褪色光度法测定羟自由基及常见食物的抗氧化活性

褪色光度法测定羟自由基及常见食物的抗氧化活性 褪色光度法测定羟自由基及常见食物的抗 氧化活性 赛 堡堕墨 褪色光度法测定羟自由基及 常见食物的抗氧化活性 张东,刘志江,高俊杰,余萍 (沈阳理工大学环境与化学工程学院,沈阳11O168) 摘要:在用稀硫酸调节至pH4的溶液中,生物染色剂玫瑰桃红R能被由Fenton反应产生的 羟自由基(?OH)氧化而褪色.根据在520nm波长处所测得的吸光度的消褪的程度 (?A==:A., A),实现了羟自由基存在量的光度测定,应用此 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 还测定了自由基消除率,作为选择清除 剂的 判据;还测定了几种常见食品的抗氧化活性.从方法的操作和所测得的结果证明该方法具有 操作 简单,方便且稳定而经济. 关键词:褪色光度法;羟自由基;抗氧化活性;食品 中图分类号:0657.3文献标识码:A文章编号:1001—4020(2007)10-0852—03 Color-FadingPhotometricDeterminationofHydroxylFreeRadicaland Anti-OxidationActivityofSomeCommonFoodstuffs ZHANGDong,LIUZhi-jiang,GAOJun-jie,YUPing (CollegeofEnvironmentalandChemicalEngineering,ShenyangUniversityofScienceand Engineering,Shenyang110168,China) Abstract:InasolutionofpH4adjustedwithdil.H2SO4,bordeauxredwasoxidizedanddecolorizedby hydroxylfreeradical(?OH)producedbytheFentonreaction.Bymeasuringthemagnitudeofintensityofcolor- fading(AA—Ao--A1)atthewavelengthof520nm,theamountof?OHpresentwasdeterminedphotometrically. TheproposedmethodwasalsousedtOdeterminedtheanti-oxidationactivityandusedasamethodtOchoose scavengingagentsaccordingtOthairscavengingrates.Thescavengingratesortheanti-oxidationactivityofsome COITLrflonfoodstuffsweredeterminedbythismethod,whichwasprovedtobequitesimple,stable,convenientand economic. Keywords:Color-fadingphotometry;Hydroxylfreeradical;Anti-oxidationactivity;Foodstuff 羟自由基是一种氧化能力很强的自由基,生物 体内的羟自由基可使糖类,氨基酸,蛋白质,核酸和 脂肪类发生氧化l1?].对羟自由基的研究在生命科 学,环境和食品科学领域中受到了广泛的重视,而测 定羟自由基和筛选抗羟自由基氧化物质是一项重要 内容.目前,离体检测羟自由基方法有电子共振自 旋捕集法(ESR)[43,化学发光法I5],高效液相色谱 法[引,荧光法[,8],电化学法[.]等.这些方法有的操 收稿日期:2006—07—16 作者简介:张东(1974一),男,满族,吉林伊通人,工程师,主要 从事仪器分析和环境监测工作. ? 852? 作复杂,有的仪器试剂特殊或昂贵,使其应用受到了 限制. 分光光度法以其仪器价格低廉,操作简便而被 广泛应用,用于羟自由基测定研究已有报道__1..]. 试验发现:在一定条件下,玫瑰桃红R能被羟自由 基氧化而褪色,而且褪色程度(?A)与羟自由基的量 在一定范围内呈正比关系,据此建立了测定羟自由 基的方法.并应用于测定食物水提取液对羟自由基 的清除率.该方法操作简便,灵敏度较高,稳定性 好,可作为一种筛选羟自由基清除剂的方法,有较高 的推广应用价值. 1方法原理 由玫瑰桃红R可以看出,生色基--N=N--与 两个萘环组成的大共轭体系是生色基团,其最大吸 收波长为520nm左右.当加入过氧化氢和Fe计 时,过氧化氢和Fe.+发生Fenton反应,产生羟自由 基,羟自由基是一种很强的亲电试剂,它进攻玫瑰桃 红R的大共轭体系,使一N—N一和萘酚基之间的 键断裂],大共轭体系受到破坏,在520nm波长处 的吸收峰消失.通过测定玫瑰桃红R在520nm波 长处的吸光度的变化,可间接测定出羟自由基的生 成量.反应机理如下: HOx, SOaR N 留?H一’ SO3R 玫瑰桃红R(紫红色,:520nm) HO,,S03R N?留 (无色)(无色) 2试验部分 2.1仪器与试剂 756一MC紫外一可见分光光度计;pHS-3C型酸 度计. 玫瑰桃红R溶液:2.0×10mol?I_.;硫酸溶 液:0.1mol?L_.;铁(II)标准溶液:0.01tool?L (现用现配);过氧化氢溶液:0.05mol?L叫过氧化 氢配制,用KMnO4标准溶液标定,2,8?冰箱内 保存;抗坏血酸,苯甲酸和硫脲溶液的浓度均为 0.01mol?L_.. 试剂均为分析纯,水为蒸馏水. 2.2试验方法 2.2.1羟自由基的测定 取两支50mL比色管,加水至40mL,再分别 加入2.0×10川mol?I叫玫瑰桃红R溶液6.0mL, 用0.1mol?L叫硫酸调pH为4后,向其中一支比 色管中加入一定量的Fenton试剂(过氧化氢和硫酸 铁溶液),另一支不加Fenton试剂,分别用水稀至刻 度,同时摇匀.在室温下反应2Omin,以水为参比, 用0.5cm比色皿,在520nm波长处分别测定加与 不加Fenton试剂的吸光度(A,A.)和吸光度差值 zXA一(Ao—A1). 2.2.2羟自由基清除率的测定 张东等:褪色光度法测定羟自由茎垦堂堡塑塑鱼适些 按2.2.1步骤操作,在调pH为4后,向其中一 支比色管中加入羟自由基清除剂,再分别加入等量 的Fenton试剂,定容,摇匀.室温下反应2Omin 后,分别测定吸光度,加羟自由基清除剂的溶液的吸 光度记为A..羟自由基清除率(F)按下式计算: F:会X100 2.2.3食物中水提取物清除羟自由基能力的测定 称取天然食物10.00g,捣碎,加入蒸馏水 100mL,匀浆,密塞浸泡4h后,离心分离,移取上 清液1.00mL测定. 3结果与讨论 3.1吸收光谱曲线 按试验方法,分别扫描吸收光谱曲线,见图1. 1.玫瑰桃红R溶液(Bordeaux-Red)2.1+O.005mmolFe+ 3.1+0.01mmolHzOz 4.140.005mmolFez++0.01ml-nolH2Oz 5.1+0.01ml-nolFez+4o.02ml-nolH2O2 6.0.01ml-nolFez++0.02ml-nolH2O2 图1吸收光谱 Fig.1Absorptionspectra 常温下过氧化氢基本不能氧化玫瑰桃红R褪 色,当加入Fenton试剂,产生的羟自由基很容易氧 化玫瑰桃红R褪色.所有曲线最大吸收波长均在 520nm处,试验选用520nm作为测定波长. 3.2酸度的影晌 分别用0.1mol?L硫酸溶液调节不同的pH 后,按试验方法测定吸光度.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明:当体系的起 始pH为4时,?A最大.选用体系的起始pH为4 的硫酸体系. 3.3玫瑰桃红R溶液用量的选择 试验结果表明:随着玫瑰桃红R溶液用量的增 加,?A值增大,当用量超过5.5mL以后,?A值不 再增加.试验选用2.0×10卅mol?L叫玫瑰桃红R 溶液6.0mL. 3.4过氧化氢和Fe2+对羟自由基测定的干扰 按试验方法,调pH为4后,分别加入不同量的 过氧化氢溶液或不同量的Fe抖,室温下反应 2Orain,测定吸光度.结果表明:0.05tool?L过 氧化氢溶液0.4mI以内,吸光度不发生变化,用量 过多,过氧化氢可以把玫瑰桃红R氧化.而Fe+单 独存在时不与玫瑰桃红R反应.为了避免过氧化 氢对测定的干扰,0.05tool?L叫过氧化氢溶液用量 应控制在0.4mL以内. 3.5[H:O2]/EFd+]摩尔比对羟自由基产量的 影响 取0.05tool?L叫过氧化氢溶液0.2mL,分别 加入不同量的Fe计,当EHO]/[Fe](摩尔比)为 l,3时,羟自由基产率高. 3.6反应温度与反应时间的影响 取三份40mL蒸馏水,分别加入玫瑰桃红R溶 液,调pH为4后,向其中一份加入过氧化氢溶液 0.2mL;一份加入过氧化氢溶液0.2mI和Fe溶 液0.5mI;第三份不加.在不同反应温度下反应, 结果表明:温度越高,反应速度越快,但温度超过 6OoC,过氧化氢与玫瑰桃红R反应速度加快,干扰 测定,室温下2Omin反应完全.试验选择在室温下 反应2Orain测定. 3.7稳定性和精密度 按试验方法,反应2Orain后,室温下放置不同 时间,?A在2h内保持不变(未做上限).对过氧化 氢初始浓度为0.01mmoI?I,,EHOz]/[Fe] (摩尔比)为2的溶液测定11次,RSD为1.1. 3.8线性范围和检出限 由于在Fenton反应中,反应物过氧化氢与产物 ? OH的物质的量比为1:1,因此,可用过氧化氢 的浓度与?A值的线性关系表示羟自由基的量与 ?A值的线性关系. 回归方程为:?A一一0.0169+1876.666C (r—O.9939),线性范围为0.015mmol?I以内. 方法检出限为5.734×10tool?L,. 4羟自由基清除剂的作用 4.1常用羟自由基清除剂的作用 抗坏血酸,苯甲酸和硫脲都是常用的羟自由基 清除剂],检测此三种物质对羟自由基的清除率以 反证本法有效性(图2). 用本法检测抗氧化剂清除羟自由基均有明显的 匿簦:塑鱼堕法测定羟自由基及常见食物的抗氧化活性 1.硫脲(Thiourea)2.苯甲酸(Benzoicacid) 3.抗坏血酸(Ascorbicacid) 图2抗氧化剂与清除率的量效关系 Fig.2Relationshipbetweenantioxidantandscavengingrate 量效关系,本方法可用于筛选羟自由基清除剂及其 清除羟自由基机理的研究. 4.2天然食物对羟自由基的清除作用 按试验方法,分别测定了几种常见食物纯水浸 泡提取液对羟自由基的清除率,结果见表l. 表1多种常见食物对羟自由基的清除率的测定值 Tab.1Valuesofrateofscavengingof16kindsoffoodstuffs againsthydroxylfreeradical 食物名称清除率食物名称清除率 NameofScavengingrateNameofScavengingrate foodstuffF7%foodstuffF}% 花生2O.7菠菜68.1 核桃69.3番茄9.6 黄豆10.5油菜24.5 生姜40.6香菜19.3 黑芝麻61.0茄子6.8 紫皮蒜42.0黄瓜3.7 胡萝9.3大白菜3.5 青椒6.2香菇8.6 参考文献: [1]KnightJATheprocessandtheoriesofaging[J]. AnnClinLabSci,1995,25(1):1-12. [2]NinesBN,ShigenagaMK,HagenTMOxidants, antioxidants,andthedegenerativediseaseofaging[J]. ProcNatlAcadSciUSA,1993,90(17):7915—7922. 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(下转第857页) 表3两种方法测定样品中钾和钠的结果比较 Tab.3Comparisonofresultsofdeterminationofpotassium contentandsodiumcontentinboratesamplesbyflame photometry(FP)andatomicabsorptionspectrometry(AAS) 误差绝对值?3.76,由t检验和F检验[8]也可知, <0. 01’6—3.143,F<Fo.01(3.3】一29.46,表明两种方 法的测定结果也无显着性差异. 表4加标回收试验结果 Tab.4Resultsoftestforrecoverybystandardadditionmethod 样品中含量 A 加 m 标量 ‘tof 测 ain 值 ‘tContentsfoundTotaamts收率l’ 样品insamp1estandardsaddedfoundKcavery pIe/(mg?L一)… KNaKNaKNaKNa 2.4加标回收试验 分别对钾和钠进行样品加标回收试验,测定结 果见表4. 参考文献: 曹吉林,白鹏,王世昌.25?Na,K//cl一,S H.BOa—H.O体系相平衡研究[J].海湖盐与化工, l998,2l(4):25. 桑世华,唐明林,殷辉安,等.298K时Kc1_K2C0s— K:B4O一H.O相平衡及平衡液相物化性质的研究[J]. 四川大学学报:工程科学版,2001,33(6):6O. 桑世华,唐明林,殷辉安,等.Na2B4O-KzB407一HzO三 元体系288K相平衡研究[J].海湖盐与化工,2001, 3l(1):l7. 桑世华,唐明林,殷辉安,等.Li(K)/C0;一,&0;一 HO三元体系288K相平衡研究I-j].IM&P化工矿 物与加工,2002,31(3):8. 桑世华,邓天龙,唐明林,等.Li.B4O一Na2B4O一H.O 三元体系25?相关系及物化性质实验[J].成都理工 学院学报,1997,24(4):88. 桑世华,唐明林,殷辉安,等.K.&O一Na2I34O一 Liz&O一HzO四元体系288K相平衡研究[J].化学工 程,2003,3l(4):69. 桑世华,唐明林,殷辉安,等.Li,Na//c0;一,&0;一 HzO四元交互体系288K的相平衡[J].物理化学学 报,2002,18(9):835. 杭州大学化学系分析化学教研室.分析化学手册:第一 分册[M].北京:化学工业出版社,1997:576,581,595— 597. jjj—L (上接第854页) 韩鹤友,何治柯,曾云鹗.钌(?)一邻菲咯啉偶合化学发 光法测定Fenton反应产生的羟自由基[J]_分析化学, 1999,27(8):890—893. 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