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RSCA 技术应用于 HLA�A , B座位高分辨基因分型的研究*
邓志辉 � 吴国光 � 张 � 旋 � 周 � 丹 � 高素青(深圳市输血医学研究所,广东深圳 518035 )
� � 摘要:目的 � 采用参比链介导的构象分析( refer ence strand mediat ed conformation analysis, RSCA)技术, 建立新
型、可靠的 H LA�A、B 高分辩基因分型方法,应用于 HL A 基因分型及供、受者组织配型。方法 � 采用一对座位特异
性引物,扩增 H L A�A、B 基因的第 2、3 外显子和第 2 内含子。扩增产物与单链标记荧光物质的参比链按一定比例混
合,经变性、退火反应及脱水处理后,在杂交产物中掺入分子量内参标准物, 用 ABI377 型基因测序仪电泳检测。用
ABI GeneScan 3. 1 软件分析每一泳道内异源双链波峰的迁移值、峰高及峰面积值, RSCA H LA Typer1. 3 软件分析
HL A 等位基因型。应用本方法 ,对第 13届国际组织相容性协作组( IHW)送检的 20 份盲检样本, 以及 2 份 HL A 等
位基因型已知的质控样本进行了检测。结果 � 2 份质控 DNA 的检测结果,与已知的 H L A 基因型完全相符; 20 份盲
检样本 H LA�A、B 座位的检测结果, 与 IHW公布的结果完全相同, 准确率达 100%。结论 � RSCA 为新型、高分辨水
平的 HL A 基因分型方法,并且出现模棱两可结果的情况少,分型结果准确、可靠。
关键词:参比链介导的构象分析( RSCA) � H LA�A、B 座位 � 基因分型 � 高分辨率
中图分类号:Q503 � R457� 1+ 1� Q754 � � 文献标识码:A � � 文章编号: 1004�549X( 2005) 04�0296�03
* 基金项目:广东省卫生厅科研基金项目课题(编号 A2001641)
� � HLA 分型当前普遍采用以 DNA 为基础的基因分型方
法,如 PCR�序列特异性引物( PCR�SSP )、PCR�序列特异性
寡核苷酸探针杂交( PCR�SSOP )、H LA 基因测序( SBT )等。
随着我国造血干细胞捐献者资料库的建立和临床非血缘关
系骨髓移植的开展,研究和探讨新型、可靠、高通量、高分辩
率的 HL A 基因分型方法具有重要意义。
参比链介导的构象分析( r ef er ence str and mediated con�
fo rmation analysis, RSCA )是一种新型的 H LA 高分辩基因
分型方法,与经典的以测序为基础分型方法学不同, 该方法
利用不同 H LA 等位基因与参比链形成的 DNA 空间构象的
差异,采用基因测序仪荧光法检测和相关分析软件进行
HL A 基因分型[ 1~ 3]。笔者对 2002 年第 13 届国际组织相容
性协作组( IHW)送检的 20 份盲检样本, 进行了 HLA�A、B
基因分型,现
报告
软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载
如下。
1 � 材料与方法
1. 1 � DNA 样本来源 � 20 份盲检考核样本及 2 份 HL A 等
位基因型已知的质控样本, 均由国际组织相关性协作组
( IHW)提供,每份 DNA的浓度为 100ng/ ml。
1. 2 � 主要试剂及仪器 � RSCAT M A 座位 H LA 分型试剂盒
(批号: RSCA�M�A�001)和 RSCA TM B 座位 HLA 分型试剂
盒(批号: RSCA�M�B�001, 美国 PEL�FREEZ 公司) ; 9700 型
PCR扩增仪及 ABI Pr ismTM 377 型基因测序仪(美国 ABI 公
司)。
1. 3 � PCR 扩增 � 采用一对位点特异性引物, 扩增 HL A�A 、
B 基因的第 2、第 3 外显子及第 2 内含子, PCR 产物为
980bp。反应体系为 50�l, 内含 RSCA amplification buffer
20�l, ddH2O 22. 6�l, HLA�A 座位 5 端、3 端扩增引物各 1�l
( HL A�B 基因扩增:分别加入 B 座位 5 端、3 端扩增引物各
1�l) , T aq 酶( 5U /�l) 0. 4�l, 基因组 DNA ( 100ng/�l) 5�l。
扩增条件为: 98 ! 20s; 96 ! 20s, 68 ! 90s, 35cycles; 72!
5m in; 15 ! 永久保存。
1. 4� RSCA 变性及退火反应
1. 4. 1� 反应体系的组成 � H LA�A 座位: 取 6�lHL A�A 基
因的 PCR 产物,分别与 RSCA TM A 座位试剂盒的 2 种参比
链( 2�l)混合。HLA�B 座位: 取 6�l H L A�B 基因的 PCR产
物,分别与 RSCAT M B 座位试剂盒的 3 种参比链( 2�l)混合。
1. 4. 2 � RSCA 变性及退火反应条件: HLA�A、B 座位的
RSCA∀ 变性及退火反应#条件均为: 95 ! 4min; 55 ! 5min;
15 ! 5m in。
1. 5� 制备电泳样本
1. 5. 1� 脱水 � PCR 产物与每一参比链混合 , 经∀ 变性及退
火反应#形成的杂交产物(包括同源双链、异源双链) , 按等量
的比例重新混合, 然后在真空离心机中脱水。
1. 5. 2� 掺入荧光标记的分子量标准物 � 脱水后的离心管
中,加入 1. 5�l DNA ladder ,同源双链及异源双链溶解于分
子量内参标准物溶液中。
1. 6� 电泳
1. 6. 1 � 制备 6% 非变性聚丙烯酰胺凝胶 30m l � 取 Long
Ranger Gel So lution 3. 6ml, 10 倍的 RSCA 电泳缓冲液
3. 0ml,双蒸水 23. 4ml。上述混合物经过滤、抽气后, 加入
180�l过硫酸铵和 18�l TEMED, 轻轻混匀后,立即倒胶。
1. 6. 2� 设置有关电泳参数 如∀ Run module#及 ∀ Gel pr ef er�
ence#, 分别按说明书[ 4, 5]进行。
1. 6. 3� 电泳 � 编制样本表, 在凝胶中加入步骤 1. 5 所制备
�296� 中国输血杂志 2005年 8月第 18卷第 4期 � Chin J Blood T ransfusion, Augu st , 2005, Vol . 18, No. 4
的电泳样本。使用由 Pel�Freez 公司提供的 RSCA 电极缓冲
液,用 ABI Pr ismT M 377 型基因测序仪进行电泳和检测。
HL A�A 、B 基因分型样本的电泳、收集信息需 10h。
1. 7 � 结果分析 � 电泳完毕,采用 ABI GeneScan 3. 1 分析软
件,根据每一泳道中掺入的分子量标准物的片段大小, 计算
每一同源双链波峰、异源双链波峰的迁移值、峰高 ( peak
height)及波峰面积 ( peak area ) 等参数。然后应用 RSCA
HLA Typer 1. 3 软件, 把每一样本异源双链波峰的迁移值
与 RSCA 数据库所包含的 HL A 等位基因的迁移值逐一进
行比对,确定 HL A 等位基因型。
2 � 结果
20 份盲检考核样本的检测结果见表 1, 其结果与 IHW
公布的结果[2]完全相同, 准确率达 100%。每次实验, IHW
提供的 2 份质控样本的检测结果, 与已知的 H LA 等位基因
型相同。H L A�A 基因扩增产物与参比链形成的同源双链、
异源双链波峰,见图 1 所示。
表 1 � 第 13届 IHW 考核样本的基因分型结果
样本编号 H LA 等位基因型
H LA�A HLA�B
RSCA�01 0201, 8001 5703, 5703
RSCA�02 0101, 2901 4006, 5201
RSCA�03 0202, 03011 3501, 5301
RSCA�04 3201, 6601 51011, 7301
RSCA�05 1101, 2403 1502, 5502
RSCA�06 31012, 3301 1402, 3502
RSCA�07 2403, 3303 4601, 1512
RSCA�08 2902, 03011 07021, 4404
RSCA�09 3601, 7401 5301, 5703
RSCA�10 3402, 6802 1510, 4403
RSCA�11 1101, 3402 2705, 8201
RSCA�12 0102, 6601 5801, 5802
RSCA�13 0206, 3002 1801, 3908
RSCA�14 2402, 2901 2702, 0705/ 06
RSCA�15 0205, 6802 1402, 5801
RSCA�16 1101, 2402 2706, 4801
RSCA�17 0211, 68012 3505, 4004
RSCA�18 0206, 1101 3501, 1501
RSCA�19 0216, 03011 5101, 5101
RSCA�20 0201, 0201 3501, 3501
注: IHW提供的 2份质控样本, 质控样本 1的基因型为 H LA�A *
0206, 3001; H LA�B * 3905, 4201, 质控样本 2 的基因型为:
H LA�A * 0201, 0301; H LA�B * 0702, 3501
上图: 7号考核样本( H LA�A 基因杂合子)与一参比链形成的 2个异
源波峰;下图: 20号考核样本 ( H LA�A 基因纯合子)与一参比链形
成的 1个异源波峰
图 1 � 2 例考核样本 HL A�A 基因扩增产物与
一参比链形成的异源波峰
3� 讨论
RSCA 技术的原理新颖、独特, 与经典的 PCR�SSP、
PCR�SSOP、SBT 等 DNA 分型方法不同。该技术采用一对
H LA 座位特异性引物, 扩增 H LA�A、B 基因的第 2、第 3 外
显子及第 2 内含子, 全长 980bp。扩增产物与单链标记有荧
光物质的参比链混合, 经特定的变性、退火反应, 结果 DNA
序列完全互补的两条单链重新结合, 形成同源双链( homo�
duplex ) ; 而 DNA 序列不完全互补的 2 条单链结合后, 则形
成异源双链( heter oduplex ) , 如参比链的正义链( 5 端标记有
荧光物质)与 HL A�A 或 B 基因扩增产物的反义链结合。
异源双链由于存在链内二级结构, 在非变性聚丙烯酰胺
凝胶中的迁移速率较同源双链慢; 不同的 H LA 等位基因,
其 DNA 序列不同, 与参比链形成的异源双链的空间构象也
存在差异,因而在凝胶中的迁移速率也不一致。通过测定每
一样本的异源双链波峰的迁移值, 将该迁移值与 RSCA 分
型数据库中所包含的 HL A 等位基因的迁移值逐一进行自
动比对, 从而确定受检者的等位基因型。已有研究表明,该
技术可检测出 H L A 等位基因中单个核苷酸差异水平[ 1]。
RSCA 方法的优点在于每人份每个 H LA 座位只需作一
次 PCR 扩增反应,与 PCR�SSP方法相比, 所需的模板 DNA
量少; 扩增产物与参比链杂交形成的异源双链, 采用基因测
序仪荧光法检测, 灵敏度高;而且在杂交混合物中, 掺入荧光
标记的分子量标准物, 可校正凝胶、同一凝胶不同泳道的差
异,以保证计算异源波峰迁移值的准确性。RSCA 为高分辨
水平的 HL A 基因分型方法,与经典的 SBT 方法相比, 其优
点还在于不存在 SBT 分型中的顺式/反式问题[ 1] , 出现模棱
两可的结果少。笔者使用的 RSCAT M A 座位试剂盒中有 2
种不同的参比链, 而 RSCAT M B 座位试剂盒则有 3 种不同的
参比链; HL A�A 或B 基因的扩增产物经变性后分离, 因而
不存在 SBT 分型中的顺式/反式问题; 不同的 HL A 等位基
因与参比链形成的异源波峰, 其迁移值也不同; 因而可通过
联合采用多种参比链, 来区分 HL A 等位基因。
�297�中国输血杂志 2005年 8月第 18卷第 4期 � Ch in J Blood T rans fus ion, August , 2005, Vol. 18, No. 4
从 RSCA 分型的电泳图谱中可观察到: H LA 纯合子等
位基因型,只有一个异源波峰; 而杂合子一般有 2 个异源波
峰(少数情况下, 一异源波峰与另一异源波峰或同源波峰同
泳,则出现一个波峰, 但峰值较高) , 并且纯合子的异源波峰
的峰高、峰面积值较杂合子异源波峰要高, 根据 RSCA 异源
波峰这一特点,可以清楚地鉴定纯合子、杂合子等位基因型。
同时, 由于 H LA�A、B 基因的 RSCA 分型中的电泳参数如
∀ r un module#中的∀ electr opho resis voltag e#、∀ elect rophor e�
sis curr ent# 、∀ co llection time# 等均相同, 因此, HL A�A、B
基因的扩增产物与参比链杂交形成的杂交产物, 可在同一凝
胶、不同泳道中进行电泳检测, 可得到正确结果。
RSCA技术对实验条件的控制,要求严格。笔者在实验
过程中发现:非变性聚丙烯酰胺凝胶聚合时间的长短, 对结
果有显著影响。在室温条件下, 凝胶聚合时间短(如 2. 5h) ,
同源波峰及异源波峰在凝胶中迁移速度偏快, 检测到同源波
峰的实际∀ r un time#值小于标准值。笔者认为凝胶一般在室
温下聚合 5h 后, 使用效果较好。此外, RSCA 试剂盒提供的
膜上样缓冲液是否冲洗干净,对结果也有显著影响。若该上
样缓冲液冲洗不干净, 同源波峰及异源波峰的迁移速度偏
慢,检测到同源波峰的实际∀ run time# 值大于标准值, 也不
能得到正确分型结果。经使用膜梳子上样, 电泳 2 min 后拨
出膜梳子,再用 10ml注射器冲洗膜上样缓冲液, 可得到满意
的结果。
采用 RSCA H LA 分型技术, 对 IHW 送检的考核样本
进行 HL A�A、B 基因分型, 取得了满意的实验结果, 但运用
于常规 H L A 基因分型, 尚有待于进一步完善; ∃ 是 RSCA
分型数据库中所包含的 HL A 等位基因, 需进一步扩大和完
善; % 是解决实验时间特别是电泳时间过长问题 (使用
ABI377 型测序仪, 电泳时间需 10h) ; % 是结果分析尚需进
一步自动化, 若在同一计算机平台下使用 GeneScan、RSCA
H LA T yper软件, 结果分析将更为简便。
参 考 文 献
1 � Arguello JR, Lit t le AM, Bohan E, et al. A high r esolu tion HLA
class & and clas s ∋matching m ethod for bone mar row donor se�
lection . Bon e Mar row T ransplantat ion, 1998, 22(3) : 527
2 � Kalve I, Devit t D , Lit tl e AM, et al. E valuat ion of RSCA as a no�
vel, emerging H LA typing m ethod. Available at ht tp: / / www . ih�
w c. org / b ook . htm
3 � Daniel S, Ram on J , Rafael Arguello, et al. C ox . Applicat ion of
RSCA for the T yping of H LA�DPB1. Hum Immunol, 1998, 59
( 3) : 734
4 � Pel�Freez Clinical Sys tems, LLC. In st ruct ions for U sing RSCAT M
A�Locus H LA Mul ti�Dye Typing Kit . Available at ht tp: / / w ww.
pel�f reez. com
5 � Pel�Freez Clinical Sys tems, LLC. In st ruct ions for U sing RSCAT M
B�Locu s HLA Mul ti�Dye Typing Kit . Available at ht tp: / / w ww.
pel�f reez. com
( 2004�07�21收稿, 2005�04�20修回)
本文编辑:尚 � 云
临床合理用药的宝典 � 医(药)师掌握最新药物信息的必备手册
(药物临床信息参考 2005)隆重出版
� � 近年来药物的研发进展迅速,不仅新上市的药品层出不穷, 而且医院常用药物,甚至国家基本药物中的一些药名在数年
前都闻所未闻,药物研究人员、医生、药师怎样来把握千变万化、日新月异的临床用药信息, 以更好地开展其专业工作, 成为了
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�298� 中国输血杂志 2005年 8月第 18卷第 4期 � Chin J Blood T ransfusion, Augu st , 2005, Vol . 18, No. 4