过氧化氢的测定方法
三、过氧化氢酶的活性----紫外吸收法
[原理] H202在240nm波长下有强吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 [仪器与用具] 紫外分光光度计;离心机;研钵;容量瓶250ml1个;刻度吸管0.5ml2支;2ml1支;10ml试管3支;恒温水浴锅。
[试剂] 0.2mol?L-1pH7(8磷酸缓冲液(内含1,聚乙烯吡咯烷酮);0(1mol?L-1H202(用0(1mol?L-1高锰酸钾标定)。
[方法]
1(酶液提取 称取新鲜小麦叶片或其他植物组织0(5g,置研钵中,加入2-3ml 4?下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入25ml容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度。混合均匀,将量瓶置5?冰箱中静置10min,取上部澄清液在4000r.min-1下离心15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液,5?下保存备用。 2(测定 取10ml试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管,按
表
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42-2顺序加入试剂。 25?预热后,逐管加入0.3ml0.1mol的H2O2,每加完1管立即记时,并迅速倒入石英比色杯,240nm下测定吸光度,每隔1min读数1次,共测4min,待3支管全部测定完后,按式42-3计算酶活性。
3(结果计算 以1min内A240减少0(1的酶量为1个酶活单位(u)。
过氧化氢酶的活性(u.g-1min-1)=
式中 Aso--加入煮死酶液的对照管吸光值;
As1,As2-样品管吸光值;
Vt--粗酶提取液总体积(ml);
V1--测定用粗酶液体积(ml);
FW--样品鲜重(g); 0(1-A20每下降0(1为1个酶活单位(u);
t-加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。
注意:凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。
【思考
题
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】
1、影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?
2、过氧化氢酶与哪些生化过程有关?
参考文献 【1】Mukherjee S P,Choudhuri M A.Determination of glycoalte oxidase activety
H2O2 content and catalase activity.Physiol Plant.1983(58):167-170
【2】蒋明义,郭绍刚,渗透胁迫下稻苗铁催化的膜脂过氧化作用.植物生理学报.1996.22(1):6-12
【3】林植芳,李双顺等.衰老叶片和叶绿体中H2O2的积累与膜脂过氧化的关系,植物生理学报.1998,14(1):16-22
【4】邹琦.植物生理生化实验指导.北京:中国农业出版社,1995 【5】【美】吉尔鲍特GG.缪辉南,陈石根等译.酶法分析
手册
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.上海:上海科学技术出版社,1982
实验材料:小白菜
注意事项:
1、 三角瓶、容量瓶等务必要清洗干净。
2、 研磨时CaCO3不要加得太多,大半匙即可,且要洒均匀。
3、 过滤时不必全部过滤完,有20ml滤液即可。
4、 把握好实验进度,不拖延时间,以免酶液失活。
5、 滴定时速度不要过快,以免过量(最快不要超过1秒/滴)。最佳终点为最后半滴加入后蓝色消失。
6、 每次滴定起点一致,都从零开始。
7、 左手操纵活塞,右手摇三角瓶,溶液要摇成漩涡状。
8、为了保证实验的平行性,四个三角瓶里所加的试剂应该来自同组药品,中途不要试剂瓶(使用别组药品)。
结果分析:
但本实验的不确定因素很多,比如气温高低、样品差异、试剂新旧,因此较难达到老师的水平。
结果偏低的主要原因:1、实验时间过长,酶液失活;2、器皿未洗干净,残存酸或碱,酶活性下降;3、样品滴定过量。
结果偏高的主要原因:1、空白样滴定过量。
小知识:
1、 加入过氧化氢之前为什么要保温平衡,
答:为了使三角瓶中的溶液温度达到过氧化氢酶的最适酶促反应温度。过氧化氢酶的酶促反应最适温度为20,25?,受实验室条件限制,如果室温在这个范围内则不进行水浴,在空气中保温。
2、 为什么有个别组在加入KI溶液后有黑色沉淀出现,
答:因为KI溶液放置时间过长易被空气中的氧气所氧化,出现单质I2,这样再加上被过氧化氢所氧化而得的I2,就可能在三角瓶中出现单质I2过饱和,从而析出变成沉淀。遇到这种情况应该更换KI溶液重做。
3、为什么不能用NaOH代替H2SO4终止酶活性,
答:H2SO4除了利用强酸性终止酶活外还参与氧化还原反应,参与KI生成I2的氧化还原反应; NaOH虽然有强碱性可以终止酶活,但不能参这个反应,这样无法测出过氧化氢的量。 【转帖】过氧化氢酶活性的测定方法
过氧化氢酶
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:pH值范围4-9,而以7.0,37?最适。冷冻、冻干、阳光、氧气降酶活。用Beers&Sizers法(改进型)测定。见[德]B 施特尔马赫著,钱嘉渊译 酶的测定方法 p186-188。 1.试剂:
(1)1N氢氧化钠溶液:称2g,用蒸馏水定容至50ml。
(2)磷酸盐缓冲液(pH7.0):取0.68g磷酸二氢钾,溶于75ml蒸馏水,用1N氢氧化钠溶液将pH调至7.0,定容至100ml。
(3)底物溶液:现配。用磷酸盐缓冲液把0.6ml过氧化氢(30,的H2O2)稀释至100ml。 (4)酶液浓度应为5-20u/ml。
2.操作:
用移液管将1.0ml底物溶液和1.9ml蒸馏水滴入一只1厘米比色皿,并调水温至25?。为检查在不加酶的情况下吸光度是否也降低,在240nm处以蒸馏水为参比测定吸光度,若吸光度的降低幅度超过0.01,则在计算主值时须减去此值。取另一比色皿,加入上述溶液,并加0.10酶溶液,在240nm处以蒸馏水为参比在连续5分钟内测定吸光度(每隔1分钟读取一次结果,直至每分钟吸光度的降低值达到稳定为止)。
3.计算:在上述条件下,每分钟酶促分解1umol过氧化氢的酶量定为1个酶活力单位。 U/mg = E240×3 / 0.0436×Ew
式中:E240—240nm处每分钟内吸光度的降低值
Ew—每0.10ml所用酶液中含酶的重量(mg)
0.0436—240nm处1umol过氧化氢的吸光度
3—反应混合液的总体积。
5] 波钦诺克 X H 著.植物生物化学分析方法.荆家海,丁钏荣译.北京:科学出版社,1981.205,207
参考文献
【1】Mukherjee S P,Choudhuri M A.Determination of glycoalte oxidase activety H2O2
content and catalase activity.Physiol Plant.1983(58):167-170
【2】蒋明义,郭绍刚,渗透胁迫下稻苗铁催化的膜脂过氧化作用.植物生理学报.1996.22(1):6-12
【3】林植芳,李双顺等.衰老叶片和叶绿体中H2O2的积累与膜脂过氧化的关系,植物生理学报.1998,14(1):16-22
【4】邹琦.植物生理生化实验指导.北京:中国农业出版社,1995
【5】【美】吉尔鲍特GG.缪辉南,陈石根等译.酶法分析手册.上海:上海科学技术出版社,1982
三、过氧化氢酶的活性----紫外吸收法
[原理]
H2O2在240nm波长下有强吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 [仪器与用具]
紫外分光光度计;离心机;研钵;容量瓶250ml1个;刻度吸管0.5ml2支;2ml1支;10ml试管3支;恒温水浴锅。
[试剂]
0.2mol?L-1pH7(8磷酸缓冲液(内含1,聚乙烯吡咯烷酮);
0(1mol?L-1H2O2(用0(1mol?L-1高锰酸钾标定)。
[方法]
1(酶液提取 称取新鲜小麦叶片或其他植物组织0(5g,置研钵中,加入2—3ml 4?下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入25ml容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度。混合均匀,将量瓶置5?冰箱中静置10min,取上部澄清液在4000r.min-1下离心15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液,5?下保存备用。
2(测定 取10ml试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管,按表42—2顺序
加入试剂。
表 42-2 紫外吸收传测H2O2样品测定液配制表
管 号 S1 S2 S3
粗酶液(mI)
PH7.8磷酸(ml)
蒸馏水(ml)
0.2 0.2 0.2
1.5 1.5 1.5
1.0 1.0 1.0
25?预热后,逐管加入0.3ml0.1mol的H2O2,每加完1管立即记时,并迅速倒入石英比
色杯,240nm下测定吸光度,每隔1min读数1次,共测4min,待3支管全部测定完后,按式
42-3计算酶活性。
3(结果计算 以1min内A240减少0(1的酶量为1个酶活单位(u)。
过氧化氢酶的活性(u.g-1min-1)= (42-3)
式中
Aso——加入煮死酶液的对照管吸光值;
As1,As2—样品管吸光值;
Vt——粗酶提取液总体积(ml)
V1——测定用粗酶液体积(ml)
FW——样品鲜重(g)
0(1—A20每下降0(1为1个酶活单位(u)
t—加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。
[注意]
凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。