小叶白蜡树(F.bungeana DC)的树皮,味苦，性微寒。具有清热、燥湿、收涩作用。主治温热痢疾、目赤肿瘤等症。
秦皮中含有多种内酯类成分及皂苷、鞣质等，其中主要有七叶苷、七叶内酯、秦皮苷及秦皮素等。多有抗菌消炎的生理活性，七叶内酯对细菌性痢疾、急性肠炎有较好治疗效果，兼有退热作用，毒付作用小，几无苦味。适于小儿服用。
一、秦皮中主要成分的结构及性质
1(七叶苷(esculin)，又叫马粟树皮苷:白色粉末状结晶，mp205,206?。易溶于热水(1:15)，可溶于乙醇(1:24)，微溶于冷水(1:610)，难溶于乙酸乙酯，不溶于乙醚、氯仿。在稀酸中可水解。水溶液中有蓝色荧光。
HOOO
gluO
2(七叶内酯(esculetin):黄色针状结晶，mp276?。易溶于沸乙醇及氢氧化钠溶液，可溶于乙酸乙酯，稍溶于沸水，几不溶于乙醚、氯仿。
HOOO
HO
3(秦皮苷(fraxin):mp205?。
glu
O
OHOO
CHO3
4(秦皮素(fraxetin):mp227,228?。
OH
HOOO
OCH3
二、实验原理
七叶苷、七叶内酯均能溶于沸乙醇，可用沸乙醇将二者提取出来，再利用二者在乙酸乙酯中的溶解性不同而分离之。
三、实验方法
(一)提取:取秦皮粗粉150g于索氏提取器中，加400ml乙醇回流10-12小时，得乙醇提取液，减压回收溶剂至浸膏状，即得总提取物。
(二)分离:在上述浸膏中加40ml水加热溶之。移于分液漏斗中，以等体积氯仿萃取二次，将氯仿萃取过的水层蒸去残留氯仿后加等积乙酸乙酯萃取二次，合并乙酸乙酯液，以无水硫酸钠脱水，减压回收溶剂至干，残留物溶于温热甲醇中，浓缩至适量，放置析晶，即有黄色针状结晶析出。滤出结晶。甲醇、水反复重结晶，即得七叶内酯。
将乙酸乙酯萃取过的水层浓缩至适量，放置析晶，即有微黄色晶体析出。滤出结晶。以甲醇，水反复重结晶，即得七叶苷。
(三)鉴定:
1(化学检识:取七叶苷、七叶内酯各少许分别置试管中，加乙醇1ml溶解。加1%FeCl3溶液2—3滴，显暗绿色，再滴加浓氨水3滴，加水6ml，日光下观察显深红色。
2(薄层鉴定:
吸附剂:硅胶G
样品:七叶苷、七叶内酯标准品及自制七叶苷)七叶内酯的醇溶液。
展开剂:甲醇—甲酸乙酯—甲苯(1:4:5)
显色:1)UV灯下观察，七叶苷为灰色荧光，七叶内酯为灰褐色。 254
2)以重氮化对硝基苯胺喷雾显色，七叶苷和七叶内酯均呈玛瑙色。
结果:七叶苷Rf=0. 04，七叶内酯Rf=0.28
实验七 薯蓣皂苷元的提取和鉴别
一、目的要求:
1(掌握甾体皂苷元(亲脂性和中性成分)的提取方法。
2(熟悉薯蓣皂苷元的性质及鉴定法。
二、简介:
薯蓣皂苷元(Diosgenin)是一种甾体皂苷元，分子式(CHO),分子量414.61，为274231
25,白色结晶，mp204,207?，[]-129.3(CHCl)，溶于一般有机溶剂和醋酸，不溶于水。D3
目前，是制造多种甾体药物如口服避孕药(I号，II号避孕药片)和甾体激素(如可的松)等的重要原料。在植物界主要分布在薯蓣科薯蓣属(Dioscorea)植物中，我国的薯蓣属植物有80余种，其中只有薯蓣根茎组(Stenophora)的17种、I亚种及一变种才含有甾体皂苷元，其它则含有多量淀粉，无皂苷元。已用于生产的主要有盾叶薯蓣(D.Zingiberensis C.
.nipponica Makino)，黄山药(D.panthaica prain et Burkil),H. Wright)，穿龙薯蓣(D
紫黄姜(D.nipponica Makinovar rosthani prain et Burk)等。在植物体内薯蓣皂苷元是与葡萄糖、鼠李糖结合成薯蓣皂苷(Dioscin)而存在。提取分离时，一般是先用稀酸将薯蓣皂苷水解成薯蓣皂苷元与单糖(葡萄糖、鼠李糖)。因薯蓣皂苷元不溶于水，混存于植物残渣中，故可用有机溶剂(如石油醚)直接从植物残渣中提取出薯蓣皂苷元。
HO26212522HO2018CH32326212512272224O171811CH20323131619122724O1117水解15131614191014+15O10gluH(rha)2+glu+2rhaHO
三、提取方法
1(皂苷预试:
?泡沫试验 方法见“皂苷的鉴别”
?李伯曼—布哈德(Liebermann-Burchard)反应
2(薯蓣皂苷元的提取:
样品(薯蓣地下部分)
粉碎
碎块(3-5mm左右的小颗粒)50g
置于100ml锥形瓶中，再加入2NHSO500ml，安上空气回流管，24
在电炉上直火加热(隔石棉网)回流4小时(从回流开始计时)。水解物
放冷，水洗两次后，用NaCO粉中和，在布氏漏斗上水洗至中性，23
尽量抽干。
中性滤渣(薯蓣皂苷元+植物组织等)
滤渣置盘中，在60?干燥(干燥过程中要注意压散团块并翻动)干燥的中性滤渣
置沙氏提取器中，以石油醚(bp30-60?)在水浴上回流提尽皂苷
元[注一]
石油醚提取液
回收石油醚[注二]至约10-15ml时停止，倾入小锥形瓶，密塞，冷却
析晶，抽滤，用少量石油醚快速抽洗[注三]
薯蓣皂苷元(粗品)
用无水乙醇重结晶(必要时用少许活性碳脱色)，干燥(105?)白色晶体
(薯蓣皂苷元) 注一:检查薯蓣皂苷元是否提尽，可用李伯曼反应，参考实验二“注三”项下。 注二:回收石油醚的方法见实验一“注四”项下。
注三:所得薯蓣皂苷元(粗品)用石油醚抽洗后，即可测定熔点，若熔点不合格时，才
进行重结晶。
四、薯蓣皂苷元的鉴定
1(熔点测定:204,209?
2(薄层层析鉴定:
应只呈现一个与标准Rf值一致的色斑。
样品:白色结晶的无水醇液
标准品:薯蓣皂苷元无水醇液
1)吸附剂:AIO软板(中性100,200目，活性?级) 23
展开剂:苯一甲醇(9:1)
2)吸附剂:硅胶H-CMC硬板
展开剂:石油醚-乙酸乙酯(7:3)
显色剂:10%磷钼酸乙醇溶液。喷雾后加热10,20分钟
3)化学反应:
?Liebermann-Burchard反应
?CHCI—浓HSO试验 324
?五氯化锑反应(Kahlenberg反应):与五氯化锑的氯仿溶液呈紫蓝色。
4)制备衍生物:
乙酰化物的制法:取样品100mg溶于3ml吡啶中，加入20ml醋酐，煮沸半小时至一小时后，将反应物倒入冰水中(冬季操作使用冷水即可)。待析出白色晶体后，抽滤，析出物丙酮重结晶即得。mp196,193?。
5(紫外吸收光谱的测定:
取样品5mg，加入浓HSO 10ml，在40?水浴上加热1小时，放冷，测定。薯蓣皂苷元24
应有以下最大吸收峰:
λmax 271nm 415nm 514nm
, 10g 3.99 4.06 3.64
实验八 中草药化学成份的鉴别法
一、生物碱的鉴别
1(检品溶液的制备:
，加蒸馏水20~30ml，并滴加数滴盐酸，使呈酸性。在60?水取粉碎的植物样品约2g
浴上加热15分钟，过滤，滤液供作以下试验。
2(生物碱类成分的鉴别:
生物碱类成分(除有少数例外)均与多种生物碱沉淀试剂在酸性溶液(水液或稀醇液)中产生沉淀反应。操作如下:
(1)取上备酸水浸液四份(每份1 ml左右即可),分别滴加碘-碘化钾)碘化汞钾试剂)碘化铋钾试剂)硅钨酸试剂。若四者均有或大多有沉淀反应，表明该样品可能含有生物碱，再进行下项试验，进一步识别。
(2)取上备其余酸水浸液，加NaCO溶液呈碱性，置分液漏斗中，加入乙醚约10ml振23
摇，静置后分出醚层，再用乙醚3ml，如前萃取，合并醚液。将乙醚液置分液漏斗中，加酸水液10ml振摇，静置分层，分出酸水液，再以酸水液5ml如前提取，合并酸水液，如此酸提液四份，分别作以下沉淀反应。
a(碘化汞钾试剂(Mayer试剂):酸水提液滴加碘化汞钾试剂，产生白色沉淀。
b(碘化铋钾试剂(Dragendorff试剂):酸水提液滴加碘化铋钾试剂，产生桔红色或红棕色沉淀。
c(碘-碘化钾试剂(Wagner试剂):酸水提液滴加碘-碘化钾试剂，产生棕色沉淀。
d(硅钨酸试剂:酸水提取液滴加硅钨酸试剂产生淡黄色或灰白色沉淀。
此酸水提液与以上四种试剂均(或大多)产生沉淀反应，即预示本样品含有生物碱。
(3)备注:以上(1)、(2)沉淀反应结果:沉淀的多少以“+++”，“++”，“+”表示，无沉淀产生则以“—”表示。若(1)项试验全呈负反应，可另选几种生物碱沉淀试剂(可参考有关资料)进行试验，若仍为负反应，则可否定样品中有生物碱的存在，不必再进
)项试验。 行(2
二、苷类的鉴别
(一)苷的一般鉴别反应
1(检品溶液的制备:
中草药水浸液:取中草药碎块或粉末2g，加蒸馏水约20ml 70??水浴，浸渍10分钟，过滤，滤液供鉴别用。
中草药醇浸液:取中草药碎块或粉末少许于试管中，加乙醇10ml，在温水浴上浸渍10分钟，过滤，滤液供鉴别用。
2(鉴别试验:
,,(1)-萘酚试验(Molish)反应 取醇浸液1ml，加10%-萘酚醇液1滴，摇匀，沿管壁缓慢加入浓HSO 10滴，不振摇，观察两液介面间是否出现紫红色杯(此反应检识糖、24
苷类化合物，反应较灵敏。若有微量滤纸纤维或中草药粉末存在于溶液中，都能产生上述反应，故在过滤时应加以注意)。
(2)水解反应:
取水浸液3ml于试管中，加10%HCl 1ml在沸水浴上加热20分钟，观察是否有絮状沉淀产生,
(3)碱性酒石酸铜(斐林试剂Fehling’s test solution)试验
取水浸液2ml，加入新配制的斐林试剂(甲+乙等量混合)1ml，在沸水浴上加热数分钟，如产生红色的氧化亚铜沉淀，则行过滤，滤液中加10%HCl调成酸性，置水浴上加热10分钟。进行水解，如有絮状沉淀则滤去。然后用10%NaOH中和，再加入斐林试剂1ml，仍置沸水浴上加热5分钟，观察是否有黄色，砖红或棕色沉淀产生,(此反应试多糖，苷类)从反应结果说明供试中草药中是否含有苷,(此试验法亦可采用同体积同浓度的中草药浸液两份，一
份先经酸水解过滤碱化后，另一份再同时进行如上的还原反应，对比生成的氧化亚铜量，两份是否有差异来判断，具体方法见系统预试实验)。
注:中草药对苷的一般鉴别是正反应，还可进一步作个别苷类的鉴定。具体方法如后。
(二)蒽苷的鉴别
1(检品溶液的制备:
取大黄粉末2克，加乙醇20ml，在沸水浴上回流浸提10分钟，过滤供鉴别用。
2(鉴别试验:
(1)与碱成盐显色反应(Borntrager反应):取1ml乙醇提取液，加入1ml 10% NaOH溶液，如产生红色反应，加入少量30%过氧化氢液，加热后红色不褪，加酸使呈酸性时，则红色消褪再碱化又出现红色。
注:或取大黄粉末少许，置小试管中，加水1~2ml，加浓HSO 2—3滴，置水浴中加热24
10分钟，冷却，加乙醚1—2ml振摇。用吸管吸取醚液(黄色)于另一洁净试管中，加入NaOH试液1ml振摇，则醚层应褪为无色，碱层(下层)为红色，示有蒽醌类成分存在，如供试的中草药在以上试验中碱水层仅现黄色，可分出碱水溶液，置试管中，加30%HO溶液1~2滴，22在沸水浴中加热数分钟，混液如能转为橙红色，说明中草药中可能有蒽酚类成分存在。
(2)升华试验:取大黄粉末少许，置载玻片上，玻片两端各放短木棍一小段，然后另取一洁净载玻片，放置于小棍上，注意勿触及下面粉末。然后移置在三足架的铁纱网上小心加热(勿使粉末炭化)至玻片上有升华物凝结为止，取下盖片，使升华物面向上，放置于显微镜下观察，可见多数黄色针晶或羽毛状晶体(蒽醌衍生物)。此晶体遇碱液呈红色。
(3)园形滤纸层析:
样品:大黄醇浸液
显色:1)于自然光下观察色带
2)于紫外光下观察荧光环
3)氨熏，观察是否出现红色环，再置uv下观察荧光环
4)喷0.5%MgAC甲醇液，于90?烘5分钟，是否出现橙红或紫红色环。 2
(三)黄酮苷的鉴别
1(检品溶液的制备:
取槐花米约1克压碎于试管中加乙醇10~20ml在水浴上加热20分钟。过滤，滤液供以下试验。
2(鉴别试验:
?取醇浸液2ml，加浓盐酸2~3滴及镁粉少量，放置(或于水浴中微热)，产生红色反应。
?取醇浸液1ml，滴加pbAC溶液数滴，产生黄色沉淀。 2
?纸片法:
将醇浸液滴于滤纸上，分别进行以下试验:
?先在紫外灯下观察荧光，然后喷1%AlCl试剂，再观察荧光是否加强。 3
?氨熏后出现黄色，棕黄色荧光斑点。
与氨接触而显黄色，或者原呈黄色，但与氨接触后黄色加深，滤纸片离开氨蒸气数分钟，黄色或加深后的黄色又消褪。
喷以3%FeCl乙醇溶液，出现绿、兰或棕色斑点。 ?3
(四)强心苷的鉴别
1(检品溶液的制备:
取夹竹桃叶碎块粉末3g，于100ml锥形瓶中加70%乙醇40ml，水浴上浸煮5分钟，放冷，过滤，滤液(或经处理后——方法参照注二)供鉴别用。
[注1]:强心苷的试验都是在较强的碱性条件下进行，如果样品中含有蒽醌，也具有红色反应，防碍检查，因此在检查前需先检查有无蒽醌类成分，若有则应先将其除去，即将乙醇浸液在水浴上蒸发，残渣加CHCl热溶后过滤，CHCl液用1%NaOH液振摇，去除蒽醌后，33
CHCl液供鉴别用。 3
[注2]:夹竹桃叶或毛地黄叶绿素，常使醇提液带较深的绿色，影响反应的进行。故需将叶绿素除去，具体方法如下:
乙醇浸提液在水浴上挥去大部分乙醇(不让乙醇挥尽)，再加水适量，使含醇量约20%左右，稍热后即放冷，过滤，滤液即可供试验用，或将滤液在水浴上浓缩至糖浆状，加入95%乙醇10ml溶解再供试验用。
2(鉴别试验:
(1)三氯化铁冰醋酸反应(Keller-Kiliani反应):取醇提液或经处理后的CHCl或醇3液1ml，水浴上蒸干，残渣溶于冰醋酸2ml中，加入1%FeCl乙醇液1滴，混合均匀，倾入3
干燥小试管中，再沿管壁缓慢加入等体积浓硫酸，静置，二液交界处显棕色(苷元)，渐变
,为浅绿，兰色，最后上面醋酸层全呈兰色或兰绿色(-去氧糖)。
(2)碱性3.5-二硝基苯甲酸反应(Kedde反应):取1ml醇浸提液，加入碱性3.5-二硝苯甲酸试剂3~4滴，产和红色或红紫色反应。
(3)亚硝酰铁氰化钠反应(Legal反应):取1ml醇浸提液或经处理后的CHCl或醇液3在水浴上蒸干，用1ml吡淀溶解残渣，加入0.3%亚硝酰铁氰化钠溶液4~5滴，混匀，再加入NaOH饱和乙醇液1—2滴，是否呈现红色(若结果不明显可另一取一份供试液如上操作，最后加NaOH饱和乙醇液0—5ml，观察二液交界面有无红色)。
(4)碱性苦味酸(Baljet反应)
取样品醇液1ml，加入碱性苦味酸试剂(苦味酸饱和水液与5%NaOH水液等量混合)数滴，呈现橙或橙红色。
(五)皂苷的鉴别
1(检品溶液的制备:
1)取皂角碎块1g于大试管(或小烧杯)中，加蒸馏水15ml，于30~90?水浴上浸渍15分钟后过滤，滤液供鉴别用。
2)取薯蓣碎块0.5g加上法同样制备得薯蓣水浸液。
3)取薯蓣碎块0.5g于大试管或小锥形瓶中加95%乙醇10ml于水浴上温浸15分钟，滤液供鉴别。
2(鉴别试验:
(1)溶血试验:取滤纸片一小块，于小心处滴加皂角浸液一滴，待干后于同处再滴加一滴，如是反复操作至滴加数滴，干燥后无喷雾血球试液(取牛血、羊血或兔血一份，用玻棒或棉签搅和，除去凝集的血蛋白，加pH7.4磷酸盐缓冲液一份稀释即得)，数分钟后观察在红色的背底中是否出现无红色的黄色(或透明)斑点(中心处皂解浸液原点)。(本反应亦可在试管中进行，血球试液中草药浸液中的皂苷溶解后，血球液由浑浊变为澄明。此外还可在载玻片上进行，并在显微镜下观察血球破裂溶解前后的状况)。
2)泡沫试验:薯蓣浸液，皂角浸液各2ml，分别置于试管中。用力振摇一分钟后放(
置，在10分钟内观察二管是否都有持久性泡沫产生,
(3)醋酐浓硫酸试验(Liebermann-Burchard反应)，皂角浸液5ml，于蒸发皿中在水浴上蒸干，加入1ml醋酐使其溶解，滴于干燥比色盘中，从边沿缓缓滴加浓硫酸1滴，观察颜色变化。
另取薯蓣浸液5ml，置于蒸发皿中，在水浴上蒸干，加入1ml醋酐溶液，并倾入比色盘中，(试管)沿管壁加入几滴浓硫酸，观察界面间是否有紫红色环产生,
(4)氯仿—浓硫酸试验(Salkowski反应):取薯蓣醇浸液2ml，在水浴上蒸干，有氯仿1ml溶解，转入干燥小试管中，沿壁小心加浓硫酸1ml，氯仿层显红或兰色，硫酸层有绿色荧光，示含甾体皂苷。
(六)香豆精苷的鉴别
1(检品溶液的制备:
取秦皮2克，加入乙醇20ml，在水浴上回流10分钟，趁热过滤，滤液供鉴别用。
2(鉴别试验:
(1)内酯化合物的开环与闭环反应:取2ml乙醇浸出液，加1—2ml 1% NaOH，于沸水浴中煮沸3分钟，冷却后加新配制的重氮化试剂1~2滴，显红色。
(2)肟异羟酯酸铁试验:取香豆素少许，加酒精1ml溶解加6滴盐酸羟胺的饱和乙醇液混匀后加入6滴KOH的饱和乙醇液，使其显强碱性再转入试管中加热10分钟左右(有气泡产生)，冷却加5%盐酸使呈弱酸性(Ph6左右)，倾入比色盘或蒸发皿中，沿器壁滴10%FeCl3溶液，约半分钟后紫色出现或加深(后消失)。(此反应试酯、内酯、香豆精及其苷类。但用中草药浸液试验反应结果不太明显)。
(七)氰苷的鉴别
取苦杏仁4~5粒，研碎，置50ml锥形瓶中加入3ml。
5%硫酸溶液，充分混合，塞好，进行以下(1)、(2)反应。
(1)苦味酸钠试验:取滤纸条先滴加饱和苦味酸液侵润，稍干后，再滴加10%碳酸钠1~2滴润湿，干后，悬于上述锥形瓶中，在水浴上加热10分钟，滤纸渐变为橙色或砖红色。
(2)取滤纸条先滴加3~4滴愈创木树酯醇溶液润湿，干后，再滴加1%硫酸钠液3~4滴润湿后，悬于同一锥形瓶中，放置，滤纸条渐变为鲜兰色(放置过入色渐褪)。
(3)亚铁氰化铁反应(普鲁士兰反应):另取苦仁一粒研碎，放入试管中，加水1~2滴润湿(切勿过量)，立即用已被10%NaOH试剂1滴湿润的滤纸条悬于管口置50?水浴上约10分钟，将滤纸取出，于滤纸上加10%FeSO液1滴，加10%HCl1~2滴及1%FeCl，试液1滴43即显兰色。
四、挥发油的定性鉴别
(外观性状: 1
(1)取各种挥发油(松节油、薄荷油、丁香油、陈皮油及桂皮油)观察其色泽，是否有特殊香气，及辛辣烧灼味感。
(2)挥发性:取滤纸屑一小块，滴加薄荷油一滴，放置2小时或微热后观察滤纸上有无清晰的油迹(与菜油作对照实验)。
(3)pH检查:(检游离酸或酚类)。
取样品一滴加乙醇5滴，以预先用蒸馏水湿润的广泛pH试纸进行检查，如显酸性，示有游离的酸或酚类化合物，剩下的样品乙醇液供下面(7)(8)试验用。
(4)FeCl反应(检酚类): 3
取样品一滴，溶于1ml乙醇中，加入1%得FeCL醇液1~2滴，如显蓝紫或绿色，示有酚3
类。
(5)苯肼试验(检酮、醛类)
取2，4—二硝苯肼试液0.5~1ml，加1滴样品的无醛醇溶液，用力振摇，如有酮醛化合物，应析出黄一橙红色沉淀，如无反应，可放置15min后再观察之。
6)荧光素试验法: (
将样品乙醇液滴在滤纸上，喷酒0.05%荧光素水溶液，然后趁湿将纸片暴露在5%Br/Col24蒸汽中，含有双键的萜类(如挥发油)呈黄色;背景很快转变为浅红色。
(7)香荚醛——浓硫酸试验:
取挥发油乙醇液一滴于滤纸上，滴以新配制的0.5%香荚醛的浓硫酸乙酸液，呈黄色、棕色、红色或兰色反应。
五、鞣质类化合物的鉴别
1(检品溶液的制备:
取五倍子(含可水解鞣质)，儿茶(含缩合鞣质)，没食子酸(鞣质水解产生伪鞣质)少量(约0.1克)分别置大试管中，加蒸馏水约10ml，加热煮沸，过滤，滤液作以下试验:
2(鞣质的一般反应(鞣质与伪鞣技的区别鉴定)
(1)感观试验:取制备的鞣质和伪鞣质溶液，尝其味，并以石蕊试纸检查溶液是否呈酸性反应。
(2)三氯化铁反应:取制备的鞣质溶液(五倍子溶液或儿茶溶液)及伪鞣溶液(食子酸溶液)各1~2ml ，分别加入三氯化铁试液,鞣质产生绿色或兰黑色反应或沉淀;伪鞣质产生兰色反应。
(3)沉淀蛋白反应:取鞣技溶液及伪鞣质溶液各1~2ml，分别入明胶溶液数滴，鞣技立刻产生沉淀反应。
(4)生物碱反应:取鞣质溶液及伪鞣质溶液各1~2ml，分别滴加0.1%咖啡碱水溶液，鞣质液产生沉淀反应，伪鞣质不产生沉淀反应。
(可水解鞣和缩合鞣质的区别鉴定 3
(1)鞣红反应:取五倍子浸液(含可水解鞣质)，儿茶浸液(含缩合鞣质)各2ml，分别加盐酸0.5ml，加热煮沸30分钟左右放冷。可水解鞣质不发生沉淀，缩合鞣质有红色沉淀产生。
(2)三氯化铁反应:取五倍子浸液及儿茶浸流各1~2ml，分别加入三氯化铁试液数滴，可水解鞣质显兰色或黑兰色反应，缩合鞣质显黑绿色反应。
(3)溴水反应:取五倍子浸液用儿浸液各1~2ml，分别加入溴水数滴，可水解鞋帽质不产生沉淀反应，缩合鞣质产生沉淀。
(4)石灰水反应:取五倍子浸液及儿茶浸液各1~2ml，分别加入新制石灰水数滴，可水解鞣质显青灰色沉淀，缩合鞣质显棕色沉淀。
(5)醋酸溶液中与醋酸铅反应:取五倍子浸液及儿茶浸液各1~2ml，分别加醋酸液数滴，摇匀后再分别滴加醋酸铅溶液数滴，可水解鞣质产生絮状沉淀，缩合鞣质无沉淀产生。
附录一 中草药化学成分检出试剂配制法
一、生物碱沉淀试剂:
1(碘化铋钾(Dragendorff)试剂:取次硝酸铋3g溶于30%硝酸(比重1.18)17ml中，在搅拌下慢慢加碘化钾浓水溶液(27克碘化钾溶于20ml水)，静置一夜，取上层清液，加蒸馏水稀释至100ml。
附:改良的碘化铋钾试剂:
甲液:0.85g次硝酸铋溶于10ml冰醋酸，加水40ml。
乙液:8g碘化钾溶于20ml水中。
溶液甲和乙等量混合，于棕色瓶中可以保存较长时间，可作沉淀试剂用，如作层析显色剂用，则取上述混合液1ml与醋酸2ml，混合即得。
目前市场上碘化铋钾试剂可直接供配制:7.3g碘化铋钾，冰醋酸10ml，加蒸馏水60ml。
(碘化汞钾(Mayer)试剂:氯化汞1.36g和碘化钾5g各溶于20ml水中，混合后加2
水稀释至100ml。
3(碘一碘化钾(Wagner):试剂:1g碘化钾液于50ml，加热，加2ml醋酸，再用水稀释至100ml。
4(硅钨酸试剂:5g硅钨酸溶于100ml水中，加盐酸少量至pH2左右。
5(苦味酸试剂:1g苦味酸溶于100ml水中。
6(鞣酸试剂:鞣酸1g加乙醇1 ml溶解后再加水至10ml。
7(碱酸铈——硫酸试剂:0.1g硫酸铈混悬于4ml水中，加入1g三氯醋酸，加热至沸，逐滴加入浓硫酸至澄清。
二、苷类检出试剂:
(一)糖的检出试剂:
1(碱性酒石酸铜(Fehiling)试剂:本口分甲液与乙液，应用时取等量混合。
甲液:结晶硫酸酮6.23g，加水至100ml。
乙液:酒石酸钾钠34.6g，及氢氧化钠10g，加水至100ml。
2(ɑ-萘酚(Molisch)试剂。
甲液:ɑ-萘酚1g，加75%乙醇至10ml。
乙液:浓硫酸
3(氨性硝酸银试剂:硝酸银1g，加水20ml溶解，注意滴加适量的氨水，随加随搅拌，至开始产生的沉淀将近全溶为止，过滤。
4(ɑ-去氧糖显色试剂
1)三氯化铁冰醋酸(Keller-Kiliani)试剂 (
甲液:1%三氯化铁溶液0.5ml，加冰醋酸至100ml。
乙液:浓硫酸。
(2)占吨氢醇冰醋酸(Xanthydrol)试剂:10mg占吨氢醇溶于100ml冰醋酸(含1%的盐酸中)
(二)酚类
1(三氯化铁试剂:5%三氯化铁的水溶液或醇溶液。
2(三氯化铁一铁氰化钾试剂:
甲液:2%三氯化铁水溶液
乙液:1%铁氰化钾水溶液
应用时甲液、乙液等体积混合或分别滴加。
3、4一氨基氨替比林一氨氰化钾(Emerscn)试剂: 甲液:2%4-氨基安替比林乙醇液
乙液:3%铁氰化钾水溶液，(或用0.9%4-氨基安替比林和5.4%铁氰化钾水溶液)。
4(重氮化试剂:本试剂系由对硝基苯胺和亚硝酸钠在强酸下经重氮化作用而成，由于
重氮盐不稳定很易分解，所本试剂应临用时配制。
甲液:对硝基苯胺0.35g，溶于浓盐酸5ml，加水至50ml。 乙液:亚硝酸钠5g，加水至50ml
应用时取甲、乙液等量在冰水浴中混合后，方可使用。 5(Gibb试剂:
甲液:0.5%2，6-二氯苯醌-4氯亚胺的乙醇溶液。
乙液:硼酸一氯化钾一氢氧化钾缓冲液(pH9.4)。
[注]试剂配制法中:1.水是指蒸馏水;2.不指出溶剂的即为水溶液;3.醇指95%;4.
试剂配制后应澄清，如不澄清可过滤。
(三)内酯、香豆素类
1(异羟肟酸铁试剂
甲液:新鲜配制的1N羟胺盐酸盐(M=69.5)的甲醇液。 乙液:1.1N氢氧化钾(M=56.1)的甲醇液
丙液:三氯化铁溶于1%盐酸中的浓度为1%的溶液。
应用时甲、乙、丙三液体按次序滴加，或甲、乙两液混合滴加后再加丙液。 2(4-氨基安替比林一铁氰化钾试剂(见二一(二)-3)。 3(重氮化试剂:(见二一(二)-4)。
进行2、3试验时样品应先加3%碳酸钠溶液加热处理，再分别滴加试剂。 4(开环一闭环试剂
甲液:1%氢氧化钠溶液。
乙液:2%盐酸溶液。
(四)黄酮类:
1(盐酸镁粉试剂:浓盐镁和镁粉
2(三氯化铝试剂:2%三氯化铝甲醇溶液
3(醋酸镁试剂:1%醋酸镁甲醇溶液
4(碱式醋酸铅试剂:饱和碱式醋酸铅(或饱和醋酸铅)水溶液。 5(氢氧化钾试剂:10%氢氧化钾水溶液。
6(氧氯化锆试剂:10%氧氯化锆甲醇溶液。
7(锆一枸橼酸试剂:
甲液:2%氧氯化锆甲醇液。
乙液:2%枸橼酸甲醇液。
(五)蒽醌类:
1(氢氧化钾试剂:10%氢氧化钾水溶液。 2(醋酸镁试剂:105醋酸镁甲醇溶液。 3(1%硼酸试剂:1%硼酸水溶液。
4(浓硫酸试剂:浓硫酸。
5(碱式醋酸铅试剂:(见二一(四)一4)。 (六)强心苷类
1(3，5-二硝基苯甲酸(Kedde)试剂。 甲液:2%3，5-二硝基苯甲酸甲醇液。 乙液:1N氢氧化钾甲醇溶液:
应用前甲、乙两液等量混合。
2(碱性苦味酸(Baljet)试剂:
甲液:1%苦味酸水溶液。
乙液:10%氢氧化钠溶液。
3(亚硝基铁氰化钠一氢氧化钠的(Legal)试剂: 甲液:吡啶
乙液:0.5%亚硝基铁氰化钠溶液。
丙液:10%氢氧化钠溶液
(七)皂苷类:
1(溶血试验:2%血球生理盐水混悬液:新鲜兔血(由心脏或耳静脉取血)，适量，用
洁净小毛刷迅速搅拌，除去纤维蛋白并用生理盐水反复离心洗涤至上清液无色后，量取沉降
红血球用生理盐水配成2%混悬液，贮冰箱内备用(贮存期2~3天)。
(醋酐一浓碱酸(Liebermann)试剂: 2
甲液:醋酐。
乙液:硫酸。
3(浓硫酸试剂，浓硫酸。
(八)含氰苷类:
1(苦味酸钠试剂:适当大小的滤纸条，浸入苦味酸饱和水溶液;浸透后取出晾干，再
浸入10%碳酸钠水溶液内，迅速取出晾干即得。 2(亚铁氰化铁(普鲁士兰)试剂: 甲液:10%氢氧化钠液。
乙液:10%硫酸亚铁水溶液，用前配制。
丙液:10%盐酸。
丁液:5%三氯化铁液。
三、萜类、甾体类检出试剂
1(香草醛一浓硫酸试剂:5%香草醋浓硫酸液(或0.5g香草醛溶于100ml硫酸一乙醇
(4:1)中)。
2(三氯化锑(Carr-Price)试剂:25g三氯化锑溶于15g氯仿中(亦可用氯仿或四氯
化碳的饱和溶液)。
3(五氯化锑试剂:五氯化锑一氯仿(或四氯化碳)1:4，用前新鲜配制。
4(醋酐一浓硫酸试剂:(见二一(七)一2)。 5(氯仿一浓硫酸试剂:
甲液:氯仿(溶解样品)。
乙液:浓硫酸。
(间二硝基苯试剂: 6
甲液:2%间二硝基苯乙醇液。
乙液:14%氢氧化钾甲醇液。
用前甲、乙两液等量混合。
7(三氯醋酸试剂:3.3g三氯醋酸溶于10ml氯仿，加入1~2溶过氧化氢。
四、鞣质类检出试剂:
1(三氯化铁试剂
2(三氯化铁一铁氰化钾试剂
3(4-氨基安替比林一铁氰化钾试剂
4(明胶试剂:10g氯化钠，1g明胶，加水至100ml。 5(醋酸铅试剂:饱和醋酸铅溶液。
6(对甲基苯磺酸试剂:20%对甲基苯磺酸氯仿溶液。 (铁铵明矾试剂:硫酸铁铵结晶(FeNH(SO)HO)lg，加水至100ml。 744122五、氨基酸多肽、蛋白质检出试剂
1(双缩脲(Biuret)试剂:
甲液:1%硫酸铜溶液。
乙液:40%氢氧化钠液。
应用前等量混合。
2(茚三酮试剂:0.3g茚三酮溶于正丁醇100ml中，加醋酸3ml(或0.2g茚三酮溶于
100ml乙醇或丙酮中)。
3(鞣酸试剂:(一6)
六、有机酸检出试剂
1(溴麝香草酚兰试剂:0.1%溴麝香酚兰(或溴酚兰、或溴甲酚绿)乙醇液。
2(吖啶试剂:0.005%吖啶乙醇液。
3(芳香胺一还原糖试剂，苯胺5g，水糖5g溶于50%乙醇溶液中。
七、其它检出试剂
1(重铬酸钾一硫酸
5g重铬酸钾溶于100ml 40%硫酸。
2(萤光素一溴:
甲液:0.1%萤光素乙醇液
乙液:5%溴的四氯化碳溶液。
甲液喷、乙液熏。
3(碘蒸气
4(硫酸液:5%硫酸乙醇液，或15%浓硫酸正丁醇液。或浓硫酸一醋酸(1:1)。
5(磷钼酸、硅钨酸或钨酸试剂:3~10%磷钼酸或钨酸乙醇液。
6(碱性高锰酸钾试剂:
甲液:1%高锰酸钾液。
乙液:5%碳酸钠液，用时等体积混合。
7(2，4-二硝基苯肼试剂:取2，4-二硝基苯肼配成0.2% 2N盐酸溶液或0.1 2%盐酸乙醇液。
附录2 常用有机溶媒的性质及回收精制
1(甲醇(CHOH) 3
，比重0.7924能与水、乙醇，乙醚，氯仿以任何比例混分子量32.04，沸点64.70?
溶，因不与水共沸，故用分馏法可以获得99.8%的浓度。绝对无水的甲醇，可用镁和碘的方法制得(同乙醇项下)，甲醇易燃，有毒，对视神经有损伤，在操作中应加以注意。
精制方法:工业规格的甲醇中，主要含丙酮和甲醛杂质，可用下述方法除去:
(1)先用高锰酸钾法大致测定醛酮的含量后，加入过量盐酸羟，回流四小时，然后重蒸馏。
(2)将硫酸汞酸性溶液与甲醇一起加热，使丙酮生成终合物析出，或将碘的碱性溶液与甲醇共热使醛或酮氧化成碘仿，然后再分馏精制。
[注意]:甲醇不能用生石灰脱水，因CaO能吸附20%甲醇。且CaO、CHOH、HO三乾与32
相互间形成的复合物处于平衡状态，完成脱去水是不可能的。
2(乙醇(CHOH) 25
分子量46.07，沸点78.32?比重0.7893，与水能任意混溶，蒸馏时与水共沸，共沸点78.1?，共沸混合液含水4.43%，即为95%乙醇。
再生方法，先在用过的乙醇中加入生石灰(氧化钙)用量为每立升25—50克，加热回流脱水后，分级蒸馏，收集76?—81?的馏分，含醇30—90%，再置圆烧瓶中，加计算量多一倍的生石灰再蒸馏收集76?—78?的馏分，浓度可达90.5—99.5%。
如需绝对无水者，则可用以下二法:
(1)99.5%乙醇1000ml，加27.5克苯二甲酸二乙酯和7克金属钠，放置后蒸馏，得无水醇。
CH(COOCH)+2CH5ONa+2HO CH(COONa)+4CHOH 642522264223
(2)93%以上的乙醇60ml，置于2立升容积的圆底烧瓶中加入5克金属镁，0.5克碘，使发生反应促进镁溶解成醇镁，再加900ml乙醇，回流加热五小时，蒸馏可得100%乙醇。
(CHO)Mg+2HO 2CHOH+Mg(OH)2522252
如用于紫外光谱分析:要求较高，普通发酵乙醇常混有少量醛。又无水乙醇用苯，沸蒸馏所得者常含有苯、甲苯、均不宜于光谱分析用，其精制法如下:95%普通乙醇100ml，加入25ml 12N HSO，在水浴上回流加热数小时以除去苯及甲苯等杂质，蒸馏。将初馏分50ml24
及残馏分100ml弃去，主馏分中加入硝酸银8克，并加热使溶解，溶解后再加入粒状氢氧化钾15克，回流加热一小时。此时溶液从具粘土色的AgOH悬浊液变为黑色的还原银粒凝集沉淀出来。此反应约需20—30分钟，如果黑色沉淀很早生成，即表示能被氧化的物质存在较多。将蒸馏后所得溶液再加入少量硝酸银和氢氧化钾(1:2W/W)重复上述操作直至没有黑色沉淀物生成为止，再继续加热三十分钟，蒸馏，再将粗馏分约50ml及残馏分约100ml弃去，收集得出主馏分，但主馏分中有带入微量碱和银离子的可能，将会促进乙酸氧化，故应重蒸馏一次，由此法制得的乙醇含水3—6%，在206nm处透明，200nm处有尾端吸收。
3(乙醚(CHOCH) 2525
分子量74.12，沸点34.6?，比重0.714，在水中的溶解度为8.11%，用过的乙醚常含有水及醇，如用水洗涤损失很大，可用饱和氯化钙水液洗涤。乙醇也可同时除去，再以无水氯化钙脱水干燥，重蒸馏即得。
乙醚久置于空气中，尤其是暴露在日光下，会逐渐氧化醛酸、及过氧化物，当过氧化物到达万分之几时，蒸馏时有发生爆炸的危险，过氧化物是否存在，可以用碘化钾溶液与少量乙醚共振摇生成游离碘而检出。其除去法可用稀碱、浓高锰酸钾液，亚硫酸钠液顺次洗涤，再用水洗，干燥，熏蒸馏而得。或用FeSO或10%NaHSO液振摇1—3次，用氧化钙干燥后熏43
蒸馏，贮存时，可加入少量表面洁净的铁丝或钢铜丝以防止氧化。
除去少量醇类的另一个方法为:在乙醚中加少量高锰酸酸钾粉末和1—2块(10克左右)
氢氧化钠，放置数小时后，在氢氧化钠表面如有棕色的醛综合合树脂生成时，则重复此操作直至氢氧化钠表面不产生棕色物为止，然后将乙醚倒入另一瓶内，加无水氯化钙脱水，熏蒸馏即得，如需绝对无水则将金属钠压成钠丝加入，并将瓶塞钻孔，附一氯化钙管，放置，为了减少蒸发。在氯化钙管上安装一根一端拉成毛细管经与外界相通。
4(丙酮(CHCOCH) 33
分子量58.08，沸点56.5?比重0.792、与水、醇和醚能任意混溶，为无色液体。
再生方法:丙酮中如含有多数的水时，可加食盐或面体碳酸钾等盐类，盐析成二层，分去下层盐液，将上层丙酮蒸馏，收集54—57?馏分，再用无水氯化钙脱水，干燥，熏蒸馏而得。
精制方法:
(1)一般工业用丙酮，需含有甲醇、醛和有机酸等杂质，精制时加高锰酸钾粉末或溶液，摇匀，加热回流4小时，或放置1~2天至高锰酸钾紫色都不褪色，滤除沉淀，以无水碳酸钾或氯化钙脱水干燥，重蒸馏而得。
2)如丙酮中混有少量乙醇、乙醚、氯仿等溶剂时，可加二倍量的饱和亚硫酸氢钠溶(
液振摇，使生成亚硫酸氢钠丙酮加成物再加入等量酒精，即析出结晶，过滤收集，顺次以酒精、乙醚洗涤、干燥。将结晶与少量水混合后，加入10%碳酸钠或10%盐酸使加成物分解，将滤液分级蒸馏，取丙酮之馏分，加无水氯化钙或碳酸钾脱水干燥，重蒸馏而得。
[注意]丙酮不宜用金属钠或五氧化二磷脱水。
5(氯仿(CHCl) 3
分子量119.4，沸点61.26?，比重1.488，不溶于水，易与乙醚，乙醇等混溶，在日光下易氧化分解成Cl，HCl，CO及光气(COCl)后者有毒，故应贮存于棕色瓶中，或加入222
0.5—1%乙醇，作为稳定剂，如不需要含有醇的CHCl，则可用水洗 CHCl后，以无水碳酸钾33
或氯化钙干燥后蒸馏。但应注意氯仿在稀碱水作用下易分解产生甲酸盐，在浓碱水作用下则生成碳酸盐。
再生及精制方法:医用氯仿含有1%酒精作为安定剂以防止它的分解，可用水洗去酒精，
?时馏分，贮于棕色瓶中。 再用氯化钙脱水熏蒸馏，收集61
6(乙酸乙酯(CHCOOCH) 325
分子量88.10%，沸点77.2?，比重0.898含水的乙酸乙酯在日光下会逐渐水解为醋酸和乙醇，精制时可用5%碳酸钠(或碳酸钾)溶液，饱和氯化钙溶液分别洗去醋酸和醇，再以水洗，分级蒸馏取乙酸乙酯的馏分，再经过无水氯化钙脱水干燥后重蒸馏一次，或在乙酸乙酯中加少量水(每500克加水2克)。蒸馏，水和乙醇即在第一馏分中蒸出。
7(苯(CH) 66
分子量78.11，沸点80?，比重0.879，不溶于水，可与乙醚，氯仿、丙酮等在各种比例下混溶，纯苯在5.4?时固化为结晶，常利用此性质来纯化，苯易燃，有毒。
再生方法:用稀碱水和洗涤后，氯化钙脱水，熏蒸馏。
精制方法:工来规格的苯常含有噻吩，吡啶和高沸点同系物如甲苯等，不能借蒸馏方法除去，可将苯1000ml，在室温下用浓HSO(每次30ml)振摇数次，至硫酸层呈色较浇时24
为止。再经稀NaOH，水洗至中性，氯化钙脱水，重蒸馏，收集79—81?馏分。对于甲苯等高沸点同系物，则用二次冷却结晶法除去，因苯在5.4?固化，故可冷却至0?，滤取结晶，而急杂制裁留在液体中。
8(石油醚
依沸点高低分成三种:30?—60?，60?—90?，90—120?，石油醚是石油馏分之一，主要是饱和脂肪烃的混合物，极性很低，不溶于水，不能和甲醇，乙醇等溶剂无限制地混合，易燃。
再生方法:用过的石油醚，如含有少量低分子醇、丙曹、或乙醚，可将其置于分液漏斗中用水洗涤数次，再从氯化钙脱水，重蒸馏，收集一定沸点范围内的部分，如含有少量氯仿，则在分液漏斗先用稀碱液洗涤，再用水洗数次，氯化钙脱水后重蒸馏。精制方法:工业规格的石油醚加入浓硫酸(每公斤50—100克)，振摇后放置一小时，分去下层硫酸液，其中可以溶出不饱和烃类，根据硫酸层的颜色深浅酌情用硫酸振摇萃取二、三次。上层石油醚再用5%稀碱液洗一次，然后用水洗数次，氯化钙脱水后重蒸馏，如需绝对无水，则再加金属钠或五氯化二磷脱水干燥。
9(四氯化碳(CCI) 4
分子量153.84，沸点76.7?，比重1.589，极性很低，不溶于水，工业规格的四氯化碳中常含有2—3%二硫化碳，其除去方法为:取1000ml四氯化碳加50%KOH乙醇溶液100ml，60?加热回流三十分钟，冷却后，用水洗涤，分去水层，再用少量浓硫酸振摇多次，直至硫酸不变色为止，用水洗涤，氯化钙或固体氢氧化钠脱水后，加石蜡油少许，蒸馏，可得精制品，四氯化碳不燃，有毒，吸入或与皮肤接触都能导致中毒。
[附注]氯仿和四氯化碳脱水干燥时，切忌用金属钠，否则会发生爆炸。
10(正丁醇(正—CHOH) 49
沸点117.7?，是一种具有难闻气味的液体。
精制:取三级正丁醇和CaO(每100ml+5gCaO)共蒸馏收集恒温时馏出的部分即得。
11(醋酸(CHCOOH) 3
沸点113?，冰点16.5?，比重1.06，纯的醋酸(99—100%)，在低于16.5?时可凝结成冰块固体，故纯的醋酸又称为“冰醋酸”，醋酸不易被氧化。所以需采用氧化反应的溶剂，其精制可用冰冻法，即冷却至0?—10?醋酸凝为结晶，分去液体，将结晶加热溶化，再经冷冻一次，即可得冰醋酸，乙酸能与水泡溶，溶于水时放出热量而总体积减少。
醋酸中如含有乙醇和醋等杂质，则在醋酸中加2%左右的重铬酸钾(或钠)后进行分馏。若含有少量水份时，则加适量的醋酐进行分解，收集117?—118?的馏分。
12(甲酸(CHCOOH)
甲酸是具有刺鼻溴味的无色液体，沸点100.5?，比重1.220它的腐蚀体极强，触及皮肤能导致起泡。由于沸点与水非常接近，因此不能用分馏法使水份完全除去。甲酸与水可形成共沸点混合物，在107?时馏出，其中含有77%的甲酸，无水的甲酸可由甲酸的铅盐与硫化氢作用而得。
13(环已烷(CH) 612
环已烷是无色液体，沸点80.2?，比重0.779，不溶于水而溶于有机溶剂，其性质与石油醚相似，再生时先用稀碱液洗涤，再用水洗，脱水重蒸馏，其精制方法为:将工业规格的环乙烷加浓硫酸及少量硝酸钾放置数小时后分去硫酸层，再与水洗，重蒸馏。如需要绝对无水，则要加金属钠丝脱水干燥。
[附注]关于层析用有机溶剂的精制，请参考1978年中国医学科学院药物所编著的《薄层离及其在中草物分析中的应用》P455。
(1，2-二氯乙烷 14
2020沸点83.4?折光率(nD)1.4448，比重D1.2531，无色油状液体。具芳香味，溶于4
120份水中;与水成恒沸溶液，含81.5%的1，2-二氯乙烷，沸点72?，可与乙醇，乙醚和三氯甲烷相混合。在结晶和提取时是极有用的溶剂，比常用的含氯有机溶剂更为活泼。
一般纯化乃依次用浓HSO4，稀碱溶液和水洗涤，以无水氯化钙干燥或加入五氧化二磷2
分馏即得。
15(甲酰胺
2020沸点210.5?(分解)，熔点2.5?，折光率(nD)1.4475比重(D)1.333。无色澄4明油状液体。溶于水，低级醇和乙二醇;不溶于碳氢化合物，卤代烷和硝基苯。可溶铜、铅、锌、锡、镍、钴、铁、铝和镁等的氯化物，硝酸盐以及其中某些硫酸盐。具有很高的介电常数，是一种很好的离子化的溶剂。目前市售三级纯甲酰胺含量为98.5%，常混有甲酸和甲酸铵。不能单纯用蒸馏方法分离除去，一般是将普通甲酰胺通入氨气至呈碱性，将含有的甲酸交为甲酸胺，再加入丙酮使之沉出，滤去，将滤液用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏，惧沸点105?/11毫米汞性馏分。甲酰胺不能用硫酸钙干燥，因能被溶解，溶液呈胶状。甲酰胺吸湿性很强，应注意防潮。
薄层层析(TLC)
薄层层析是将吸附剂或者支持剂(有时加入固化剂)均匀地铺在一块玻璃上，形成薄层。把欲分离的样品点在薄层上，然后用适宜的溶剂展开，使混合物得以分离的方法。由于层析在薄层上进行故而得名。
薄层层析是微量、快速的层析方法。它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。
根据分离的原理不同，薄层层析可以两类:用吸附剂铺成的薄层所进行的层析为吸附薄层层析;用纤维素粉、硅胶、硅藻土为支持剂铺成的薄层，属于分配薄层层析。
薄层层析中以吸附薄层为多用，吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。
吸附TLC?固定相为吸附剂?氧化铝、硅胶。(较多用)
TLC?,
分配TLC?固定相为液态(水)?固定相吸苷在支持剂上。
(一)吸附薄层的基本原理:
吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同，及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分离。
吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。吸附强度决定于吸附剂的吸附能力，还受被吸附成分的性质影响，与展开剂的性质有关。
1.吸附薄层层析:在硅胶薄层板上，样品中的两成分是两种结构近似的染料，在展开剂四氯化碳的作用下。在展开剂和薄层板之间不断地产生吸附、解吸，再吸附，再解吸，„„。由于对氨基偶氮苯的极性比偶氮苯的极性稍强一些，层析的结果，对氨基偶氮苯受到的吸附作用稍强于偶氮苯，从而将两者分离。
展开结束以后，会在薄层板上形成两斑点，混合物中的成分得以分离。
中药中的有效成分复杂多样，结构近似者不少。特别是对未知结构的成分分析，设计并摸索出合理的层析条件是首要任务。只有先设计出可用的层析条件，再经摸索改进，超乎想像的新武 才可能对未知或者已知成分进行成功地分离。然后才能谈得上进一步的分析研究。
要设计出合理有效的层析条件，必须熟悉薄层层析条件的选择的基本要领。下面对薄层层析条件的选择做一初步介绍。
薄层层析的三项基本构成物质是:样品组分、吸附剂、展开剂。摸索层析条件，实际上是协调上述三者的关系，寻求一种能够有效分离样品组分的配合
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及实际操作要领。很明显，一切层析都是针对分析任务，也就是围绕待分离的样品组分来进行调整适应的。可见，层析条件的选择是以样品中的各组分为中心，适当调适展开剂的吸附剂的极性来实现的。
(二)薄层层析条件的选择:基本思路是根据待分离样品组分的极性来确定吸附剂的极性(类型、活化度)和展开剂的极性(主要溶剂、调节溶剂、辅助溶剂等)。
要得到理想的薄层层析结果，首先要协调、处理好吸附剂、展开剂、及被分离成分三者之间的关系
1.吸附剂:对吸附剂的基本要求是颗粒细致、大小均匀(亦即有较大的表面积和适当的吸附活性);不能与样品组分、样品溶剂、展开剂发生化学反应;更不能与溶剂及展开剂发生溶解。(注:实际操作中，可通过选择不同的活化温度对吸附剂活性进行调节。)
最常用的吸附剂是,,,和,,,,。另外，市场上还有氧化镁、硅酸镁、碳酸镁、硅藻土、活性炭等。其中，只有活性炭是非极性吸附剂，其余均是极性吸附剂。它们对水和极性大的化合物吸附能力强。
(1)氧化铝:化学式为Al2O3，国产层析用氧化铝有碱性、中性、酸性三种，以中性氧化铝应用较广。
氧化铝的特点:
? 氧化铝为吸附力较强的极性吸附剂，它适用于中性或者碱性的亲脂性化合物的分离。通常氧化铝的吸附能力与其自身的含水量有关。含水越多，吸附活性越小，吸附能力越小。氧化铝根据其含水量多少将其活性划分为五级。
? 氧化铝的吸附能力与其自身的含水量有关
(2)硅胶:表达式为SiO2?XH2O。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性硅醇基(,Si,OH)，种极性的硅醇基能和许多化合物形成氢键而产生吸附。
特点:
?.硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。如对有机酸、挥发油、萜类、皂苷、黄酮、蒽醌、氨基酸等成分的分离适用，不能用于生物碱等碱性物质的分离。
? 硅醇基显较弱的酸性，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。
由于结构的决定作用，氧化铝的活化温度可以很高(150?,160?)，而硅胶的活化温度却不能太高(105?,110?)。一旦超过500?，硅醇基会相互脱水而失活。
? 硅胶的活化温度通常为105?,110?，不能过高。
根据样品的酸碱性和极性大小确定了吸附剂以后，正确选择展开剂也是保证层析较好的分离的重要条件。
1.展开剂:薄层层析中用来将样品展开的溶剂。
展开:用极性适当的溶剂浸润已经点了样品的薄层板一端，凭借毛细作用带动样品在薄层板上移动，最终使样品分离的操作过程。
展开剂常是由两种或者两种以上的溶剂铵一定的比例组成的溶剂系统。简称溶剂系统或展开所用的溶剂。
“展开剂”,“溶剂系统”,“溶剂”;“展开”,“展开过程”
在吸附薄层中，化合物在吸附薄层上移动的速度与展开剂的极性有关。展开剂的极性越大，化合物移动的速度越快，展开剂的极性越小，化合物的移动速度慢。
众所周知，普通高中要出较好的高考录取升学率，一要有良好的教学条件，二要有有经验的任课老师，三要能招来基础好的实践初中生。同理，薄层层析要得到较好的展开效果，必须依据所要分离的样品来正确选择层析条件，对样品的极性进行认真研究，以确定及实验摸索适宜的吸附剂、展开剂。
2.被分离成分:分析任务所要完成分离的样品中的有效成分。
被分离成分的极性决定于其母核结构类型及官能团极性。如果吸附剂活性和展开剂活性固定不变的条件下，被分离成分的极性越大，吸附剂对其作用越强，展开距离越短;被分离成分极性越弱，吸附剂对其作用越大，展开距离越大。
一些基团的极性相对大小顺序已经在课本P31列出。当然，具体物质的极性大小判断时，还要结合分子结构的具体情况进行判断。
总之，选择层析条件时，必须针样品中对被分离成分的极性，试行判断或确定吸附剂种类和活性，再探索配制展开剂。
在选择层析条件时，必须根据样品、展开剂、被分离物质三方面缩合考虑。
历史上吸附层析出现最早，是由俄国生物学家茨维特用碳酸钙作为固定相，石油醚作为流动相来分离植物色素的。除了吸附层析之外，另一经典的层析法是以液体作为固定相的液
相层析。液体固定相(多为水)被吸苷在固态载体物质上，这些载体物质多是一种多孔性物质。这些液态固定相被载体固定在柱中，就成为液,液分配柱层析。
(三)分配薄层层析:用极性溶剂吸苷在固体支持剂上所形成的混合物，铺成薄层(或装柱)，然后活化、点样(或上样)，再用极性较弱的展开剂(或洗脱剂)进行展开。
分配层析的一般原理:在展开过程中，各成分在固定相和流动相之间作连续不断的分配，由于各成分在两相间的分配系数不同，因而可以达到相互分离的目的。
以CS表示某成分在固定相中的浓度，Cm表示某成分在固定相中的浓度。则
分配系数 K,CS/Cm
载体应该具备的基本条件:中性、多孔粉末、无吸附活性、在洗脱剂之中不溶解;所能够吸收固定相的量，最好能达载体本身重量的50%以上;能使流动相自由的通过载体所吸收的固定相，并且不改变溶剂系统的组成。能够满足这些条件的载体是硅胶、硅藻土、纤维素粉等。
分配层析所用的固定相一般为水及各种水溶液(酸、碱、盐与缓冲液)、甲酰胺、低级醇(亲水性)等。
分配层析所用的流动相选用与水不溶(或微溶)的有机溶剂。如石油醚、苯、卤代烷类、脂类、酮类(如丁酮)、醇类(丁醇、戊醇)等或者它们的混合物。
分配层析对混合物中各成分的分离，主要决定于各成分分配系数的差异，一般说来，对于种类成分均能适用，特别能适用于水溶性、亲水性物质而又稍能溶于有机溶剂中者。这样就恰好弥补了一般吸附层析(如氧化铝吸附层析适用于亲脂性物质)的不足。但是，由于分配柱层析样品处理量较少，因此，如能用吸附柱层析解决问题时，常优先使用氧化铝或硅胶吸附柱层析。
一般分配层析的条件可以由PC来摸索，再应用于分配柱层析。
(四) 薄层的制备:
1(基板的规格和构成:5?15?、5?20?、10?10?、20?20?大小的玻璃板或者不锈钢板、塑料板。
2(薄层板的分类:软板(制板时不加粘合剂)、硬板(制板时加入粘合剂)。
3(软板的制备:详见P32。
4(硬板的制备:详细演示、介绍手工铺板，了解薄层涂铺器的使用方法。
(五) 薄层层析的操作步骤:
1(点样:
? 样品的溶解:将样品溶于展开剂极性相近、挥发性高的有机溶剂。
? 薄层点样:用毛细管(0.5mm以下)或用专业点样器进行点样。
点样的要求:样点位置应在距离底边1-1.5cm处;点样量适当;样点直径小于2-3mm;间隔反复点样;多个样点时，间隔为2cm且处于同一条直线上。
经验做法:可先在PC或TLC点上不同量的样品，并展开、显色后观察分离情况，以此确定最佳样品用量。
2(展开:当样点上的溶剂充分挥干后，将薄层放置在密闭容器中，使适当的展开剂从薄层的一端向另一端进行浸润展开的过程。
要求:密闭容器可选用层析缸、标本缸、标本筒等;展开方式有上行法、下行法之分，展开方向有单向、双向、多次展开等。详见P33。
注意事项:先悬空饱和、再入液展开;样点不能泡在展开剂中;薄层浸入时不能歪斜进入。
3(显色:用适当的方法或者适当的显色剂处理薄层，使其上可能已经分离的各成分斑点显示出来，以方便计算各个斑点的比移值，从而提供定性与定量的依据。
显色的基本步骤是:一看、二照、三碘、四显，荧光背景也常见。详见P34。
4(比移值的计算与定性、定量:展开结束后，经过各种显色操作后，样品中各个成分的斑点可能出现了不同程度的分离，为了表达各成分的相对位置(极性)通常以比移值作为称量斑点位置的指标。比移值的符号为Rf:
Rf,(斑点中心与原始样点之间的距离)/(溶剂前沿与原始样点之间的距离)
注意事项:薄层层析的Rf 值受多种因素影响，即使严格按照实验要求做了，结果的重现性仍较差。因此，薄层定性时常与标准品一起点样进行对比分析。
5(练习:在黑板上随机画几个层析展开模拟图，考查学生对Rf值的理解和计算能力。
浙公网安备 33021202002483