医药学-微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新

医药学-微生物次级代谢产物生物合成基因簇与药物创新 作者：白林泉 邓子新 【关键词】 ,微生物次级代谢产物；,,生物合成基因簇；,,药物创新；,,组合生物合成；,, 代谢工程 摘要： 微生物产生众多结构和生物活性多样的次级代谢产物，其生物合成基因簇的克 隆是药物创新和产量提高的必要前提。迄今为止已有超过150种生物合成基因簇通过各种方式被克隆，并被用于组合生物合成、体外糖类随机化、代谢工程的定向改造。我们研究室已 经克隆并测定了氨基糖苷类井冈霉素/有效霉素、多烯类抗生素FR008/克念菌素、聚醚类南昌霉素、聚酮类梅岭霉素、杂合聚酮多肽类口恶唑霉素等生物合成基因簇。深入的基因功能 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 揭示了他们独特的生物合成途径和调节机理，为正在进行的组合生物合成结构改造和代 谢工程产量提高奠定了基础。 关键词： 微生物次级代谢产物； 生物合成基因簇； 药物创新； 组合生物合成； 代 谢工程 Secondary metabolic pathway genes and new drug discovery ABSTRACT Microorganisms produce myriads of secondary metabolites with both structural and functional diversities. The cloning of corresponding biosynthetic gene clusters is essential for new drug discovery and yield improvement by metabolic engineering. To date, more than 150 biosynthetic gene clusters had been cloned via different strategies, which are subsequently manipulated through combinatorial biosynthesis, in vitro glycorandomization, or other biotechnological methods. In our laboratory, several biosynthetic gene clusters have been cloned and sequenced, representatives of which are responsible for the biosyntheses of the aminoglycoside jinggangmycin/validamycin, polyene antibiotic FR008/candicidin, polyether nanchangmycin, polyketide meilingmycin, PKSNRPS oxazomycin and others. Extensive analyses of gene functions, their unique biosynthetic pathways and regulatory mechanisms have now paved the way for more rational structural modifications through combinatorial biosynthesis and yield improvements using metabolic engineering. KEY WORDS Microbial secondary metabolites; Biosynthetic gene cluster; New drug discovery; Combinatorial biosynthesis; Metabolic engineering 微生物产生的次级代谢产物在化学结构和生物活性方面多种多样，主要的产生菌类群包 括放线菌、芽孢杆菌、粘细菌、假单胞菌、蓝细菌、真菌等，其中已知抗生素的三分之二以 上是以链霉菌为代表的放线菌产生的。根据结构特点可以基本上将抗生素分为β内酰胺、氨 基糖苷、核苷、四环素、多肽、糖肽、大环内酯、安莎、聚醚和类萜等种类。以上多种多样 抗生素的结构特点也决定了它们生物活性的多样性，除了可以抑菌杀菌外，还可以作为抗癌 药、抗寄生虫药、除草剂、酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂、低血胆固醇治疗剂等等， 在医疗、工业、农牧渔业和环境保护等领域均发挥着重要作用。随着大量微生物次级代谢产 物的分离，从自然界直接分离具有新结构、新活性化合物变得越来越困难，已知结构化合物 分离的重复性很高。另一方面，临床上病原微生物的耐药性日益严重，伴随着多耐药性、高 耐药性病原菌以及艾滋病、SARS、禽流感等新型疾病不断出现，如何利用已有资源，定向创 造新结构、新活性化合物以及提高微生物次级代谢产物的产量，成为当务之急。分子生物学 基础上的组合生物合成(combinatorial biosynthesis)［1］和代谢工程(metabolic engineering)［2］成为解决上述问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 的重要手段，但是次级代谢产物生物合成基因(簇)的克 隆与功能鉴定是这两项技术实施的必要前提。 1 微生物次级代谢产物生物合成基因簇特点及总体研究进展 1.1 微生物次级代谢产物生物合成基因簇的组成特点自从Malpartida等1984年克隆了 放线紫红素的全部生物合成基因［3］，以及随后克隆的榴菌素［4］、红霉素［5，6］、泰乐星等生物合成基因，揭示了微生物次级代谢产物生物合成基因成簇排列的特征，即与特定产物 合成相关的结构基因、调节基因、耐药性基因和转运蛋白等集中位于染色体的一段连续区域。 除此之外，微生物次级代谢产物生物合成基因簇还具有以下几个特点：?生物合成基因一般 形成几个不同的转录单位；?通常含有一个以上的耐药性基因，且耐药性基因和结构基因表 达之间有一定的相互调节；?绝大多数基因表达的调控发生在转录水平，除了受特异的途径 专一性调节因子调控外，还受到同时影响胞内其他产物合成甚至细胞分化的全局性调节因子 的调控［7］。微生物次级代谢产物生物合成基因的成簇排列特征为相应生物合成基因的克隆 提供了方便，也就是说，几乎任何一个结构基因、耐药性基因、转运蛋白基因或途径专一性 调节基因的克隆都有可能导致整个生物合成基因簇的获得。 1.2 微生物次级代谢产物生物合成基因簇的克隆情况根据微生物次级代谢产物生物合 成基因簇的上述特点，大量的生物合成基因簇从不同的微生物种群中克隆出来，其中主要的 克隆 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 有突变株回补(如放线紫红素［3］)、利用同源性较高的异源DNA作为探针的杂交法(如榴菌素［4］)、耐药性基因的克隆(如红霉素［5］)、从蛋白质分离到反推编码DNA的反向遗传(如利福霉素［8］)、根据同源蛋白保守区 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的兼并性引物扩增法(如阿卡波糖［9］)以及整个生物合成基因簇的异源表达(如肠球菌素［10］)等。通过上述克隆方法，迄今为止 已经克隆了超过150种微生物次级代谢产物的生物合成基因簇，一方面进一步证明了微生物 次级代谢产物成簇排列的特点，另一方面也揭示了结构上不同的代谢产物在编码基因上的相 关性，例如β内酰胺类、多肽类、糖肽类都主要由非核糖体肽合酶(nonribosomal peptide synthase，NRPS)［11］负责合成，四环素类、大环内酯类、安莎类、聚醚类则由I型或II型聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)［1］合成。因此根据编码基因种类的不同，所有已 克隆的生物合成基因簇可以按表1中所列的类别来归类。 1.3 次级代谢产物生物合成基因簇资源的定向利用如此众多生物合成基因簇的克隆为 微生物次级代谢产物的比较研究打下了坚实的基础。1985年Hopwood等将放线紫红素的生物合成基因转入榴菌素和麦德霉素产生菌获得杂合抗生素［12］，标志着微生物次级代谢产物组 合生物合成技术的诞生，即通过将不同次级代谢产物合成基因在微生物间的相互交换产生非 天然的基因组合，从而人为定向设计具有新结构的次级代谢产物的遗传操作过程。迄今为止， 组合生物合成的理论基础和技术储备已经相当丰富，并且产生了数百种非天然的“天然产物” (nonnatural natural product)。2001年Thorson教授首先提出了将化学合成和酶催化进行 有机结合的体外糖类随机化(in vitro glycorandomization，IVG)［13］的新概念，即把通过化学方法高效合成的多种自由糖基，在定向进化产生的具有底物识别广谱性糖基激酶、核 苷转移酶和糖基转移酶的级联催化下，在体外转移到多种糖基受体，从而大量产生多种新结 构、新活性衍生物的过程。他们利用万古霉素的糖基转移酶GtfE和许多非天然的NDP糖基供体一次性获得了32种携带有不同糖基的万古霉素衍生物，充分显示了该项技术的高效性和巨 大潜力。微生物次级代谢产物完整生物合成基因簇的克隆和功能分析使得生物合成途径及生 物合成调控机理的阐明成为可能，从而揭示生物合成途径的限速步骤和调控节点，并进行相 应的遗传操作来显著提高次级代谢产物的产量或提高活性组分的比例、降低消除低活性组分 的含量。因此在基因簇克隆和遗传分析基础上的代谢工程研究也变得目的性更强、效率更高。 例如，Malmberg等在利用棒状链霉菌研究头霉素C的生物合成过程中发现，控制从初级代谢 产物赖氨酸向头霉素前体α氨基己二酸转化的赖氨酸ε氨基转移酶(LAT)是头霉素C生物合成的限速酶，额外拷贝LAT向棒状链霉菌的引入致使头孢霉素C的产量提高了2～5倍［14］。 2 上海交通大学分子微生物学实验室的研究进展 我们实验室长期从事重要的农业、饲养业抗生素生物合成的研究，包括抗水稻纹枯病的 井冈霉素和5102I号素、抗稻瘟病的庆丰霉素、抗玉米小斑病的5102II号素和静丝霉素、 广 谱抗真菌多抗霉素、 抗鸡球虫病的南昌霉素、广谱杀虫活性的梅岭霉素等。近年来我们也在 抗真菌抗生素FR008/克念菌素、抗肿瘤和HIV口恶唑霉素、抗肿瘤安丝霉素的生物合成方面 进行了深入研究。 表1 已克隆的微生物次级代谢产物生物合成基因簇（略） 2.1 井冈霉素/5102I的生物合成氨基糖苷类井冈霉素是由吸水链霉菌井冈变种5008产生的重要农用抗生素，是我国乃至东南亚防治水稻纹枯病的重要药物，年产量已经超过4万吨。井冈霉素和有效霉素(validamycin)的结构一致，即结合有一分子葡萄糖基的井冈胺/有效氧胺(validoxylamine)。井冈霉素的大面积使用使提高其产量(尤其是活性组分A组分的含量)，降低生产成本具有重要的意义。井冈霉素也是生产临床上重要的治疗糖尿病药物伏格列 波糖(vogliobose)和阿卡波糖的重要前体，其产量的提高和特异合成中间体的积累将显著降 低生产成本或简化生产 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 。井冈霉素和阿卡波糖同属于C7N氨基环醇类次级代谢产物，前 期的化学喂养实验证实由7磷酸景天庚酮糖环化而成的2表5表有效醇酮是两者生物合成途 径中共同的前体物，因此推断催化该步反应的环化酶基因应该有较高同源性［15］。利用来自于游动放线菌SE50/110阿卡波糖生物合成基因簇的环化酶基因acbC为异源探针，我们在井冈变种5008的基因文库中钓取了覆盖约70kb染色体区域的阳性克隆，随后该区域内30kb大片段的缺失导致突变株丧失了合成井冈霉素的能力，直接证明了该区域同井冈霉素的生物 合成直接相关［16］。对acbC同源环化酶基因valA两侧45kb区域的序列测定揭示了27个开放阅读框(open reading frame,ORF)(白林泉等，待发表)，其中包括16个结构基因，2个调节基因，1个转运蛋白基因，3个与转座有关的基因，1个抗碲基因和其他4个未知基因(图1)。通过基因的逐个敲除与回补我们确定了与井冈霉素A组分合成直接相关的8个结构基因(valA, B,C,K,L,M,N,G)，而且这8个基因重新组装后在变铅青链霉菌1326中的异源表达也产生了井冈胺A和井冈霉素A。同时我们正在通过异源表达各个相关合成酶并进行相关的体 外催化活性分析。一方面直接证明了环化酶ValA能够环化7磷酸景天庚酮糖生成2表5表有效醇酮，另一方面糖基转移酶ValG催化一分子的葡萄糖转移到井冈胺上从而生成最终产物井 冈霉素A，而且UDP葡萄糖是最佳的糖基供体。而对激酶ValC的体外催化分析发现井冈霉素 生物合成的中间产物有效烯酮和有效酮为最适底物， 明显不同于阿卡泊糖生物合成基因簇种 的同源蛋白AcbM的功能，AcbM催化2表5表有效醇酮的磷酸化(章亦荣等，待发表)。井冈霉素生物合成基因簇的克隆、序列测定和初步功能分析为其生物合成途径的最终阐明奠定了 基础，同时调节基因和转运蛋白编码基因的发现也为井冈霉素产量的提高提供了最理想的改 造靶点。另外初步分析显示，8个必需基因之外的其他结构基因很可能与井冈霉素其他组分 的合成相关，因此这些基因功能的阐明有利于消除各种次级组分的积累、显著提高活性组分 井冈霉素A的积累。最近我们在吸水链霉菌应城变种1022中克隆和测定了5102I号素的生物合成基因簇。与井冈霉素生物合成基因簇相比，5102I号素的生物合成基因簇中结构基因的 排列发生了很大变化，而且也缺少相应的调节基因，这可能是5102I号素产量很低的原因(蹇晓红等，待发表)。两个相似抗生素生物合成基因簇的克隆为该类次级代谢产物的比较研究和 定向改造提供了良好素材。实现井冈霉素在水稻等植物中的表达、直接抵抗水稻纹枯病等真 菌病害的侵染也是本项研究的目标之一，相关工作正在开展,跨学科的合作研究也在酝酿之中。 图1 井冈霉素/有效霉素的生物合成基因簇（略） 2.2 抗生素FR008/克念菌素的生物合成38元七烯大环内酯类聚酮化合物抗生素FR008是由链霉菌FR008产生的，结构上同克念菌素(candicidin)一致，具有抗真菌和杀灭蚊子幼 虫的活性，临床上多用于念球菌阴道炎的治疗，还可通过降低胆固醇，减轻前列腺增生症。 因为抗生素FR008结构中带有来自于对氨基苯甲酸的对氨基苯乙酮成色基团，所以我们利用 来自于克念菌素产生菌灰色链霉菌的对氨基苯甲酸合成酶为异源探针，在国际上首次克隆了 多烯类聚酮化合物的生物合成基因簇，即抗生素FR008的生物合成基因簇，并通过基因中断 实验证实该区域跨越150kb以上［17］。最终对总共1498kb区域的序列测定揭示了21个可能的相关基因(图2)［18］，其中有6个基因编码巨大的成模块组织(modular)的聚酮合酶fscAF，共编码21个模块，这与抗生素FR008骨架合成所需的21步缩合反应是非常一致的，而且在 结构域水平上揭示了七烯共轭结构形成了分子基础。基因簇序列分析还发现了与起始单位对 氨基苯甲酸合成相关的基因(pabAB和pabC)、与海藻糖胺(mycosamine)糖基合成相关的基因(fscMII和fscMIII)、与糖基化和羧化等后修饰反应相关的基因(fscMI、fscP和fscO)。同时还发现了四个调节基因和两个转运蛋白，有利于提高抗生素FR008的产量。根据对抗生素FR008生物合成基因簇的生物信息学分析，我们提出了抗生素FR008复合物中四种主要组分的分子转换模式［18］，最新的研究成果表明这种推断是正确的，而且获得了只积累主要活性 组分II号组分的工程菌株(周永军等，待发表)。通过对糖基转移酶基因的失活获得了一系列 缺失了糖基的新衍生物，并可以初步推断出糖基的转移发生在羧化反应之后，是后修饰反应 的最后一步。而对海藻糖胺合成相关的转氨酶基因fscMII的敲除获得了糖基上缺少氨基的一 系列衍生物，显示了糖基转移酶FscMI相对的底物广谱性。 作者：白林泉 邓子新 图2 抗生素FR008/克念菌素的生物合成基因簇（略） 2.3 南昌霉素的生物合成酸性脂溶性聚醚抗生素南昌霉素由南昌链霉菌产生，是钠离子 载体，具有很强的抗鸡球虫病活性，而且安全无毒。产量低是限制南昌霉素推广使用的主要 因素，因此需要克隆其生物合成基因簇，寻找生物合成途径的限速步骤、调节基因或转运蛋 白基因，通过定向的遗传改良从根本上提高其产量。由于聚醚骨架的生物合成遵循I型聚酮合酶的催化机制，因此我们利用红霉素生物合成基因簇的PKS结构域为异源探针在南昌链霉 菌的基因文库中钓取了90个阳性克隆，并且经过染色体步移归为8个独立的重叠群(contig AH)，暗示该菌株可能编码至少8个聚酮生物合成基因簇［19］，这与天蓝色链霉菌［20］和除虫链霉菌［21］的基因组全序列测定揭示的链霉菌的基因组复杂性是一致的。进一步的大 片段缺失实验确定了重叠群A负责南昌霉素的生物合成，在此基础上的1325kb区域的序列测定发现了30个ORF(图3)［22］， 其中与聚酮链合成相关的基因有11个(nanA1A11)，编码14个模块74个结构域，而且nanA1A6可能形成一个长达564kb的转录单位。很特别的是nan9编码的模块13中只含有酮基还原酶KR和酰基转移酶AT结构域，而缺少酰基载体蛋白ACP结构域，不过下游的nan10则编码一个独立的ACP，因此两者可能是协同作用的。在南昌霉 素生物合成基因簇中并没有发现在其他聚酮生物合成基因簇中负责聚酮链释放的硫酯酶TE结构域或基因，但是初步的生物信息学分析显示在最后一个延伸模块(模块14)的末端有一个与酯酶同源的结构域CR，很可能通过一种不同的释放机制来释放线性的聚酮链，相关的研究 正在进行之中。聚醚类次级代谢产物在聚酮链形成后要经过一系列氧化、异构等级联反应机 制形成聚醚结构，在南昌霉素生物合成基因簇中异构酶NanI、环氧化酶NanO和环氧化物水解酶NanE很可能在聚酮链还没有从聚酮合成酶上释放之前催化聚醚结构的形成。另外，南昌 霉素的生物合成途径还包括羟化、糖基化过程，相应的羟化酶基因nanP和糖基转移酶基因nanG5也在基因簇中找到，而且负责糖基4Omethylrhodinose生物合成的所有基因也在基因 簇中存在。在南昌霉素生物合成基因簇中存在7个调节基因和2个转运蛋白编码基因，暗示 南昌霉素的生物合成具有复杂的调控机制，并很可能是导致南昌霉素产量较低的主要原因。 对相应调节基因功能的阐明以及在此基础上的遗传操作将会成为产量提高的突破口。另外整 个基因组中8个聚酮生物合成基因簇的存在也显示了对共同前体乙酰辅酶A和丙酰辅酶A的竞争，因此其他聚酮生物合成基因簇的敲除应该会导致南昌霉素的产量提高。对重叠群C的缺失的确导致了南昌霉素产量的明显提高(孙宇晖等，待发表)。 图3 南昌霉素生物合成基因簇（略） 2.4 梅岭霉素的生物合成南昌链霉菌同时产生梅岭霉素，它是一种与avermectin骨架结构相似的16元大环内酯抗生素(图4)，具有甚至比avermectin还要强的抗寄生虫活性。 除了缺少齐墩果糖侧链外，梅岭霉素的主要组分还缺少C5位的甲基化，不过梅岭霉素在C4 位上携带有3甲基2烯丁酸侧链。与avermectin结构和生物活性上的异同点为我们定向改造 梅岭霉素或avermectin提供了切入点，如次级组分的消除、依维菌素的直接产生等等。根据 avermectin生物合成基因簇的细胞色素P450羟化酶基因aveE、酮基还原酶基因aveF和硫酯 酶结构域基因aveTE保守序列设计同源引物，分别在南昌链霉菌中扩增出了相应基因片段， 测序后发现相互间的核酸同源性分别为706%、659%和757%。利用上述扩增片段为探针进行的杂交初步显示重叠群H负责梅岭霉素的生物合成，在该区域的大片段缺失则导致了梅岭霉素 产生能力的彻底丧失［23］。最近完成的该基因簇部分区域的序列测定结构显示，梅岭霉素和 avermectin在PKS区域的基因排列、模块组织形式、调节基因等有着高度的相似性，同时也 揭示了两者结构差异的分子基础，为进一步的定向改造指明了方向(刘天罡等，待发表)。 2.5 其他微生物次级代谢产物生物合成基因的克隆实验室已经克隆的微生物次级代谢 产物生物合成基因簇还有抗肿瘤抗生素口恶唑霉素的生物合成基因簇，它是由白色链霉菌产 生的一种聚酮多肽复合物，很可能以口恶唑环作为合成的起始单位(图5)。根据结构推测，口恶唑霉素合成中的未知延伸单位(unknown extender unit)可能来自于甲氧基丙二酸单酰ACP(methoxymalonylACP)。 根据该延伸单位合成基因的保守性设计，设计兼并性引物在白色 链霉菌中扩增出同源片段，进一步的基因敲除实验证实该段序列的确参与口恶唑霉素的生物 合成(赵春华等，待发表)。利用该段DNA为探针也在白色链霉菌基因文库中钓到了覆盖135kb 区域的阳性克隆，相关的序列测定和功能分析正在进行之中。其他正在克隆的生物合成基因 簇有广谱抗真菌的多抗菌素、抗稻瘟病庆丰霉素、5102II号素等等。 图4 梅岭霉素与avermectin的结构比较及avermectin的生物合成基因簇（略） 3 小结 多种微生物次级代谢产物生物合成途径的克隆、序列测定、基因功能分析和组合生物合 成探索，使我们初步构建了微生物次级代谢产物基因工程操作平台。一方面生物合成途径和 调控机理的阐明为提高次级代谢产物的产量、定向提高活性组分成为可能，另一方面大量基 因资源、遗传操作体系、基因操作原理、产物分离系统的积累与优化，为在研次级代谢产物 的进一步结构和活性的组合生物合成改造铺平了道路。本基因操作平台的构建也形成了一个 开放体系，可以为接纳并程序化其他次级代谢产物的研究与创新，并且为其他微生物次级代 谢产物研究单位提供经验和支持。 图5 口恶唑霉素（略） 参考文献 ［1］ Hopwood D A. Genetic contributions to understanding polyketide synthases ［J］. Chem Rev,1997,97(7):2465 ［2］ Bailey J E, Birnbaum S, Galazzo J L, et al. Strategies and challenges in metabolic engineering ［J］. Ann NY Acad Sci,1990,589:1 ［3］ Malpartida F, Hopwood D A. Molecular cloning of the whole biosynthetic pathway of a Streptomyces antibiotic and its expression in a heterologous host ［J］. Nature,1984,309(5967):462 ［4］ Malpartida F, Hallam S E, Kieser H M, et al. Homology between Streptomyces genes coding for synthesis of different polyketides used to clone antibiotic biosynthetic genes ［J］. Nature,1987,325(6107):818 ［5］ Cortes J, Haydock S F, Roberts G A, et al. An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycinproducing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea ［J］. Nature,1990,348(6297):176 ［6］ Donadio S, Staver M J, McAlpine J B, et al. Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis ［J］. Science,1991,252(5006):675 ［7］ Chater K F. The improving prospects for yield increase by genetic engineering in antibioticproducing Streptomycetes ［J］. Biotechnology (N Y),1990,8(2):115 ［8］ Kim C G, Yu T W, Fryhle C B, et al. 3Amino5hydroxybenzoic acid synthase, the terminal enzyme in the formation of the precursor of mC7N units in rifamycin and related antibiotics ［J］. J Biol Chem,1998,273(11):6030 ［9］ Stratmann A, Mahmud T, Lee S, et al. The AcbC protein from Actinoplanes species is a C7cyclitol synthase related to 3dehydroquinate synthases and is involved in the biosynthesis of the alphaglucosidase inhibitor acarbose ［J］. J Biol Chem,1999,274(16):10889 ［10］ Piel J, Hertweck C, Shipley P R, et al. Cloning, sequencing and analysis of the enterocin biosynthesis gene cluster from the marine isolate 'Streptomyces maritimus': evidence for the derailment of an aromatic polyketide synthase ［J］. Chem Biol,2000,7(12):943 ［11］ Marahiel M A, Stachelhaus T, Mootz H D. Modular peptide synthetases involved in nonribosomal peptide synthesis ［J］. Chem Rev,1997,97(7):2651 ［12］ Hopwood D A, Malpartida F, Kieser H M, et al. Production of 'hybrid' antibiotics by genetic engineering ［J］. Nature,1985,314(6012):642 ［13］ Barton W A, Lesniak J, Biggins J B, et al. Structure, mechanism and engineering of a nucleotidylyltransferase as a first step toward glycorandomization ［J］. Nat Struct Biol,2001,8(6):545 ［14］ Malmberg L H, Hu W S, Sherman D H. Precursor flux control through targeted chromosomal insertion of the lysine epsilonaminotransferase (lat) gene in cephamycin C biosynthesis ［J］. J Bacteriol,1993,175(21):6916 ［15］ Dong H, Mahmud T, Tornus I, et al. Biosynthesis of the validamycins: identification of intermediates in the biosynthesis of validamycin A by Streptomyces hygroscopicus var. limoneus ［J］. J Am Chem Soc,2001,123(12):2733 ［16］ Yu Y, Bai L, Minagawa K, et al. Gene cluster responsible for validamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus subsp. jinggangensis 5008 ［J］. Appl Environ Microbiol,2005,71(9):5066 ［17］ Hu Z, Bao K, Zhou X, et al. Repeated polyketide synthase modules involved in the biosynthesis of a heptaene macrolide by Streptomyces sp. FR008 ［J］. Mol Microbiol,1994,14(1):163 ［18］ Chen S, Huang X, Zhou X, et al. Organizational and mutational analysis of a complete FR008/candicidin gene cluster encoding a structurally related polyene complex ［J］. Chem Biol,2003,10(11):1065 ［19］ Sun Y, Zhou X, Liu J, et al. Streptomyces nanchangensis, a producer of the insecticidal polyether antibiotic nanchangmycin and the antiparasitic macrolide meilingmycin, contains multiple polyketide gene clusters ［J］. Microbiology,2002,148(Pt 2):361 ［20］ Bentley S D, Chater K F, CerdenoTarraga A M, et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2) ［J］. Nature,2002,417(6885):141 ［21］ Omura S, Ikeda H, Ishikawa J, et al. Genome sequence of an industrial microorganism Streptomyces avermitilis: deducing the ability of producing secondary metabolites ［J］. Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(21):12215 ［22］ Sun Y, Zhou X, Dong H, et al. A complete gene cluster from Streptomyces nanchangensis NS3226 encoding biosynthesis of the polyether ionophore nanchangmycin ［J］. Chem Biol,2003,10(5):431 ［23］ Sun Y, Zhou X, Tu G, et al. Identification of a gene cluster encoding meilingmycin biosynthesis among multiple polyketide synthase contigs isolated from Streptomyces nanchangensis NS3226 ［J］. Arch Microbiol,2003,180(2):101