糖化酵母糖化酶基因在酿酒酵母中的克隆与表达

一 食品与发酵工业≥ 糖化酵母糖化酶基因在酿酒酵母中的克隆与 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达 文立 民 L／／ 于松涛 李 浩 赵大健 — 生物系) 厶 摘 要：糖化酵母结掏基因STA编码分泌到胞外的葡萄糖淀粉酶【n—l·4-葡聚糖一葡糖木解酶，EC3·!l· l 3)，俗称糖化酶。通过限制性内切酶 Sau3A部分酶切糖化酵母染色体 ，以穿梭质粒 YEP13作载体，建立糖化酵 母 的基因文库，转化 $UD inh。型酿酒酵母受体菌 C ，筛选 出三株 咖 转化子，检测出 5．3kb太小的外源基因片 段，继而采用薄层层析、K_'NR染料测酶活性等方法对外源基因产物进行了鉴定并测定 了酶活最佳反应条件 关键词：糖化酵母，里 ! 塑，糖化酶’曼竺，毽丝匿基臣 由于酿酒酵母(＆ 0∞ cere-dsi~)缺 乏分解淀粉所必需的淀粉酶一 ，因此在发酵 过程 中淀粉需经蒸煮．a一淀粉酶液化处理和 随后的酸解或酶解(糖化酶)糖化过程使其变 成葡萄糖后才能被酵母利用。所以构建直接 分解淀粉的酿酒酵母将减少对淀粉水解酶或 大麦麦芽的需求，增强淀粉转化效率，促进以 淀粉来替代糖蜜生产各类酵母产品，简化加 工步骤及设备．降低能源消耗 。葡萄糖淀粉酶 (口1．4葡聚糖一葡糖水解酶，EC3．2．1．3)俗 称糖化酶，是一种从淀粉或葡糖原的非还原 性末端水解葡萄糖基问的糖苷键生成 葡 萄糖 的外切酶[ 。目前 已鉴定 出 STA1、 STA2、STA3三个不连锁的糖化酶结构基因． 分别控制糖化酶的三个同功酶 (】、I、Ⅱ)的 合成 与酿酒酵母亲缘关系很近的糖化酵母 (Sa：'ctca~nbces )由于在营养繁殖时期 能分泌糖化酶而能利用淀粉或糊精 ，但使用 这些菌株生产的啤酒具有浓重的令人不快的 酚醛气味[ 。又因为酿酒酵母独特地携带丁 阻止糖化酶产生 的抑制基因(INH])[ ．因此 应选用糖化酶抑制基因缺陷型(inh。)的酿酒 酵母为受体菌。本文从糖化酵母基因文库中 克隆到了三株具有糖化酶活性的菌株 ．通过 硅胶薄层层析对酶解产物作了 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ．采用了 检测糖化酶活性的新方法一 恨 偶联染 料法。。]，测定了酶活最佳反应条件，为生产低 热值啤酒和廉价的动力酒精提供了极具潜力 的生产菌株。 菌) 菌) 养。 材 料 与 方 法 一 、 实验材料 1．菌种、质粒、噬菌体 E co／／HB101(用于建立基因文库的受体 糖化酵母 Y26O67(糖 化酶 基因的供体 酿酒酵母 C?(sta。inh。型受体菌) YEP13(穿梭质粒，Amt：eTer ．Leu ) 枯草杆菌噬菌体 Sppl(用于分子量标iff) 2．培养基 · LB培养基 ：用于细菌培养。 酵母完全培养基 YEPD：用于酵母菌培 一 维普资讯 http://www.cqvip.com 无氨基酸 的氮基础培养基 YHB (nA： 用于筛选酵母转化子 酵母淀粉培养基 YEPS：用于筛选糖化酶 阳性酵母菌株。 3．酶和试剂 限制 性 核 酸 内切 酶、tDNA连 接 酶、 R 、碱 性磷酸酶、溶菌酶、蜗牛酶 、蛋白酶 K均购白华美生物工程公司和中国医科院基 础所；标准糖化酶购 自Sigma公司；硅胶板购 自Merck公司；活性艳蓝染料 ICXVR购白天津 染化八厂；其它试剂为国产分析纯和进口分 装，水为无离子双蒸水。 二、实验方法 1．DNA的制备 (1)细菌质粒 DNA的大量提取 (2)细菌质粒 DNA的小量快速提取 (3)酵母质粒 DNA的提取 (4)酵母染色体 DNA的提取 (5)酵母全 DNA的提取 2．DNA的回收、纯化及定量测定 3．DNA的酶切、连接和转化 (1)糖 化酵 母 染色 体 DNA 的部 分 酶 切 。 (2)YL3：'I3载体的酶切、去磷酸化、连接 反应 。 (3)遗传转化 a．氯化钙法转化 E HB101 。 b．酵母完整细胞快速高效转化法 4．转化子的鉴定 (1】转化子 的筛选0一 将菌落点接在含 I 淀粉或糊精的酵母 培养基上．28C培养 5～7天、用碘蒸气熏 ．在 菌落周围出现透明圈者为糖化酶阳性菌落， 亦可将菌落长成后的平板置于 4 C冰箱 I～2 天．阳性菌落周围可出现透明圈。 (2)转化子质粒拷贝数的测定 【3)转 化子质粒稳定性的测定 5．糖化酶的鉴定 (13糖化酶的提取和纯化 ] (2)酶活力测定B (3)硅 胶 薄 层 层 析 分 析 酶 的水 解 产 物 。 6．糖化酶反应动力学测定 采用淀粉偶联染料 KNR作色源底物的 糖化酶活力比色测定系统，分别测定时间、温 度、底物浓度和 pH值对酶活的影响。 实 验 结 果 一 、糖化酵母基目文库的建立和糖化酶 阳性菌落的检出 图 i． 糖化酵母染色体的部分酶切 (0．8 琼脂糖凝胶电泳 ) l：未经酶切的染色体 DNA； 2和 11：Sppl／EcoRI 3～l0：不同单位Sau3A酶切染色体 nNA 糖化酵母染色体 DNA经 Sau3A部分酶 切后，用琼脂糖凝胶电泳法制各大干 5kb的 DNA 片段 作 为供 体 DNA，载 体 Ⅵ l3用 Bam}Ⅱ完全酶切 ，产生与供体 DNA相匹配的 粘性末端，经纯化，以供体和载体 3：1混合 DNA，1 2 c过夜连接 。重组质粒首先转化 E co／i HBJ01．筛选 ．&,np'Tev的转化子，作 为糖 化 酵母的基 因文库．共得到约 20．000个克 隆 ．经过在 E．t伽 中的扩增 ．再转化酿酒酵母 受体菌c!．筛选到 Leu 转化子约 3．000个， 维普资讯 http://www.cqvip.com 最后点接这些转化子于含淀粉的酵母培养基 土一用碘蒸气熏板．最终获得三株能形成水解 圈的转化子(见附图 1—2．3) 图 2． 三个转化子与供体在糊精培养基上 碘 熏所得的水解圈 l：供体 2～ ：转化子 圈 3． 三个转化子 与供体在淀粉培养基上 {C放置 l～2天后所得的水解圈 l：供体 2～4：转化子 二、糖化酶基因的分析 提取 STA转化子的重组质粒．用 Sau3A 酶 切一得到 一个 5．3kb的插入片段(见附图 4) 圈 4． 转化子重组质粒酶切电泳结果 l Spp]／F．．coRI 2：转化子重组质粒／Sau3A 3：YEP13／BamH] 三、糖化酶在酿酒酵母中的表达 根据淀粉偶联染料 KNR作色源底物 的 糖化酶活力比色测定系统一分别提取和纯化 供体株 Y26067和转化子 的糖化酶， 供体 株的 OD值为 100 ，测定转化子的相对酶 活( )。 四、糖化酶水解淀粉产物的分析 分别提取纯化转化子和供体株的糖化 酶．在 2ral底物浓度为 6 的底物中加酶 0．5ral，50 CpH4～6反应 30rain，同时以适当 稀释的标准糖化酶进行同样的反应一将它们 的终产物上样进行硅腕薄层层析分析 ．并以 标准葡萄糖和麦芽糖作对照。结果表明，转化 子与供体株水解淀粉终产物完全相同，都是 葡萄糖 ．无其它中间产物(见附图5．6) 表 1．供体株与转化子的酶活测定 菌 株 Y26067 转化子 l 转化子② 转化子@ )I]幽 0．32 0 28 l 0．25 0．26 相对酶活( ) l00 8 ． 78．1 I 81．3 维普资讯 http://www.cqvip.com 5 转化子与供体分解淀粉终产物的 硅胶薄层层析 l-转化子 2．供体 五、转化子质粒的拷贝数和稳定性 根据电泳结果的薄层扫描分析．经计算． 转化子质粒在酵母菌中的拷贝数为 22。转化 子质粒在酵母菌中的稳定性见表 2 表 2． 转化子培养 lO代后的稳定性 六、糖化酶反应动力学测定 (见 图 7，8， 9，10 J 在 如 C到 60 C之间．OD 吸收值明显 大 于其它，且 50C时 OD 值最大，为最适 酶反应温度。 1．时间 时间【min) lo l5 20 25 3o 3j 【m Bj 0．05 O．10 o l{ 0．18 0．2{ n．2,9 o．36 随着反应时间的延长，糖化酶水解淀粉的终产物增多。 2．温度 温度(C) 20 30 ∞ j0 6o 7o 8 (】n、 0．1o o 24 0 35 o 43 o．37 o．36 ll i 图 6． 水解淀粉终产物硅胶薄层层析 1．葡萄糖(1)麦芽糖(口)标准样 2．转化子 3供体4．标准糖化酶的水解产物 3．pH 在 pH4～6之 间．()nss 值明显大于其 它，且在pHj( s：值最大．为其最适 pH值。 4．底物浓度 从底物浓度 1 ～3 ，其 (m 值明显 增加．从 4 ～6 无明显变 化．说 明糖化酶 最适底物浓度在 4 ～6 之间。 维普资讯 http://www.cqvip.com 封 畔 汪 L_ 『车舯 (℃) [s]( ) 1 ． 酶活 ，』 物浓噬f}I『 淀粉发酵的速度直接与糖化酶的表达水 平相关一表达水平越高．发酵速率越快 对已 克隆到的糖化酶基因片段进行序列分析，进 一 步亚克隆，将其插入 高效表达载体中去 或多拷贝整合在宿主染色体基因组 中．对提 高基因表达水平和稳定性来说是一个重要方 面。目前构建的多数菌株利用糊精及淀粉的 能力是有限的，而且降解速度很慢．淀粉的快 速完全水解需要酵母菌能够同时产生 n一淀 粉酶、糖化酶和解支酶．使得淀粉的酶解产物 晟终为可发酵糖分子 那么外源淀粉酶基因 在酿酒酵母中需要多高的表达量．各种水解 酶需要怎样的组合才能得到令人满意的协同 糖化和发酵速率 ，以及较高的淀粉利用率．这 都需要进一步探讨。而且分泌大量的胞外酶 的菌株在其发酵特性和产品风味上是否受到 不利影响也需要观察。 参考文献 1] De Mot R． et al：Cr Lna} Reviews in 1 m c 。盯 、1987．5(3)．2I9～ 272 [2]Polaina J．；Current Genedcs．1983、7t1)、l 09 ～ 1I! 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