王镜岩生物化学课件004酶

null                第四章酶null The application of enzyme has a much longer history than that of enzymatic research. 新陈代谢是生命活动的基础，而构成新陈代谢的许多复杂而有规律的物质变化和能量变化都是在酶的催化下进行的。生物的生长发育、繁殖、遗传、运动、神经传导等生命活动都与酶的催化过程紧密相关。没有酶的参与，生命活动一刻也不能进行。null酶的发现及研究历史人们对酶的认识起源于生产与生活实践。 夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。 公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。 春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。 酶者，酒母也nullenzyme ("in yeast")enzyme是希腊文 en = in ， zyme = yeastnull公元前两千多年，我国已有酿酒记载； 一百余年前， L. Pasteur证明发酵是酵母细胞的生命活动； 1833-1835年 淀粉的第一次酶解 ； 1877年，Kuhne首次提出Enzyme一词； 1894年 加酶食品的第一次商业化生产； 1897年，E. Buchner用无细胞提取液实现发酵；现代酶学的开始； 1908-1913年 在皮革软化过程中酶取代粪便； 1914年 第一次生产出浓缩洗衣皂； 1926年，J. Sumner从刀豆分中分离提纯并结晶脲酶，首次证明酶是蛋白质；null酶学研究的主要方向：一方面在酶的分子水平上揭示酶与生命活动的关系；另一方面酶的应用研究。1941-1943年 生产胰岛素和胰蛋白酶的新方法； 1963年 碱性蛋白酶--洗涤剂用酶的突破； 1967年 微生物筛选； 1982年，T.R.Cech和S.Altman从四膜虫中发现核酶，即Ribozyme； 1984-1986年 第一个由基因修饰的微生物 (GMO) 生产的酶； 1992年 建立用于酶工业生产的克隆表达； 1995年，Jack W. Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(Deoxyribozyme)； null 酶是一类具有高效率、高度专一性、活性可调节的生物催化剂。第一节  酶学概论一、 酶的概念及其作用特点酶的概念null①催化效率高，用量少（细胞中含量低）。 ②加快反应速度，缩短达到化学平衡的时间，但不改变化学反应平衡点。 ③降低反应活化能。 ④反应前后自身结构与数量不变。酶与非生物催化剂相比的几点共性null 酶催化反应速度是相应的无催化反应的108-1020倍，并且高出非酶催化反应速度107~1013倍。酶催化反应的特点催化效率更高专一性高 又称特异性，酶在催化生化反应时对底物的选择性，即一种酶只能作用于某一类或某一种特定的底物。反应条件温和 酶促反应在常温、常压、中性pH的水溶液中 进行，高温或极端理化条件则易导致酶失活。活性可调节 激素调节、反馈抑制与激活、抑制剂与激活剂调节、别构调节、共价修饰调节等方式调节酶的活性；通过酶的合成与降解调节 酶的浓度。 酶的催化活性与辅酶、辅基、金属离子有关。需要辅助因子null少数酶是RNA（核酶）二、酶的化学本质及其组成1、 酶的化学本质绝大多数酶是蛋白质★ ribozyme核酶（具有催化功能的RNA）null全酶（holoenzyme)=脱辅基酶（apoenzye)+辅因子(cofactor) 例如：超氧化物歧化酶(Cu2+、Zn2+）、乳酸脱氢酶（NAD+）2、 酶的化学组成单纯酶类(simple enzyme)仅由蛋白质组成。 例如：脲酶、溶菌酶、淀粉酶、脂肪酶、核糖核酸酶等。缀合酶类（conjugated enzyme)null酶的辅助因子金属离子Fe2+、Fe3+ 、 Zn2+、 Cu+、Cu2+、 Mn2+、、Mn3+、Mg2+ 、K+、 Na+ 、Mo6+ 、Co2+等。有机化合物NAD，NADP，FAD，生物素，卟啉等辅酶 coenzyme与酶蛋白结合较松，可透析除去。辅基 prosthetic group与酶蛋白结合较紧主要 辅酶和辅基的差别仅仅是它们与酶蛋白结合的牢固程度不同，并无严格的界限。 null酶蛋白决定酶促反应的专一性（特异性）辅助因子决定酶促反应的类型和性质，在反应中主要起着传递氢、电子、原子或化学基团的作用。生物体内酶的种类很多，但辅助因子种类很少， 一种辅助因子可与多种酶蛋白结合。NAD+构成各种专一性强的乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶。null酶的一些辅助因子null金属离子的功能: 组成酶的活性中心； 是连接底物和酶分子的桥梁； 参与催化反应，传递电子； 稳定酶分子的构象； 正电荷可中和底物的阴离子，降低反应中的静电斥力等。 小分子有机化合物的功能： 在反应中起运载体的作用，传递电子、质子或其他基团。null 牛胰RNase 124a.a 单链 鸡卵清溶菌酶 129a.a 单链 胰凝乳蛋白酶 三条肽链三、酶的存在形式1、单体酶由一条或多条共价相连的肽链组成的酶分子。例null2、寡聚酶含相同亚基的寡聚酶苹果酸脱氢酶（鼠肝），含2个相同的亚基。含不同亚基的寡聚酶琥珀酸脱氢酶（牛心），含αβ2个亚基 寡聚酶中亚基的聚合，有的与酶的专一性有关，有的与酶活性中心形成有关，有的与酶的调节性能有关。 大多数寡聚酶是胞内酶，而胞外酶一般是单体酶。null 大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合体由三种酶组成： ①丙酮酸脱氢酶（E1） 以二聚体存在 2×9600 ②二氢硫辛酸转乙酰基酶（E2） 70000 ③二氢硫辛酸脱氢酶（E3） 以二聚体存在 2×56000   12个E1 二聚体 24×96000 24个E2 单体 24×70000 总分子量：560万 6个E3 二聚体 12×56000 3、多酶复合体多酶复合体由两个或两个以上的酶，靠非共价键结合而成，其中每一个酶催化一个反应，所有反应依次进行，构成一个代谢途径或代谢途径的一部分。例null 该酶是四聚体α4，每条肽链含两个活性区域：N-端区域是Asp激酶，C端区域是高Ser脱氢酶。4、多酶融合体（多功能酶/串联酶）某些多酶体系在进化过程中，由于基因的融合，两种或两种以上不同催化活性的酶存在于一条多肽链上。天冬氨酸激酶I---高丝氨酸脱氢酶I融合体（双功能酶）四、酶的分子结构与催化活性四、酶的分子结构与催化活性（一）必需基团 (essential group) ——酶分子中氨基酸残基侧链的化学基团中，一些与酶活性密切相关的化学基团。（二）酶的活性中心（二）酶的活性中心概念：酶的活性中心是指酶分子结构中直接与底物结合，并使底物转化为产物的具有特定空间结构的区域。 酶活性中心是酶分子中具有三维结构的区域，或为裂缝，或为凹陷，深入到酶分子内部，常为氨基酸残基的疏水基团组成的。null 酶分子中存在的各种化学基团并不一定都与酶的活性有关。其中那些与酶的活性密切相关的基团做酶的必需基团(essential group)。 这些必需基团在一级结构上可能相距很远，但在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异地结合并将底物转化为产物。对于结合酶来说，辅酶或辅基参与酶活性中心的组成。null必需基团（essential group ）： ——与酶活性密切相关的基团必需基团（essential group ）： ——与酶活性密切相关的基团活性中心内的必需基团结合基团 (binding group) 与底物相结合催化基团 (catalytic group) 催化底物转变成产物 活性中心外的必需基团 位于活性中心以外，维持酶活性中心应有的空间构象所必需。 null——与酶的催化活性直接相关的化学基团 常见：His-咪唑基、Ser-OH、 Glu γ-COOH、Cys-SH、Asp-COOHnull结合部位（binding site）： 由有一定特性的基团组成，一定的底物靠此部位结合到酶分子上，此部位决定酶的专一性。 催化部位（catalytic site）：由一些参与催化反应的基团组成，起催化作用，底物分子中的化学键在此部位被打断或形成新键，从而发生一定的化学变化，此部位决定酶的催化高效性。nullnull糜蛋白酶结构nullnullnullnull（三）酶活性中心的共同特点: 活性中心只占酶分子总体积的很小一部分； 活性中心位于酶分子的一凹穴中,形成疏水区, 底物分子大 多结合在此处； 活性中心具有特定的三维结构； 酶和底物结合的专一性取决于活性中心原子的精细排列； 底物靠许多相当弱的键力与酶结合；五、  酶的分类及命名五、  酶的分类及命名1、习惯命名依据底物来命名蛋白酶、淀粉酶依据催化反应的性质命名水解酶、转氨酶结合上述两个原则命名琥珀酸脱氢酶加上酶的来源命名胃蛋白酶、牛胰凝乳蛋白酶null2、国际系统命名基本原则明确标明酶的底物及催化反应的性质。 （底物为水时可略去不写）谷丙转氨酶系统名称丙氨酸：α-酮戊二酸氨基转移酶习惯名称null国际系统分类法及编号（EC编号）（1）按反应性质分六大类，用1、2、3、4、5、6表示。 （2）根据底物中被作用的基团或键的特点，将每一大类分为若干个亚类，编号用1、2、3 。 （3）每个亚类又可分为若干个亚一亚类，用编号1、2、3表示。每一个酶的编号由4个数字组成，中间以“·”隔开。 （4）第一个数字表示大类 第二个数字表示亚类 第三个数字表示亚-亚类 第四个数字表示在亚-亚中的编号。null第一个数字表示大类： 氧化还原 第二个数字表示反应基团：醇基 第三个数字表示电子受体：NAD+或NADP+ 第四个数字表示此酶底物：乙醇，乳酸，苹果酸。 乙醇脱氢酶 EC 1.1.1.1 乳酸脱氢酶 EC 1.1.1.27苹果酸脱氢酶 EC 1.1.1.37null3、氧化还原酶类催化氧化还原反应A·2H+B=A+B·2H乳酸：NAD+氧化还原酶（EC 1.1.1.27） （乳酸脱氢酶）氧化酶类A·2H+O2=A=H2O22A·2H+O2=2A=2H2O2脱氢酶类葡萄糖氧化酶（EC 1.1.3.4）细胞色素C氧化酶（EC 1.9.3.1） null4、转移酶类AB+C=A+BC催化基团转移null淀粉酶、核酸酶、蛋白酶、脂酶、亮氨酸氨基肽水解酶5、水解酶类催化底物加水分解反应A-B+HOH=AOH+BHnull6、裂合酶类（裂解酶）催化从底物上移去一个基团或原子而形成双键的反应或其逆反应A·B=A+Bnull 7、异构酶催化同分异构体相互转化，即底物分子内基团或原子重排A=Bnull8、合成酶（连接酶） 催化一切必须与ATP分解相偶联、并由两种物质合成一种物质的反应。A+B+ATP=A·B+ADP+PiA+B+ATP=A·B+AMP+PPinull◆国际分类的盲区：忽略了酶的物种差异和组织差异SOD酶 （EC 1.15.1.1）2O2-+2H+→H2O2+O2  只有一个名称和编号已发现有三类不同的SOD：CuZn-SOD Mn-SOD Fe-SOD同是CuZn-SOD，来自牛红细胞与猪红细胞的，其一级结构也有很大不同。★所以在讨论一个具体的酶时，应对它的来源与名称一并加以说明。null六、酶的活力测定与分离纯化1、酶活力与酶促反应速度酶活力在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度（一般测初速度）。酶促反应速度单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。null 研究酶促反应速度，以酶促反应的初速度为准(底物消耗≤5%）。 null2、酶的活力单位（U）国际单位——IU单位（1961） 在最适反应条件下，每分钟催化1umol底物转化为产物所需的酶量，称一个国际单位（IU）。 1 IU = 1umol /min新国际单位——Katal（Kat）单位（1972） 在最适反应条件下，每秒钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量，称Kat单位 1Kat=60×106 IUnull酶反应的最适条件★最适温度（25℃或37 ℃） ★最适pH ★最适缓冲液离子强度 ★最适底物浓度底物浓度（1）通常很大，使酶饱和。 （2）底物消耗≤5%null其他酶单位定义方法限制性核酸内切酶有3种定义粘度法 30℃，1分钟，使底物DNA溶液的比粘度下降25%的酶量为1个酶单位。转化率法 5分钟使1ug供体DNA残留37%的转化活性所需的酶量为1个酶单位。凝胶电泳法 37℃，1小时，使1ugλDNA完全水解的酶量为1个酶单位。null酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标。3、酶的比活力 Specific activity每毫克酶蛋白所具有的酶活力。单 位定 义U / mg蛋白质其他定义：每毫升酶溶液或每毫克酶制剂所具有的酶活力。null  第一步总活力每一步总活力第一步比活力每一步比活力某种酶的分离纯化分4步进行例步骤 1 2 3 4 总活力（U） 6 4 3 2 总蛋白质（mg） 20 10 5 2 比活力（U/mg） 3/10 4/10 6/10 10/10酶的纯化倍数酶的回收率酶的提纯过程中，总蛋白减少，总活力减少，比活力增高。==nullnull 4、酶活力的测定方法分光光度法荧光法同位素法电化学法第二节   酶促反应动力学第二节   酶促反应动力学 酶促反应动力学研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素，包括底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂等。null 一级反应：反应速率只与反应物浓度的一次方成正比。 二级反应：反应速率与反应物浓度的二次方（或两种物质浓度的乘积）成正比。 零级反应：反应速率与反应物浓度无关而受它种因素影响而改变的反应。一、化学动力学基础（自己复习）1、反应速率及其测定2、反应分子数和反应级数3、各级反应的特征nullnull产 物0 时 间初速度 酶促反应速度逐渐降低 酶促反应的时间进展曲线null 在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。null随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。null当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。null当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应nullnull中间络合物学说证据null1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程(Michaelis equation)。[S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant) 2 米氏方程nullnullnullnullnullnullVmax=k3 [ES] =k3 [E] 当Km及Vmax已知时，根据米氏方程可确定酶反应速度与底物浓度的关系。 单体酶寡聚酶米氏常数最大反应速度null当[S]＜＜Km时][][][][maxmaxSKKSVSKSVVmm==+=当[S]＞＞Km时当[S]=Km时由此可以看出Km值的物理意义： Km值是当酶反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，单位mol/L。null Km是酶的特征常数之一，只与酶的性质、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。 Km只是对固定的底物、一定的pH、一定的温度而言。不同条件下具有不同的Km值。 不同的酶， Km不同； 同一种酶与不同的底物作用时， Km不同； 同一种酶与相同的底物作用时，作用条件不同（pH、温度及有无抑制剂等）， Km不同；3、Km的动力学参数意义nullnull 假设要求反应速度达到Vmax的90%，则底物浓度〔S〕为多少 ？ 若要求反应速度达到Vmax的x%，则〔S〕为： 〔S〕= ( x/100-x ) ×Km90% Km + 90% 〔S〕= 〔S〕 则〔S〕= 9 Km 90% Vmax=Km +〔S〕Vmax 〔S〕例解：null 可以根据所要求的速度，求出应加入底物的合理浓度，或根据底物浓度求反应速度，如： 例: 欲使 V=99%Vmax,其底物的浓度应为：欲使 V=90%Vmax ,其底物的浓度应为：nullnull8. Km和Vmax的求解方法（ 双倒数作图法）null蔗糖酶米氏常数（Km）的测定蔗糖酶米氏常数（Km）的测定1. 配12支蔗糖底物溶液，浓度分别为0、0.005、0.00625、0.0075、0.00875、0.010、0.0125、0.015、0.02、0.025、0.0375、0.050M，在35℃水浴保温； 2. 加入3U/ml已在35 ℃水浴保温的酶溶液，准确作用5分钟，终止反应； 3. 各吸取0.5ml反应液与3，5-二硝基水杨酸，沸水浴5分钟，冷却后在540nm测定吸光度OD值； 4. 作图null 米氏方程适用于单底物酶促反应，如异构、水解及部分裂合反应，不适用于多底物反应。9. 米氏方程只适用于单底物酶促反应nullVmax与K3（ Kcat）的意义 在一定的酶浓度下，Vmax是一个常数，它只与底物的种类及反应条件有关。Vmax=K3 [E] K3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分子数，称为转换数（或催化常数，Kcat）， 表明酶的最大催化效率。null三、  多底物的酶促反应动力学1、多底物酶促反应有 三种动力学机理★ 乒乓反应（Ping pong reactions） 或双-置换反应 （double-displacement reactions)★ 序列反应（sequential reactions） 或单-置换反应（single-displacement reactions）▲ 有序反应 Ordered reaction (ordered Bi Bi) ▲ 随机反应 Random reactions (random Bi Bi)null 只有Leading substrate (领先底物A)首先与酶结合，然后B才能与酶结合，形成的三元复合物EAB（ternary complex)转变为EPQ，B 的产物P先释放，A的产物Q后释放。2、有序反应机理 （ordered reactions,ordered Bi Bi)★在缺少A时，B不能与E结合。null★ A与其产物Q相互竞争地结合E。★ 反应的总方向决定于A、Q的浓度和反应的平衡常数。nullNAD+ 与NADH相互竞争E上的NAD结合部位null2、 随机反应机理（random reactions) (random Bi Bi ) 底物A、B与酶结合的顺序是随机的，形成的三元复合物AEB → QEP，产物P、Q的释放顺序也是随机的。nullB 与P相互竞争E上的底物结合部位B★ 反应的总方向决定于A、B、Q、P的浓度和反应的平衡常数。A+EAEAEBQEPE+BEBQEQ+EEPE+P(限速步骤)A与Q相互竞争E上的底物结合部位Anull糖原与小糖原竞争E上糖原结合部位， Pi与G-1-Pi竞争E上Pi结合部位。null3、乒乓反应机理 Ping pong reactions （double-displacement reactions) 底物A先与E结合成AE二元复合物，AE → PE’（修饰酶形式），释放第一个产物P，接着底物B与E’形成E’B，E’B →EQ，释放第二个产物QnullE★A与Q 竞争自由酶形式E ，B与P竞争修饰酶形式E’★整个反应历程中只有二元复合物形式，没有三元复合物形式EAEP E’E’E’BEQAPBQnull4、双底物反应的动力学方程乒乓机制的动力学方程KmA ：[B]达到饱和浓度时A的米氏常数 KmA’ ：A的表观米氏常数 Vmax ：[A][B]都达到饱和浓度时的最大反应速度null序列机制的底物动力学方程四、酶浓度对反应速率的影响四、酶浓度对反应速率的影响当[S]>>[E]，反应速度与酶浓度成正比。关系式为： V = K3 [E]null①影响酶蛋白构象，过酸或过碱会使酶变性。 ②影响酶和底物分子解离状态，尤其是酶活性中心的基团或维持其构象的基团的解离状态，从而影响ES的形成。 ③影响酶和底物分子中其他一些基团解离，这些基团的离子化状态影响酶的专一性及活性中心构象。 五、pH对酶促反应速度的影响1、 pH对酶活力的影响null2、酶的最适pH和稳定性pH最适pH：使酶促反应速度达到最大时的介质pH。 最适pH与底物种类、浓度及缓冲液成分有关。null ★虽然大部分酶的pH—酶活曲线是钟形，但也有半钟形甚至直线形。null六、温度对酶促反应速度的影响1、酶的最适温度及影响因素温度对酶促反应速度的影响有两个方面：①温度影响反应体系中的活化分子数：温度增加，活化分子数量增多，反应速度加快。 ②温度影响酶的活性：过高的温度使酶变性失活，反应速度下降。温度系数Q10温度升高10℃，反应速度与原来的反应速度之比。大多数酶的Q10一般为1~2。null温血动物酶的最适温度为35℃—40℃植物酶的最适温度为40℃—50℃细菌Taq DNA聚合酶的最适温度为70℃ 最适温度不是酶的特征常数，一种酶的最适温度不是一成不变的，它与酶的纯度、底物种类、作用时间、pH、离子强度等因素有关。最适温度酶促反应速率达到最大值的温度。null酶促反应温度与反应速率的关系null2、酶的稳定性温度 在某一时间范围内，酶活性不降低的最高温度称该酶的稳定性温度。酶浓度高、不纯、有底物、抑制剂和保护剂会使稳定性温度增高。null七、  激活剂对酶促反应速度的影响凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。必须激活剂：激活剂与酶结合后酶才有活性； 非必须激活剂：激活剂与酶结合使酶活性由弱变强。null★不同的离子激活不同的酶。 ★不同离子之间有拮抗作用和可替代作用，如Na+与K+、Mg+与Ca+之间常常拮抗，但Mg+与Zn+常可替代。 ★ 激活剂的浓度要适中，过高往往有抑制作用，通常在1~50mM的范围之内。1、无机离子的激活作用（1）金属离子：K+ 、Na+、Mg2+ 、Zn2+、Fe 2+ 、Ca2+ （2）阴离子：Cl-、Br -、PO43- （3）氢离子null①还原剂（如Cys、还原型谷胱甘肽）能激活某些活性中心含有—SH的酶。 ②金属螯合剂（EDTA）能去除酶中重金属离子，解除抑制作用。3、蛋白酶对酶原的激活2、简单有机分子的激活作用null 可使酶活力下降或丧失但并不引起酶蛋白变性。抑制剂有不同程度的选择性。八、抑制剂对酶促反应速度的影响变性作用(denaturation)变性剂通过使酶蛋白变性而失去活性，变性剂没有选择性。抑制作用(inhibiton)null（1）为药物作用机理和抑制剂型药物的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 与开发 提供理论依据。 （2）进行人为调控或代谢控制发酵。 （3）酶工程和化学修饰酶、酶工业的基础。研究抑制剂对酶的作用有重大的意义研究抑制剂对酶的作用是研究酶的结构与功能、酶的催化机制以及阐明代谢途径的基本手段。null抑 制 率相对活力1、抑制程度的两种表示方法加入抑制剂后的反应速率加入抑制剂前的反应速率null 抑制剂与酶活性中心（外）的必需基团共价结合，使酶的活性下降，无法用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活。2、抑制作用的类型不可逆的抑制作用可逆的抑制作用 抑制剂与酶蛋白非共价结合，可以用透折、超滤等物理方法除去抑制剂而使 酶复活。（一）不可逆性抑制剂（一）不可逆性抑制剂 抑制剂通常与酶活性中心的必需基团以共价键形式相结合，使酶失活，不能用透析、超滤等方法予以除去。 多为剧毒物质： 重金属、有机磷、有机汞、有机砷、 氰化物、青霉素、毒鼠强等。 * 举例：有机磷化合物 (专一性)  羟基酶 (胆碱酯酶) 　　解毒用解磷定(PAM) 重金属离子及砷化物 (非专一性)  巯基酶 　　解毒用二巯基丙醇(BAL) 　　　有机磷化合物对羟基酶的抑制 专一性不可逆抑制剂（作用于某一种酶的活性部位基团）null路易士气失活的酶巯基酶失活的酶酸BAL巯基酶BAL与砷剂结合物 非专一性不可逆抑制剂（作用于一/几类基团）（二）可逆性抑制剂（二）可逆性抑制剂  抑制剂具有与底物类似的结构，竞争酶的活性中心，并与酶形成可逆的EI复合物，阻止底物与酶结合。 可以通过增加底物浓度而解除此种抑制。竞争性抑制（Competitive inhibition）nullnull 蝶呤 对氨基苯甲酸 Glu 二氢叶酸合成酶 二氢叶酸 四氢叶酸 嘌呤核苷酸 一碳单位磺胺类药物磺胺类药物的抗菌机理null 对氨基苯磺酰胺是对氨基苯甲酸的类似物， 竞争性抑制二氢叶酸合成酶的活性。null 底物和抑制剂可以同时与酶结合，但是，中间的三元复合物ESI不能进一步分解为产物，因此，酶的活性降低。 抑制剂与酶活性中的以外的基团结合，其结构可能与底物无关。 不能通过增加底物的浓度的办法来消除非竞争性抑制作用。某些重金属离子对酶的抑制属于非竞争性抑制：Cu2+、Hg2+、Pb2+非竞争性抑制nullnull常见于多底物的酶促反应中。反竞争性抑制酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。E+S→ES+I →ESI≠ Pnullnullnull1、通过透析、超滤、凝胶过滤等。 2、通过V-E速度曲线。 3、通过可逆抑制剂的动力学曲线可以区分三种可逆抑制作用。3、可逆抑制作用与不可逆抑制作用的鉴别null相对活力抑制分数动力学方程（Ki为EI的解离常数）★抑制程度决定于[I]、[S]、Km和Ki4、可逆抑制作用的动力学竞 争 性 抑 制null[Et]=[E]+[ES]+[EI]null★Vmax不变 ★Km变大，而且随[I]浓度的增大而增大null（1） Vmax不变，Km变大。 （2） 抑制程度取决于[I]、[S]、Km和Ki A. [I]不变，增加[S]，减小抑制程度。 B. [S]不变，增加[I]，增大抑制程度。 C. [I]和[S]不变，Ki越大，抑制作用越小。 D. [I]和[S]不变，Km值越低，抑制程度越小。 E. [I]=Ki时，双倒数图中直线的斜率加倍。 竞争性抑制作用null非 竞 争 性 抑 制相对活力抑制分数★抑制程度决定于[I]和Ki ，与底物的Km和[S]无关动力学方程null[Et] = [E] + [ES] + [EI] + [ESI]null★Km不变，Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki）非竞争性抑制非竞争性抑制（1） Km不变，Vmax降至Vmax/（1+[I]/Ki）。 （2）抑制程度去决于[I]和Ki ，与酶的Km和[S]无关。 （3）定[I]和[S]不变， Ki越大，抑制作用越小。null反 竞 争 性 抑 制相对活力抑制分数动力学方程★抑制程度决定于Km、Ki、[S]、[I]null[Et] = [E] + [ES] + [ESI]null★Km及Vmax都变小nullnull 与酶的活性中心以及活性中心外的某一类或几类必需基团反应。5、一些重要的抑制剂不 可 逆 抑 制 剂非专一性不可逆抑制剂有机磷的酰化物有机汞 有机砷化合物专一性不可逆抑制剂重金属烷化物氰化物 硫化物 CO青霉素还原剂亲电试剂亲和标记试剂 亲合修饰试剂 此类抑制剂仅仅和某一种酶的活性部位的必需基团反应。自杀性底物null抑制机理：与蛋白酶及酯酶活性中心Ser的—OH形成磷脂键。 毒理：强烈抑制乙酰胆碱脂酶（神经毒剂）。    解毒剂：PAM（解磷定）可以把酶上的磷酰基团除去。有机磷的酰化物二异丙基磷酰氟（DFP，神经毒气）和许多有机磷农药null抑制机理：使酶的巯基烷化   毒理：主要与还原型硫辛酸辅酶反应，抑制丙酮酸氧化酶系统。 解毒剂：二巯基丙醇（BAL）、Cys、GSH等过量的巯基化合物。有机汞、有机砷化合物对氯汞苯甲酸（PCMB）null与含铁卟啉的酶中的Fe2+结合，阻抑细胞呼吸重金属Ag、Cu、Hg、Cd、Pb能使大多数酶失活，EDTA可解除。烷化物 含卤素的烷化物（碘乙酸、碘乙酰胺、卤乙酰苯等）常用于鉴定酶中巯基。氰化物、硫化物、COnull青霉素不可逆抑制糖肽转肽酶还原剂巯基乙醇、二硫苏糖醇等巯基试剂还原酶的二硫键含活泼双键试剂Ｎ—乙基顺丁烯二酰亚胺等，可与—ＳＨ、—ＮＨ２反应。亲电试剂四硝基甲烷，可使Tyr硝基化。null 具有与底物相似的结构，同时还带有一个能与酶活性中心或活性中心外的必需基团进行化学反应的活泼基团。 专一性程度取决于它与活性中心及活性中心外的的Ks之比。Ks型不可逆抑制剂亲和标记试剂 亲合修饰试剂null 具有与底物相似的结构，不仅能与酶结合，而且潜伏的反应基团（latent reactive group）能被酶催化而活化，并与酶活性中心必需基团进行不可逆结合。Kcat型不可逆抑制剂自杀性底物 （suicide substrate）null 单胺氧化酶能氧化某些血管舒张剂（如组胺），引起高血压。 炔类化合物（迫降灵）是以FMN、FAD为辅基的单胺氧化酶的Kcat型不可逆抑制剂。 由于迫降灵是一种单胺氧化酶的自杀性底物，因而能抑制一些血管舒张剂（如组胺）的氧化，降低血压。举例null可 逆 抑 制 剂竞争性抑制剂 是最常见的一种可逆抑制剂。抑制剂（I）和底物（S）竞争酶的结合部位，从而影响了底物与酶的正常结合。非竞争性抑制剂 这类抑制剂的特点是：底物（S）和抑制剂（I）同时与酶结合，两者没有竞争作用，酶与抑制剂结合后，还可以与底物结合。同样，酶与底物结合后，还可以与抑制剂结合，但是中间的三元复合物不能进一步分解为产物，因此酶活力降低。反竞争性抑制剂酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。常见于多底物反应中。null 5-氟尿嘧啶 许多代谢类似物都是竞争性抑制剂，可用作抗菌药和抗癌药物。★抗癌药氨基叶酸阿拉伯糖胞苷竞争性抑制剂null 对氨基苯磺酰胺或其衍生物或对氨基苯甲酸的结构类似物，竞争性抑制细菌的二氢叶酸合成酶活性。磺胺类药物及其作用机理举例null蝶呤 对氨基苯甲酸 Glu二氢叶酸合成酶二氢叶酸四氢叶酸嘌呤核苷酸二氢叶酸还原酶磺胺类药物磺胺类药物的抗菌机理：TMPnullKcat型不可逆抑制剂的专一性程度很强，前景广阔。 底物类似物型的竞争性抑制剂最易开发。 过度态底物类似物型药物最具价值(高效\特异)抑制剂与药物开发null传统观点认为：酶是水溶性生物大分子，只能在水介质中进行催化反应，有机介质会使酶变性。其实在细胞中，许多生物膜上的酶就是在低极性的微环境中发挥催化功能的。 优点： ①利于疏水性底物的反应。 ②可提高酶的热稳定性，提高催化温度。 ③能催化在水中不能进行的反应。 ④可改变反应平衡移动方向。 ⑤可控制底物专一性。 ⑥防止由水引起的副反应。 ⑦可扩大pH值的适应性等等。八、  有机介质中的酶促反应null1、有机介质中酶促反应的条件水（结合水、束缚水）脂肪酶：几个水分子/每个酶分子 胰凝乳蛋白酶：50个水分子/每个酶分子 乙醇脱氢酶：几百个水分子/每个酶分子 可把有机介质中酶促反应理解为宏观上是在有机介质中，而在微观上仍是水中的酶促反应。对酶的要求具有对抗有机介质变性的能力。合适的溶剂及反应体系合适的pHnulla. 升高活性 b. 降低活性 c. 酶的超活性：高于水溶液中酶活性值的活性。2、有机介质对酶性质的影响对酶稳定性的影响a. 热稳定性提高 猪胰脂肪酶在醇和酯中进行催化反应，在100℃半衰期长达12h，其活性比25℃时还高几倍 b. 储存稳定性提高 胰凝乳蛋白酶在20℃时，在水中半衰期只几天。在辛烷中，可放6个月，仍保持全部活性。对酶活性的影响null 有机介质能改变某些酶催化的反应平衡。 例如：水解酶类（蛋白水解酶） 在水介质中，水的浓度为55.5mol/L，平衡趋向水解方向， 在含水量极低的有机介质中，平衡向含成方向偏移。 酶 合成产物 溶剂 合成收率 枯草杆菌蛋白酶 核糖核酸酶 甘油90% 50% 无色杆菌蛋白酶 胰岛素 乙醇30% 80% 凝血酶 人生长素 甘油80% 20% 对酶专一性的影响脂肪酶在有机介质中才有合成肽键的功能。对酶促反应平衡的影响第三节 酶的作用机理第三节 酶的作用机理 null一、酶专一性的机理1、 酶专一性类型结构 专一性相对专一性基团专一性绝对专一性键专一性立体异构 专一性几何异构专一性旋光异构专一性null 立体化学专一性还表现在酶能催化对称分子中的两个等同基团中的一个，而对另一个无作用。 顺-乌头酸酶只催化柠檬酸两个-CH2COOH中的一个。null绝对专一性： 只能作用于一个底物，或只催化一个反应。 麦芽糖酶只作用于麦芽糖，脲酶只催化尿素水解。键专一性： 仅对底物中的化学键有专一性要求，对底物结构要求最低。 ★基团专一性Group Specificity： 不仅对键有要求，还对键一端的基团有要求，但对另一端基团要求不严格。null 酶活性中心的形状与底物分子形状互补。 底物分子或其一部分像钥匙一样，专一地插入酶活性中心，通过多个结合位点的结合，形成酶—底物复合物。 酶活性中心的催化基团正好对准底物的有关敏感键，进行催化反应。2、 酶作用专一性的解释锁钥模型(lock-key hypothesis)null 酶分子与底物分子接近时，酶蛋白质受底物分子诱导，构象发生有利于与底物结合的变化，酶与底物在此基础上互补楔合，进行反应。诱导楔合模型(induced-fit hypothesis)null二、  酶促反应高效性的机理 1、邻近与定向效应 （变分子间反应为分子内反应） 2、形变与张力3、酸碱催化4、共价催化5、金属离子的催化效应6、微环境效应null酶与底物之间存在较高的亲和力，底物向酶活性中心靠近，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的效应。邻近效应定向效应 底物的反应基团之间、酶的催化基团与底物的反应基团之间形成正确的定向排序，有利于形成中间产物，降低反应活化能，从而提高反应速度的效应。 酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。null①使底物浓度在活性中心附近很高。   ②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用。   ③酶使分子间反应转变成分子内反应。 ④邻近效应和定向效应对底物起固定作用。 邻近效应与定向效应对反应速度的影响nullApproximation and orientation 邻近与定向效应Approximation and orientation 邻近与定向效应null2、底物形变和诱导契合的催化效应①酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。 ②底物形变，利于形成ES复合物。 ③底物构象变化，形成过渡态结构，大大降低活化能。酶与底物结合时，酶的构象会发生变化，酶分子构象变化可对底物产生张力，使底物分子中的敏感键产生张力或变形，使敏感键更易于破裂。 3、酸碱催化3、酸碱催化null⑴酸碱强度(pK值）。组氨酸咪唑基的解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。 ⑵给出质子或结合质子的速度。咪唑基最快，半寿期小于10-10秒影响酸碱催化反应速度的两个因素：酶活性中心的氨基、羧基、巯基和咪唑基等都可作为质子的供体或受体对底物进行催化。其中咪唑基的解离常数为6.0，在中性条件下可作为质子供体或质子受体，它常和其他活性氨基酸残基如Asp、Ser等一起构成电荷转接系统。nullnullnull 酶作为亲核基团或亲电基团，对底物进行亲核或亲电攻击反应，形成一个反应活性很高的不稳定的ES复合物，释放电子，形成共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程。酶亲核基团： Ser-OH，Cys-SH，His-N： 底物亲电中心： 磷酰基（-P=O），酰基（-C=O），糖基（Glu-C-OH）4、   共价催化null金属离子以下列途径参加催化过程： （1）通过结合底物为反应定向； （2）通过自身价数的改变参加氧化还原反应； （3）屏蔽底物或酶活性中心的负电荷。5、金属离子的催化作用根据金属离子-蛋白质相互作用强度可将需要金属的酶分为两类：金属酶（metalloenzyme) 含紧密结合的金属离子，多属于过渡金属离子，如Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+金属-激活酶（metal-activated enzyme) 含松散结合的金属离子，通常为碱和碱土金属离子，如：Na+、K+、Mg2+、Ca2+nullCa2+ 依赖性 蛋白激酶（PKC)金属离子催化nullnull6、 活性中心的微环境疏水环境一般酶的活性中心穴内是一个相对的非极性区，因此酶的催化基团被低介电环境包围，底物分子的敏感键和酶的催化基团之间就会有很大的反应力，加速酶反应。 电荷环境在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子。nullnull 该酶需要底物有一个疏水基团，定位结合于酶上的疏水部位，使底物敏感键对准酶的催化基团。 疏水定位基团：Phe、Tyr、Trp 四、酶作用机理举例1.胰凝乳蛋白酶的作用机理（1）专一性胰凝乳蛋白酶的底物专一性胰凝乳蛋白酶的底物专一性null 胰凝乳蛋白酶--芳香环、大的非极性脂肪族侧链 胰蛋白酶--带正电荷的Lys、Arg进入 弹性蛋白酶--Ala等小分子非极性侧链进入三种胰脏中的蛋白酶的底物结合部位 p408 null ① 活性中心-催化三联体 Asp102—His57—Ser195氢键体系。 His57的咪唑基桥梁。 通过电荷中继网进行酸碱催化及共价催化。 Ser195成为亲核基团，它是活性中心的底物结合部位，His57是活性中心的催化部位。（2）催化机理nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull第四节 多酶体系与酶活性的调节第四节 多酶体系与酶活性的调节null一、  多酶体系多酶体系 在完整细胞内的某一代谢途径中，由几个酶形成的反应链体系。null（1）第一步反应往往是限速步骤，控制着全部反应序列的总速度。 （2）反馈抑制与前馈激活 催化第一步反应的酶，大多都是别构酶，能被全部反应序列的最终产物所抑制， 有的则是反应序列分叉处的酶受到最终产物的抑制，称为反馈抑制；有的被底物激活多酶体系具有自我调节能力null二、  酶活性的调节活性可被调节的酶，主要是别构酶和共价修饰酶。调节酶（1）酶浓度/含量调节（缓慢调节）： 酶的诱导与阻遏、酶的选择性降解。 （2）酶活性调节（快速调节）： 反馈抑制、抑制剂与激活剂的调节、别构调节、可逆的共价修饰、酶原激活、同工酶形式的调节、激素及特异调控蛋白对酶活性的调节。调节对象酶促反应过程中的关键酶null 某些化合物与酶分子中的活性中心以外的部位可逆地非共价结合后，诱导酶分子的构象发生改变，从而调节酶催化活性的酶调控方式。具有别构调节方式的酶叫别构酶（变构酶）。 1、别构调控null天冬氨酸转氨甲酰酶正协同效应的别构酶 （aspartate transcarbamylase , ATCase）3-磷酸甘油醛脱氢酶负协同效应的别构酶（phosphoglyceraldehyde dehydrogenase )null（1） 已知的别构酶都是寡聚酶，通过次级键结合 （2）具有活性中心和别构中心（调节中心），活性中心和别构中心处在不同的亚基上或同一亚基的不同部位上。 （3）多数别构酶不止一个活性中心，活性中心间有同位效应，底物就是调节物：有的别构酶不止一个别构中心，可以接受不同的代谢物的调节。 （4）不遵循米式方程，动力学曲线是S型（正协同效应）或表观双曲线（负协同效应）。2、 别构酶的结构特点和性质null别构酶具有协同效应，正协同－S曲线，负协同－双曲线。1、非别构酶2、正协同3、负协同null 正调节物与酶结合后，酶构象的变化有利于底物分子与酶结合，使酶促反应速度依赖于底物浓度的变化更为敏感。正调节物使S型曲线左移，饱和量的正调节物可将S形曲线转变为双曲线。 负调节物与变构酶结合后，不利于随后的酶与底物的结合，使酶促反应速度依赖于底物浓度不敏感，而且很难达到最大反应速度。负调节物使S形曲线右移。 如ATP是磷酸果糖激酶的变构抑制剂；ADP、AMP为其变构激活剂。null④生理意义 在变构酶的S形曲线中,底物浓度稍有升高，则酶活性迅速上升，使得酶对底物浓度变化非常敏感，因此可以快速调节细胞内底物浓度和代谢速度。 负调节物常是代谢途径的终产物，变构酶常处于代谢通路的开端，通过反馈抑制，可以及早地调节整个代谢通路，减少不必要的底物消耗。null 例如葡萄糖的氧化分解可提供能量使AMP、ADP转变成ATP，当ATP过多时，通过变构调节酶的活性，可限制葡萄糖的分解，而ADP、AMP增多时，则可促进糖的分解。随时调节ATP/ADP的水平，可以维持细胞内能量的正常供应。 null酶分子中亚基结合底物后，构象逐个地依次变化。3、别构酶调节活性的机理序变模型null齐变模型有利于正调节物的结合有利于负调节物的结合null酶原 (zymogen) 有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。 酶原的激活 在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。4、 酶原的激活酶原的激活具有不可逆性null 酶原激活的机理null胰蛋白酶原的激活过程null 酶原激活的生理意义避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。 有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。null 酶蛋白肽链上的某些基团可在另一种酶的催化下，与某些化学基团发生可逆的共价结合，引起酶分子结构改变而影响酶的活性称为共价修饰(covalent modification)，也称为化学修饰（chemical modification）。 5、 酶的共价修饰调节null酶的可逆的共价修饰包括： 磷酸化和去磷酸化（phosphorylation or dephosphorylation）； 甲基化和去甲基化(methylation anddemethylation )； 腺苷化和去腺苷化(adenylation and deadenylation )； 尿苷化和去尿苷化(uridylation and deuridylation) ADP-核糖化和去ADP-核糖化(ADP ribosylation or deribosylation)等方式。null null酶的共价修饰的特点： ①酶有高（有）或低（无）活性两种形式，共价修饰可使两种形式互变。 ②酶分子出现共价键的变化，从而使酶结构改变影响活性。 ③蛋白质磷酸化需ATP提供磷酸，即酶蛋白每个磷酸化位点磷酸化需要消耗一个 ATP的高能磷酸键，是耗能反应。 ④共价修饰是酶促反应，一分子酶可催化许多其它酶蛋白发生磷酸化，因此有放大效应（级联效应 cascade）。 ⑤有些酶具有别构与化学修饰双重调节。 null表5-5 经化学修饰调节的一些酶 酶 修饰方式 活性变化 糖原磷酸化酶 磷酸化/去磷酸化 ↑/↓ 磷酸化酶激酶 磷酸化/去磷酸化 ↑/↓ 糖原合酶 磷酸化/去磷酸化 ↓/↑ 丙酮酸脱氢酶 磷酸化/去磷酸化 ↓/↑ 激素敏感性酯酶 磷酸化/去磷酸化 ↑/↓ 己酰CoA羧化酶 磷酸化/去磷酸化 ↑/↓ null蛋白质的磷酸化与去磷酸化修饰 （1）由磷酸化酶催化：消耗Pi，如糖原磷酸化酶 （2）由蛋白激酶与蛋白磷酸酶催化：消耗ATP，Mg2+参与 激酶：将ATP上的Pi转移到底物上的转移酶类（蛋白激酶、己糖激酶、丙酮酸激酶等） 蛋白激酶的磷酸化位点： （1）Ser、Thr、Tyr、Asp、Glu的-OH （2）Lys、Arg、His的侧链-NH2null糖原磷酸化酶  信号的级联放大： 1分子磷酸化酶激酶，活化生成几千个磷酶化酶a 1分子磷酸化酶a，催化生成几千个1-P-G6、酶含量的调节6、酶含量的调节（1）酶蛋白合成的诱导和阻遏 诱导作用(induction) 阻遏作用(repression) （2）酶降解的调控null第五节 同工酶与同工酶技术null一、同工酶 能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构、理化性质乃至免疫学性质存在明显不同的一组酶，存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织中，甚至同一组织、同一细胞中。同工酶是研究代谢调节、分子遗传、生物进化、个体发育、细胞分化和癌变的重要工具，在酶学、生物学以及医学中占有重要地位。null哺乳动物有5种： MMMM （M4） ：在骨骼肌中占优势 HMMM （M3H