质粒的转化(热激法)实验四质粒的转化
质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中,实现重组克隆的增殖,便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
实验目的:掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。
实验材料:外源片段与载体的连接产物;大肠杆菌感受态细胞。
实验原理:(1)热激法:大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促进细胞吸收DN...
实验四质粒的转化
质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中,实现重组克隆的增殖,便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
实验目的:掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。
实验材料:外源片段与载体的连接产物;大肠杆菌感受态细胞。
实验原理:(1)热激法:大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面,经42℃短时间热冲击处理,促进细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中,重组子基因得到表达,在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
(2)电转化法:外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定,形成电穿孔,不仅有利于离子和水进入细菌细胞,也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。
热激法转化实验步骤:
1.制备选择性培养基平板:在融化的250ml LB固体培养基中(冷却止55摄氏度以下)加入Amp至终浓度50μg/ml,混匀后倒入灭菌培养皿中;
2.取出1管制备好的感受态细胞,放在冰上融化;
3.每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA,轻轻混匀,在冰上放置30分钟;
4.热击:将离心管放置42℃水浴,热击90秒,注意:勿摇动离心管;
5.冰镇:快速将离心管转移至冰浴,放置1-2分钟;
6.复苏:每管加400 μl LB培养基,在37℃摇床温和摇动温育45分钟,使细菌复苏;
7.布皿:取适当体积均匀涂布于含有、抗生素(Amp)的LB平板;
8.培养:倒置培养皿,于37℃培养12-16小时即可观察到白色的菌落,即为转化子。
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