QSTAR Pulsar028Ⅰ型串连四极杆飞行时间液质联用质谱仪简介及其应用

QSTAR Pulsar028Ⅰ型串连四极杆飞行时间液质联用质谱仪简介及其应用 QSTAR Pulsar028?型串连四极杆飞行时 间液质联用质谱仪简介及其应用 琨代仪曩曩霍 QSTARPulsarI型串连四极杆飞行时间液质联用质谱仪 简介及其应用 赵和平黄凌云肖雪媛陈剑何大澄 (北京师范大学生命科学学院北京100875) 摘要简要介绍QSTAR质谱仪的工作原理,性能特点,并从使用者的角度介绍该质 谱所配备的各种离子源的特点及应用举例. 关键词质谱蛋白质组学芯片应用 基因组学的发展得益于大规模测序技术,蛋白质 组学的兴起则离不开生物质谱技术."组学"的含义在 于研究的对象不是一个或几个基因或蛋白,而是"全 部"的基因或蛋白.因此蛋白质组学的发展需要像基因 测序技术那样大规模,高通量地分析鉴定蛋白质的技 术.蛋白质的质谱鉴定技术为蛋白质组学提供一个比较 理想的平台,尽管其还无法达到基因测序技术的规模与 速度.目前蛋白质组研究中最常用的质谱有离子阱,飞 行时间,四极杆质谱和傅立叶变换质谱,其分析生物大 分子的能力各有所长,同时也各有所短.因此,目前新 推出的功能更强大的生物质谱多是串连质谱,串连质谱 达到了取各家之所长,且避其所短的目的,从而大幅度 地提高生物质谱分析生物大分子的精确度和可靠眭.本 文拟对北京师范大学蛋白质组学研究中心的Hybrid Quadmpole—TOFI~/NS/NassSpectmrer(串连四极杆 飞行时间液质联用质谱仪,型号:QRPulsarI),及 相直的离子源,尤其是可以使蛋白质芯片直接在Qs. 质谱上阅读的离子源接口等予以介绍.为叙述方 便,以下以Q来代表该质谱仪. 1QSTAR质谱仪简介 QSTAR是将传统的四极杆质谱与飞行时间质 谱相结合,构成串连型质谱.该仪器由两大部分组 成,即水平方向的四极杆部分和垂直方向的飞行时 0,Q1和Q2三个主 间部分.其中四极杆部分由Q 要部分组成,飞行时间部分由加速器,反射器和检 测器组成(见图1)如果将QSTAR与三级四极杆 质谱做个比较,就呵以看出,QSTAR比三级四极 杆多一个Q0,而三级四极杆质谱的质量分析器Q3 则由时间飞行质谱替代.下面以ESI(electmspray ionization)一MS/MS为例,介绍QSTAR的基本工 *通讯作者:Email:dhe@bnu.edu.cn 36 作原理.在强电场的作用下,使ESI源的样品溶液 带上电荷喷出,并形成微粒,飞行微粒首先与逆向 运动的气帘气迎面相遇,其中未带电荷的微粒将被 气帘气吹出,而带电微粒则在电场的作用下继续前 进,其中的液体则在气帘气的作用下挥发而随气流 流出,从而将电荷留给肽段使之成为带电粒子.肽 离子在电场的作用下进入Q0,Q0为由一组施加射 频电压的四极杆组成的预过滤器,离子在Q0中经 过聚焦后进人Ql,Ql为四极杆质量过滤器,即可 以通过在四极杆上施加特定的电压选择特定质荷比 的离子通过,也可以通过连续变化的电压(扫描) 使所有质荷比的离子通过.Q2为离子裂解室,接 有裂解气(氩气或氮气).经Ql选择的离子进入 Q2后被裂解.QSTAR的Q2附加了脉冲式的离子延 迟装置,称为Q2Pulsing.通过一个延迟电压,使 离 子 源 器 图1QSTARPulsarI的工作原理示意图 向TOF飞行的离子速度变慢,从而起到离子富集 的作用.其基本原理可以简单的比喻为脉冲式的 "关闸蓄水,然后突然放水",使原来的涓涓细流变 成"洪峰"(离子流的高峰)进入TOF的加速器, 仅奠评介 从而使每次加速器加速的离子增加.对于质荷比高 于600的离子的富集效果为3,5倍,低于600的 较小离子的富集效果一般为l0,20倍.离子经过 Q2Pulsing后进入TOF部分,并被加速器的在垂直 方向加速,然后通过反射器到达 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 器.QSTAR 的灵敏度在fmol级,分辨率一般在8000以上. 2OSTAR的工作模式 QSTAR可以进行多种模式的质量检测,主要 包括Ql扫描,TOFMSProductIon(MS/MS)和Pre— cursorIon(母离子扫描),另外这些模式都可以用于 负离子的质谱检测. Ql扫描是用来对QSTAR的四极杆部分进行校 对的,不用于样品测定.TOFMS是QSTAR的主要 工作模式之一,用以获得肽指纹图谱.而Product Ion模式则可以进一步选择肽指纹图谱中的肽段来 进行二级质谱.这样QSTAR大部分情况下可以获 得至少两组肽质量信息,从而可以相互验证,增加 鉴定结果的可靠性.母离子扫描也是QSTAR的重 要工作模式之一,该模式是为追踪含某一特定质量 基团的肽段而设计的.如可以特异的追踪磷酸化蛋 白质或糖基化蛋白质的磷酸基团或糖基,从而找出 含有磷酸化或糖基化位点.QSTAR的母离子扫描 速度不如离子阱快.因此,QSTAR作母离子扫描 采用NanoSpray比较合适,因为NanoSpray可以维 持比较长的样品喷射时间,但即便是NanoSpray也 需要拥有较多的样品. 除了以上的主要模式外,QSTAR还提供En— hance和多电荷分离(MultipleChargeSeparation)功 能.利用Enhance功能可以自动调节Ql,增加所选 定的质荷比范围内的离子的通过率.而多电荷分离 只用于ESI源,其功能是通过软件将质谱图中的单 电荷峰滤掉,从而使多电荷峰得以显现.由于肽段 多是以多电荷的形式存在,因此,利用多电荷分离 功能,可以获得只含多电荷的肽质量谱.图2所示 的为一个多电荷分离功能应用的例子.其中离子源 为NanoSpray,样品为4fmol/L的BSA 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 样品, 裂解酶为胰蛋白酶.从图2可以看出,一些单电荷 峰被滤掉,而一些原来被单电荷峰所掩盖的多电荷 峰则清晰的显露出来,从而获得与使用MALDI(基 质辅助激光解吸附电离,matrix—assistedlaserdes— orption/ionization)源相近的肽质量图谱,因而可以 更好的进行肽指纹图谱分析,增加结果的可信度 (见图2). 图2多电荷分离的应用效果 A.未使用多电荷分离功能B.部分使用多电荷分离功能c.完 全使用多电荷分离功能 本图为4fmol/ml和BSA经胰蛋白酶水解后的肽质量谱,离子源 为NanoSpray.其中斜箭头示被滤掉的单电荷峰,垂直箭头示显露 的多电荷峰 3与QSR匹配的离子源 QSTAR可接的离子源类型非常多,因此可以 和气相色谱,液相色谱以及毛细管电泳联用.因此 QSTAR即可以检测小分子有机化合物,也可以检 测生物大分子,即适合于蛋白质组学研究,也适合 于药物研究. 本实验室以蛋白质组学研究为首要目标,依据 生物质谱的特点配有ESI电喷雾Eleetrespmyioniza— tion源和MALDI源. 3.1ESI源 其中ESI源包括IonSpray,MicroSpray和Nano Spray.IonSpray可以用来检测小分子化合物,一般 不用来检测生物大分子.MicroSpray可以与毛细管 液相色谱联用,但其要求的样品量较大.Nano Spray是最常用的用于蛋白质检测的ESI源,其流 速为纳升级.NanoSpray即可以进行离线质谱检测 1,2的蛋白质样品,也可以与Nano—LC(Nano liquidchromatography)连接进行在线检测Lc分离分 样品.液相色谱与质谱联用技术的快速发展,使之 已经成为蛋白质组学研究的非常重要的手段,特别 是一些双向电泳无法检测到的极端分子量,极端 pH的蛋白质,以及一些低丰度蛋白质,可以通过 液质联用来进行鉴定3.目前液质联用已经做到 自动化,可以高效的分析混合的蛋白质样品.Qs— TAR质谱的分析软件带有可以控制主要型号的Lc 产品的软件,如LCpackings,Waters,Agilent等, 因而可以直接通过QSTAR的计算机来操控LC,使 整个分离检测过程自动化.至于双向电泳分离的蛋 白质或分离较好的一维电泳的蛋白质条带,也可以 37 琨代仅曩 利用Nanospray进行离线检测: Nano—LC/QSTAR联用比较适合于ICAT(iso— tope—codedaffinitytags)分析.差异蛋白质组研究 是蛋白质组学的一个非常重要的 内容 财务内部控制制度的内容财务内部控制制度的内容人员招聘与配置的内容项目成本控制的内容消防安全演练内容 :而质谱作为 定性分析的工具是非常优秀的,但是其定量的能力 则相对较弱.因此如何使质谱分析能够作到相对定 量是目前世界各大质谱公司关注的焦点之一:ICAT 技术是目前比较有效的方法之一.ICAT技术是利 用两种化学结构完全一致,但是质量数相差9D (重链中有,9个C原子是BC)的试剂标签去分别标 记对照组和实验组样品中含一SH的蛋白,标记后 的两组样品中的相同肽段除质量相差9D外,在化 学结构上完全一致,因此将等量的两组蛋白质样品 混合后,对于同种肽段,尽管其分别被标记上轻链 和重链,但在LC上的洗脱时问完全一致,因而标 记两种质量相差9D的同一肽段将同时被质谱检 测,所以通过比较两个质量相差9的肽段的峰值差 异就可以确定两者含量的相对差异.由于ICAT分 析的是一个混合样品,因此NanoLC与质谱联机分 析就显的尤为重要.本实验室所配的LC为纳升级 的2D—LC,可以很好的与QSTAR联机进行在线检 测.图3为利用ICAT试剂分别标记不同的来源的 BSA的测定结果,从图3中可以看出,共有3对双 1. 啊 一 F …睡....___I 图3利用2D—LC质谱联机及ICAT技术分析不同来 源的BSA含量差异 图中的六个肽段峰均为双电荷峰,其中成对的两个峰之间的质 荷比相差4.5(双电荷) 电荷峰成对排列,质量数正好相差9D(因为是双 电荷峰,所以表观的峰值差异为4.5).因此每对 峰的比值就为含有两种肽段的蛋白的比值,由于图 3中的肽段均是BSA的酶解片段,因此这些峰的比 值即反应了两种来源的BSA的实际含量的差异 QSTAR的分析软件ProICAT可以对同一蛋白的不同 肽段的轻连标记峰和重链标记峰的比值进行统计分 38 析,计算出两者的差异显着性.ICAT是目前最理 想的分析差异蛋白质组的工具之一,但其缺点是过 于昂贵,且不能分析不含一SH的蛋白质. 3.2MALDI源 MALDI技术的发展极大地推动生物质谱的发 展,MALDI源与ESI源是目前生物质谱最为广泛 使用的两种离子源.QSTAR最初的设计是接ESI 源,有鉴于MALDI源的操作简单,快速及较适于 做肽指纹图谱鉴定等优点,后又开发设计MALDI 源接口.双向电泳结合MALDITOFMS是蛋白质组 学研究的主要策略之一,目前已经广泛的应用于蛋 白质组学研究.但是双向电泳对一些极端分子量, 极端pH和低丰度的蛋白质,以及高度疏水的膜蛋 白等的鉴定能力不足,且不易达到高通量.而LC 可以富集低丰度的蛋白,也可以分离双向电泳无法 检测的一些极端蛋白质,因此LC分离的样品用 MALDI源检测,可以与双向电泳技术互补.近来, MALDI板自动点样器的发明使得LC的流出液可以 自动的点在MALDI板上,形成LC—MALDI技术, 从而使MALDITOFMS实现了高通量分析蛋白的设 想,同时也弥补了MALDI无法与LC联用的缺点. 本室QSTAR也配有MALDI板自动点样器,所以我 们即可以利用MALDI源检测双向电泳胶的样品, 也可以做到利用MALDI源快速检测经Lc分离的样 品,从而可以达到高通量的目的. 3.3阅读蛋白质芯片的SELDI接口(SELDIinter. face) 蛋白质芯片是近年来新兴的蛋白质组研究技 术,大致可以分为3类:生物化学型芯片,化学型 芯片和缩微芯片3类.目前可以用于质谱检测的 蛋白质芯片以化学型芯片为主.这类芯片一般只能 用芯片商生产的表面增强激光解吸离子化(Surface enhancedlaserdesorption/ionization,SELDI)质谱.芯 片阅读机来进行检测.芯片商为了使蛋白质芯片可 以用精度更高的QSTAR来检测,专门设计开发与 QSTAR相匹配的SELDI源接口(interface).本实验 室拥有2台芯片阅读机,为更好的将SELDI和QS— TAR结合起来,特地配置一个SELDI接口.该接口 实际上是一个MALDI源,因此可以利用该接口来 检测蛋白质芯片的样品(见图4),也可以作为普 通的MALDI源来检测双向电泳胶,一维电泳胶或 其他任何可用于MALDI源的样品. 致谢:美国应用生物系统公司的刘麟先生对本文提出 了宝贵的修改意见,在此表示感谢. 仅曩评介 :::::;菡=窖:..'…蠕jB,._aa I? 1 _ ' j….1_l瓯 图4利用SELDI源阅读蛋白质芯片 A细胞色素C经胰酶水解后点样于蛋白质芯片(Nommlfa(卜,然后利用SELDI源测定的肽指纹图谱; B选择A图中的1168.72峰为母离子所做二级质谱图 参考文献 lLink.EngJ,SehieltzDMeta1.Directanalysisofproteit~ complexesusingrnassspectrometry.Nat.Biotecho,1999, l7:676,682 2'ashburnMP.WohersD.YatesIlIJR.Large—scaleanaly— sisofyeastproteomebymultidimensionalproteinidentification technology.NatBiotechnol,2001,19:242,247 3PengJ,EliasJE,ThoreenCCeta1.Evaluationofmultidi—O mensionalchromatographycoupledwithtandemmassspectmme— try(LCL/C—MS/MS)forlarge—scaleproteinanalysis:the yeastproteome.JProteomeRes.2003,2(1):43,50 LjJ,SteenH,GygiSPproteinprofilingwithCleavableIsotope — codedAffinityTag(cICAT)Reagents:TheYeastSalinity StressResponse.MolCellProteomics.2003,2(11):1198 — 2o4 俞利荣,曾嵘,夏其昌.蛋白质组研究技术及其进展. 生命的化学,1998,l8(6):4,9 陈主初,梁宋平.肿瘤蛋白质组学,湖南:湖南科学技 术出版社,21302 Hyb~dquadrupole—TOFLC/MS/MSmassspectrometer(QSTARPulsarI) anditsuseinproteomics ZhaoHepingHuangLingyunXiaoXueyuanHeDacheng (InstituteofCellBiology,,CollegeofLifeScience;BeijingNormalUniversity,Beijing,1008 75) AbstractItisbrieflyintroducedthattheprincipleandcapabilityofHybridQuadrupole—— TOFLC/MS/MSMassSpec._ tmnleter(QSTARPulsarI)inthelaboratoryoftheauthors.Theapplicationcharacteristicsand someexamplesofthe ionsourcesforthemassspectrometerisalsointroducedinthisarticle. KeywordsMassSpectrometryProteomicsProteinchipApplication , \,,\吧;嵋\\,\螨,;\,,,\,,吧;\吧;, 喜讯 中国科技信息研究所受国家科技部的委托,从1987年开始对中国科技人员在国内 外发表 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 数量和 被引用情况进行统计分析,连续6年编辑出版《中国科技期刊引证 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 》 (CJRC).CJRC是专门用于期刊 引用分析研究的重要检索评价工具.利用CJRC所提供的科学数据,可以清楚地了 解期刊引用和被引用的 情况,以及期刊对外影响和被重视的程度.据2003年CJRC发布的消息:《现代仪器》总被引频次和影响 因子等项指标较前一年有较大的进步,其中影响因子一项在仪器仪表类刊物排名第4位.这充分表明本刊 在广大读者心目中所占的位置和被重视程度. 在此谨向热心支持《现代仪器》的广大读者,作者致以诚挚谢意1 39