药理学实验方法学(讲稿)

nullnull西北农林科技大学 动物医学院 李引乾 2009.12药理学实验方法学 参考资料：参考资料：(1)中药药理实验方法学 (2)药理学实验方法 (3)定量药理学 (4)中国药典 (5)中国兽药典 (6)兽药质量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 (7)中国兽药信息网 (8)兽药试验技术规范汇编(农业部兽药评审委员会办公室) (9)生物统计学 第一章 药物含量测定第一章 药物含量测定(一) 测定方法的建立(一) 测定方法的建立　 根据不同的药物，建立不同的测定方法。 1.原子吸收法 (1)原子吸收法光谱的产生 任何元素的原子都由原子核和核外电子组成，核外电子有不同的能级，因此，一个原子核可以有不同的能级。能量最低的能级态，称为基态能级(E0=0)，其余的能级称为激发态能级，而能量最低的激发态称为第一激发态。 正常情况下，原子处于基态，核外电子在各自能量最低的轨道上运动。null 当原子吸收一定的能量时，该原子就会吸收一定特征波长的光，外层电子由基态跃迁到相应的激发态，产生原子吸收光谱。但激发态的电子是不稳定的，大约经过10～8 s以后，激发态的电子将返回基发态或其他较低能级，并将电子跃迁时所吸收的能量以光的形式释放出去，而产生原子发射光谱。null 核外电子从基态跃迁至第一激发态所吸收的谱线称为共振线吸收，简称共振线。而电子从第一激发态返回至基态所发射的谱线称为第一共振发射线。由于基态与第一激发态之间的能级最小，电子跃迁机率最大，故共振线最易产生。对多数元素来讲，它是所有谱线中最灵敏的，在原子吸收光谱分析中，通常以共振线为吸收线。 null (2)原子吸收光谱分析原理 原子吸收光谱分析的波长区域在紫外区。其原理是将光源辐射出的待测元素的特征光谱，通过样品的蒸气时，就会被待测元素的基态原子吸收，由发射光波被减弱的程度，进而求得样品中待测元素的含量，它符合郎珀-比尔定律： A=－lg I/I０= －lg T = kCL 式中I为透射光强度，I0为发射光强度，T为透射比，L为光通过原子化器的光程。由于L是不变值，所以A=KC。null 2.比色分析法 用比较溶液的颜色深度来确定被测定物质含量的方法，称为比色分析法。 光通过有色溶液时，由于溶液中有色物质吸收了一部分光能，透过光的强度就要减弱。溶液的浓度越高，液层越厚，对光的吸收就越多，透过的光也就越弱。 如果把浓度为C的有色溶液置入厚度为L的容器中，一定波长的光通过时，由于溶液吸收了一部分光，透过光的强度就会减弱。null 这个过程也符合郎珀-比尔(Lambert-Beer)定律： A = KCL 浓度越大，吸收强度多，透过的光也就越少，光电池受光就弱，产生的电流也就越弱，吸光度就越大。 72系列：可见光 75系列：紫外光 根据药物的性质，它在什么波长下有最大吸收，就选什么仪器。null3.色谱分析法 色谱分析法是用于分离、分析多组分混合物质的一种极为有效的物理及物理化学分析方法。它是利用混合物中各组分在两相间分配系数的差异进行分离的。当混合物在两相间作相对移动时，各组分在两相间进行多次分配，从而达到分离。 null 色谱分析法有两种： (1)按固定相形态分：柱色谱法、薄层色谱法、纸色谱法。 (2)按流动相形态分：气相色谱法、液相色谱法。 具体方法可参阅“仪器分析”的有关教材。 （二）方法的方法的准确性和稳定性 （二）方法的方法的准确性和稳定性 1.标准曲线的建立 在比色法中，吸光度与溶液浓度之间有线性关系，不是说在任何浓度下都呈线性，它只有在一定浓度范围内有线性关系。 故在定量分析时，将标准品配成不同浓度进行测定，找出它的线性范围，制作标准曲线。 null 测定时： (1)查找法：在制作标准曲线上直接查照。该方法比较直观，但 比较粗糙。 (2)回归方程，用方程进行计算。 C=a＋bA 式中，C为浓度，a为截距，b斜率， A为吸光度。 null2.回收率——方法的准确度 考察样品基质对测定的干扰情况。 1.0g~0.8g 80% 0.8g~1.0g 125% 方法：添量法　以血清样本为例： 回收率＝(血清＋标准品)测定值－血清测定值）×100% 　　　　　　　　　　标准品浓度 通俗地讲，回收率就是样本的测定值与其实际值（真值）的比较，也就是测定值与其实际值的接近程度。 每个添加浓度做3～5个平行样，一般做3～5个浓度。 一般要求回收率范围应在70%～110%。null 3. 精密度——方法的稳定性 表示用某种方法测定同一物质样品所得的测定值的彼此接近程度，用 RSD 表示，即变异系数（CV）。 将标准品配成不同的系列浓度，不同时间测定，结果之间有差异，从而求出日内和日间精密度。 null 重复性——短期内相同的实验条件下(实验室、操作者、仪器型号和试剂批号)对同一样品测定结果间的精密度。 重复性可分为批内精密度(within-run precision)和批间精密度 (between-run precision)：日内精密度和日间精密度。 重现性——重现性指不同实验条件下(不同实验室、不同操作者、不同仪器型号和试剂批号)使用某种分析方法对同一样品各个独立测定值间的精密度(实验室协同研究)。null对精密度的要求：与样品含量有关 日内精密度： 10g/mL：1 h、5 h、10 h、24的平均值、RSD。 12g/mL：1 h、5 h、10 h、24的平均值、 RSD 。 14g/ mL：1 h、5h、10h、24的平均值、 RSD 。 16g/mL：1h、5h、10h、24h的平均值、 RSD 。 日间精密度：　　　　　 2g/mL：1d、3d、5d、7d的平均值、 RSD 。 14g mL：1d、3d、5d、7d的平均值、 RSD 。 16g/mL：1d、3d、5d、7d的平均值、 RSD 。 一般应控制在15%以内为宜，最高不超过20%。第二章 毒理学试验第二章 毒理学试验 （一）急性毒性试验——LD50的测定 （一）急性毒性试验——LD50的测定 概念：急性毒性(acute toxicity)是指动物一次或24 h内多次接触外源性学物质，在短期内发生的毒性效应。 目的： (1)了解外源性化学物的急性毒性强度。 (2)了解外源性化学物毒效应的性质、特征和靶器官。 (3)为亚慢性、慢性毒性试验提供依据。 (4)初步了解动物致死原因，为毒性机制提供依据。 null1.预试验 (1)找出0%及100%死亡的估量值，以便决定分组的组数及正式实验的剂量。 对于没有做过的新药，可采取二步法： ①先用10倍稀释液的药液系列，找出大致范围。 ②再用1，2，4，8……等2倍稀释的药液系列。 每组用动物4只，当某一组出现4/4死亡时，如其前第一组为3/4死亡，则取4/4死亡组的剂量为Dmax；如第一组为2/4或1/4死亡，考虑到4/4死亡组在正式试验时可能的死亡率低于70%，为慎重起见，将4/4组剂量乘以以1.4( )作为Dmax 。 同理可求出Dmin。null(2)选择合理的剂量分组 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 分组数(G)一般以5～8组为宜，过少不能反映量-效关系。各组剂量间的比值(1:r)以1:0.6到1:0.85为宜，取简单值有利于配制等比药液。 null2.正式试验 (1)配制等比稀释的溶液 根据预试验结果，选定分组方案。 例如：已知　Dmax=500 mg/kg 　 Dmin=50 mg/kg 二者之比＝10。 null假如选择1:r=1:0.7，G=7~8组的方案。 ①用药容量(d)对小鼠腹腔注射：d=0.2 mL/10g。 ②计算每组药液量(V): V=每组动物数×动物体重×d 如本例用20+2 g体重的小鼠，每组20只，按0.2 mL/10g用药，则： V=20(只)×20 g×0.2 mL/10 g=8 mL 为了留有余地，并使V能被(1－r)整除，每组配制9 mL药液足矣！ null③计算母液药液的浓度和体积 V母液＝V/(1－r) C母液＝Dmax /d 本例：V母液＝9 mL / (1－0.7)=30 mL C母液＝(500mg/kg)/ (0.2mL/10g)=25㎎/ mL=2.5% 因此，可用生理盐水为溶剂按2.5%浓度配制30 mL作为母液。null④低比值系列稀释 从母液中精确吸取9 mL 于1号试管内，准备供Dmax组用。 在剩余的21 mL 母液中加入9 mL 生理盐水，混匀后吸取9 mL 放入2号管(2号管的浓度为1号管的0.7倍，因为30:21=1:0.7) 同样在剩余的21 mL中加生理盐水9 mL，混匀后吸出9 mL放入3号管，依次类推，可配出一系列浓度比值为1:0.7的药液。 不妨多配制几组备用。本例可配制9-10组。 null (2)动物称重、分组给药 动物分组可按严格的单纯的随机方法，用随机数字表进行之。此处介绍均衡随机二步法，即按体重分层随机法，既迅速又方便，效果也很好。 ①制定“体重色标药量表” 根据动物体重分布范围及头数，定出合理的体重级差，标记颜色及注射药量的“体重色标药量表”。例如： 20.0+0.2 g 黄头　 注射0.40 mL (0.2mL/10g) 20.5+0.2 g　　　黄背　 注射0.41 mL 21.0+0.2 g　　　黄耳 注射0.42 mL 21.5+0.2 g　　　黄尾 注射0.43 mLnull②称重、标色 将每只小鼠称重、标色，将体重相同者放置同一笼，分成黄头、黄背、黄耳、黄尾等笼。这样处理，每笼内小鼠的体重误差小于1%，可求得三位有效数字的LD50。如果如果体重极差增大，将影响LD50的精确性。 ③“巡回顺序”法分组 将空笼按1号液、2号液、3号液……8号液排好。在黄头组中随机抽取，把动物依次放入1号笼，2号笼……8号笼中，然后逆着，即按8号笼，7号笼……1号笼将黄头动物放完；后将黄背、黄耳和黄尾按上述方法放完。 这个方法的特点，保证每组动物的总体重一致，体重分布幅度一致，活泼程度也基本一致，可以减少误差。用药时按标色给药，不易出现差错。null④给药 1号笼→1号管：黄头，注射0.40 mL；黄背，注射0.41 mL；黄耳，注射0.42 mL；黄尾，注射0.43 mL 　　 2号笼→2号管：注射方法同上。 　　 3号笼→3号管：注射方法同上。 (3)试验期限及观察指标 试验期限：一般为7~14 d(一般为7 d)。 观察指标：一般健康状况，中毒表现和死亡过程。对死亡的动物应作病理剖检，必需时可进行病理组织学检查。null(4) LD50的计算 LD50的计算方法多达20余种，常用的有概率单位法、Bliss法和改良寇氏法(karber)法，其中改良寇氏法最常用。 LD50＝lg－1 [Xm－i(∑p－0.5)] 式中： Xm—最大死亡组剂量对数； i—组距，即相邻两组剂量比值的对数（此处：lg1/0.7=0.1549）； ∑P—为各组死亡率的总和。 nullLD50的95%可信限（FL）的计算： FL ＝lg－1 (lgLD50±1.96×Sx50) Sx50—为lgLD50的标准误。 Sx50= i = i 式中： p—各剂量组死亡率（死亡率均用小数表示） q—各剂量组存活率（q=1－p，存活率也均用小数表示） 校正值：如果不含0和100%死亡率时，可用下式计算LD50： LD50＝lg－1 [Xm－i(∑p－3－Pm－Pn)] 4 式中：Pm—最高死亡率； 　　　Pn —最低死亡率。null3.急性毒性评价 改良寇氏法的优点是计算比较简便，实用性强。我国《新兽药一般毒性试验技术要求》规定，新兽药的LD50计算用此方法或概率单位对数图线法计算。因为后者比较复杂(但准确性高)，所以一般用前者。null 受试毒物的分级，按照LD50，毒物毒性分级如下： 表1 外源化学物相对毒性分级标准 　　　　　　 　 　　　　　　　 　　　 　null 表2 外源化学物急性毒性分级(WHO) 　 　null 附：经皮肤给药的急性毒性试验 1.试验 动物 选用健康家兔（2.0～3.0 kg）、豚鼠（350～450 kg）或者大鼠（200～300 kg）。每组动物不少于6只，雌雄各半。 2. 供试药物的配制 供试药物如是固体，应磨成细粉状，过120目筛，并用适量水或无毒无刺激性赋形剂（橄榄油、羊毛脂、凡士林等）混匀。如为液体，一般不要稀释。null3. 给药方式 脱去动物背部脊柱两侧毛发（不得损伤皮肤），脱毛后24 h检查皮肤，如无损伤才能进行试验。 将供试药物均匀地涂敷于脱毛区，不应少于动物体表面积的10%，用塑料纸和两层纱布覆盖，再用胶布或者绷带固定，以药物防脱落和被动物舔食。敷药24 h。 试验结束后，用温水或者适当溶剂清除残留供试药。大鼠可采用浸尾方法给药。 null4 .剂量与分组 正式试验前，用少量动物做预备试验，根据24 h内动物死亡情况，估计LD50 的可能范围，以确定正式试验的剂量。一般分为4剂量组，组间剂量呈等比级数。其比值为：1.5～3.0。若用赋形剂，需设赋形剂对照组。null5. 观察指标 注意观察动物的全身中毒表现和死亡情况。观察时间为一周。若给药4 d后仍有动物死亡时，仍需继续观察一周，对死亡动物应作大体剖检，必要时进行病理组织学检查。 null6. 结果评定 兔涂皮LD50在5 mg/kg以下者为极毒，5～44 mg/kg为剧毒，44～350 mg/kg为中等毒，350～2 180 mg/kg为低毒，2 180 mg/kg以上者为无毒。 (二)亚慢性毒性试验 (二)亚慢性毒性试验 概念：亚慢性毒性(subchronic toxicity)是指人或动物连续较长时间接触较大剂量的化学物所出现的中毒效应。 目的:①观察较长时期毒性作用性质，确定靶器官。 ②观察对动物生殖机能的影响及对子代的致畸作用。 ③为慢性试验及致癌试验的剂量和指标筛选提供依据。null1.试验动物　 大鼠 100~200 g或小鼠 15~20 g 有条件时，采取供试物的靶动物给药，如鸡等；外购动物一般饲养一周后才能供试验用。 null2.试验周期 根据临床或生产实际用药时间决定试验周期。 临床用药1～3 d，试验给药期14 d； 临床用药7 d，试验给药期28 d； 临床用药30 d，试验给药期90 d； 临床用药30 d以上，试验用药6个月。null3.给药方式 试验周期短(14 d)的，应与临床给药途径相同。内服时，大鼠、小鼠用灌胃法，鸡用药丸投予。 给药周期28 d以上，则混饲给药，让其自由饮水，饮水不限。 null4.剂量与分组 至少3个剂量组和1个对照组，大鼠每剂量组至少20只，雌雄各半。 高剂量应有部分动物出现毒性反应或死亡(但死亡不超过20%)，高剂量组的剂量为1/20～1/5 LD50。低剂量组应高于药物对动物的有效量(接近NOEL（NOEL：无副作用剂量；不会引起可观察到的伤害的暴露剂量）)，原则上应不出现任何毒性反应。 在高剂量组与低剂量组设1～2个剂量组，且各剂量组之间的剂量至少应相差2倍。 每次试验应均设正常对照组，必要时可设受试物的溶剂对照组。null5.观察指标 (1)每天观察动物的一般健康状况，包括活动、采食、饮水、发病和死亡情况。 (2)每周分别称体重、饲料消耗量2～3次，计算增重、平均摄食量及死亡情况。 (3)定期血液学检查　包括Hb含量、红细胞、白细胞及分类计数、血小板等。 null(4)定期作血液生化检查　包括SGPT、SGOT、ALP(碱性磷酸酶)及血中尿素氮(BUN)、肌酐、血清白蛋白／球蛋白等。 (5)试验结束时测定肝、肾、胃及其他脏器的绝对重量和脏器系数。 (6)试验结束时对所有动物(包括试验过程中死亡的动物)进行剖检，有选择地进行肝、脾、肾、胃、肠等器官的组织病理学检查。在试验过程中，根据试验周期的长短，定期处死少量动物进行剖检和组织病理学检查。null6.结果处理 将试验结果汇总成表，病理变化摄成照片。试验数据用方差分析或χ2检验进行统计学处理，P0.05及具有剂量反应关系的，显示毒性较强。根据中毒时首先出现的症状及停药后组织和功能损害的发展和恢复情况，对药物的亚毒性做出客观评价。 最后写出评价 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 。（三）慢性毒性试验（三）慢性毒性试验 概念：慢性毒性试验(chronic toxicity)是指人或动物长期或反复接触低剂量的化学物所产生的毒性效应。 目的：①确定毒物的慢性毒性作用，尤其是不可逆性的毒性作用和致肿瘤作用。 ②阐明化学物的毒性性质、靶器官、中毒机制，确定MEL（MEL ：最大暴露限值。 MEL是指工作人员（或动物）较长时间暴露于某种化学品的最大允许浓度）、NOEL以及剂量－效应关系，为制ADI以及该药物是否应用提供依据。null1.试验动物　 基本同亚慢性毒性试验。 每个剂量组的动物数应满足试验结束时所收集的数据能够进行统计学处理的要求。 大鼠：40～60只（小鼠量应增加） 犬、猫：8～10只 动物一般应公母各半。 null2.染毒途径 应选择与人类或靶动物实际接触的途径接近，以经口染毒最为普遍，多采用混饲或混饮的方法。配制饲料时，要求非营养性受试物加入饲料中的比例不得超过饲料的5%。 慢性毒性试验中，如果经呼吸道染毒，每天的染毒时间应根据试验要求而定。如受试物为工业毒物，则每天应吸入4～6 h，环境污染物要求每天应不少于8 h。一般每周染毒5～6 d。null 3.剂量及分组 一般应设3个剂量组和1个对照组。 染毒剂量组之间以相差5～10倍为宜，最低不小于2倍。必要时可设一个溶剂对照组。 染毒剂量可通过以下3种方法确定： ①以亚慢性阈剂量为依据。 高、中、低剂量分别为1/2～1/5，1/50～1/10，1/100的亚慢性阈剂量。null②如果没有亚慢性毒性资料，可参考LD50的结果。 以1/10 的LD50为最高剂量， 以1/100 LD50为预期慢性阈剂量， 以1/1 000 LD50为无作用剂量。 ③美国环境保护局（DPA）建议，以MTD为依据，设2个剂量组，分别为0.125 MTD和0.25 MTD。 null4.染毒时间 WHO建议：小鼠：18个月 　　　　　　 大鼠：24个月 　　　　　 犬、灵长类：24个月 　　　　　 有些时间可达7～10年 有学者认为，以大鼠为试验毒物进行慢性毒性试验，染毒时间不一定非要长达1年以上。因为多次试验证明，即使染毒时间延长至1年以上，大鼠也不会出现新的毒性效应（致癌试验除外）。null5.观察指标 以亚慢性毒性指标为基础。亚慢性毒性指标均可观察，特别指出的是：病理组织学检查是必不可少的指标。 期间：高剂量组和低剂量组定期剖杀动物进行观察，进行病理剖检和各项指标检测。 null 在最后一次给予受试物后，立即剖杀掉2/3动物检测其各项指标；余下的1/3毒物继续观察2～4周，然后剖杀，以便了解所出现的毒性反应的可逆程度以及可能出现的延迟毒性反应情况。 null 我国规定：凡我国创制的新药须进行慢性试验和致癌试验。 美国FDA规定：凡能致癌，引起白内障、怀疑可能影响免疫功能以及供人终生应用的药品，均需进行慢性毒性试验。 （四）特殊毒性试验——三致试验（四）特殊毒性试验——三致试验 特殊毒性试验，包括：致突变、致畸和致癌作用。 农业部规定：限于国内条件，一般只进行致突变和致畸试验。 一般一、二类新药需进行“三致”试验，故此处不再讲述。新兽药新兽药   附：新药的概念 第一类，我国创制的原料药品及其制剂（包括天然药物中提取的及合成的新发现的有效单体及其制剂）；我国研制的国外未批准生产。仅有文献报道的原料药品及其制剂；新发现的中药材；中药材新的药用部位。      第二类，我国研制的国外己批准生产，但未列入国家药典、兽药典或国家法定药品标准的原料药品及其制剂。天然药物中提取的有效部分及其制剂。      null 第三类，我国研制的国外已批准生产，并已列入国家药典、兽药典或国家法定药品标准的原料药品及其制剂；天然药物中已知有效单体用合成或半合成方法制取的原料药品及其制剂；西兽药复方制剂；中西兽药复方制剂。     第四类，改变剂型或改变给药途径的药品。新的中药制剂（包括古方、秘方、验方、改变传统处方的）；改变剂型但不改变给药途径的中成药。    第五类，增加适应证的西兽药制剂、中兽药制剂（中成药）。第三章 实验临床试验技术第三章 实验临床试验技术null总体要求 1.根据农业部颁布的《新兽药及兽药新制剂管理办法》、《国外企业在中华人民共和国注册兽药管理办法》规定，特制定“实验临床试验技术规范”。 2.凡需进行药效临床试验的国内新兽药、兽药新制剂及国外在我国注册的兽药，均按本指导原则制定临床试验方案。 3.国内一、二类新兽药完成实验临床试验以后的试产期内尚需进行扩大区域试验，其试验要求可参照本规范。一、抗寄生虫药物试验一、抗寄生虫药物试验 抗寄生虫药物分为三类： 1、抗蠕虫药：包括驱吸虫药、线虫药、绦虫药等。 2、抗原虫药：包括抗锥虫药、梨形虫药、球虫药等。 3、杀虫药：包括驱、杀昆虫、蝇、虻、蚊、蜱、螨、蠓、虱、蚤药等。（一）抗蠕虫药（一）抗蠕虫药1.试验动物 应采用人工感染方式，方式可依虫体种别而定，如果用自然感染动物，必须进行严格病原鉴定，确诊为阳性者，方可用作试验。 2.试验分组 (1)药物试验组：一般设高、中(推荐剂量)、低三个剂量组。 (2)阳性对照组：即感染不给药组。 (3)药物对照组：选择与试验药物具有可比性的同类或同效药物，按常规剂量给药。null 试验动物的数量要求： 必须达到规定的要求，各组动物的数量：大家畜不少于10头，中家畜不少于20头，小家畜及家禽不少于50只。 其中给推荐剂量的药物试验组动物数量不得低于全部试验动物规模的50%。 3.给药途径 按推荐的临床给药途径给药。null4.试验方法 给药前3天均进行虫卵检查，注意观察试验动物健康状况，必要的分类鉴定并计数，给药后注意观察试验动物反应和健康状况，检查排出的虫体或虫卵，并分类鉴定计数。 试验结束时将全部试验动物剖杀，检查残留的虫体，分类、鉴定并计数。必要时，给药前和给药后分别对试验动物进行生理生化指标检查及进行增重与饲料转化率测定。null5. 结果评价 计算药物的粗计驱虫率，精计驱虫率和驱净率，并加以统计分析。 总计驱虫率=（给药前虫卵数－给药后虫卵数）/给药前虫卵数×100％ 精计驱虫率=排出虫体数/（排出虫体数+残留虫体数）×100％ 粗计驱虫率=（对照组平均残留虫体数－试验组平均残留虫体数）/对照组平均残留虫体数×100％ 驱净率=驱净虫体的动物数/全部试验动物数×100％（二）抗原虫药（二）抗原虫药A 抗锥虫及其它血液原虫药 1.试验动物 要求同抗蠕虫药。 2.试验分组 要求同抗蠕虫药。 3.给药途径 按推荐的临床给药途径给药。 null4.试验方法 给药前进行血液病原检查，并抽取血液对小鼠或其它模型动物进行潜伏期试验，给药后24 h始，至6个月期内观察血液虫体消失情况，并在模型动物体内进行潜伏期试验。必要时，给药前、后进行免疫学、血液学和血液生化指标检查，以帮助评价药效。 5.结果评价 计算转阴率，并统计分析。nullB 抗球虫药 1.试验动物 大、中家畜可采用人工感染与自然感染相结合的方式。小家畜及家禽均采用人工感染方式。 2.试验分组 同抗蠕虫药。 3.给药途径 按推荐的临床给药途径给药。null4.试验方法 给药后7～8 d记录下列项目： 死亡率、增重率、盲肠病变记分、血便记分、盲肠卵囊数，并计算抗球虫指数(ACl)。（具体方法参考兽医寄生虫学）（或参考： 角田清主编 . 鸡球虫病. 上海: 上海科学技术出版社,1986,87～ 91.） ACI=(增重率+存活率)-(病变值+卵囊值) 在测定ACI的基础上，进行药物添加剂的饲喂试验。 null 5.结果评价 以抗球虫指数评价药效。抗球虫指数>180者为高效；160～180者为中效；<160者为低效；<120者为无效。（三）杀虫药（三）杀虫药 在进行离体(体外)杀虫试验的基础上，进行临床试验。 1.试验动物 采用自然感染或人工接种感染，试验前有明显临床症状，经肉眼观察或刮皮屑镜检可查到活的寄生虫，方可作为试验动物。 2.试验分组 同抗蠕虫药。 3.给药途径 按推荐的临床用药途径给药。null4.试验方法 给药前进行寄生虫学检查，分类鉴定并计数。给药后1～5周内，平均每周通过刮取皮屑镜检或其它方法检查存活虫卵、虫体，并分类计数，观察再次感染的间隔时间，确定残效期。 null 5.结果判定 分治愈、显效、有效、无效进行统计。（注意统计方法） 鉴于体外杀虫剂均具有一定毒副作用，在进行临床试验同时，根据情况分别测定用药前后动物血液主要的生化参数(如血钙、尿素氮、血糖、谷丙转氨酶等)，并进行生物统计。二、抗微生物药物试验二、抗微生物药物试验 抗微生物药包括抗细菌、真菌、支原体、病毒等药。在进行体外抑菌 (MIC或蚀斑数〈PFU〉)试验的基础上进行临床试验。 1. 试验动物 应采用人工感染方式。如采用自然感染动物，必须进行病原鉴定，确诊为阳性者，方可用作试验。 人工感染用的菌种、毒种应为国家鉴定的标准菌毒种，攻毒量应为敏感动物的最小致死量。 null 2. 试验分组 (1)药物试验组 一般设高、中(推荐剂量)、低3个剂量组。 (2)空白对照组 即不感染不给药组。 (3)阳性对照组 即感染不给药组(自然感染动物不设此组)。 (4)药物对照组 选择与试验药物具有可比性的同类或同效药物，按常规剂量给药。 试验动物数量必须达到规定的要求，每组动物数量：大、中家畜不少于10头，小家畜及家禽不少于30只。 3. 给药途径与方式 按推荐的临床给药途径给药。null4.试验方法 给药后观察动物生理状况与发病情况，记录死亡动物数，增重情况。必要时进行生理、生化指标检查(化验)，或免疫学(抗体滴度)检查。 5.结果评价 分治愈、显效、有效、无效进行统计，计算有效率(保护率)，与对照组进行比较。三、饲料药物添加剂的饲喂试验三、饲料药物添加剂的饲喂试验 1.试验动物 所用试验动物应健康无病，同批试验动物应选择品种、日龄、初始体重、遗传性相似的。 2.饲料 所有试验动物根据生长期的要求均喂以标准混合饲料，不得随意提高或降低营养成份。null 3.药物试验分组 (1)试验组 一般设高、中(推荐剂量)、低三个剂量组。 (2)空白对照组 饲料中不含饲料药物添加剂。 (3)药物对照组 选择与试验药物具有可比性的同类或同效药物，按常规剂量给药。 试验动物数量必须达到规定要求，每组动物数量：大家畜不少于20头，中家畜不少于40头，小家畜及家禽不少于100只。null4.饲养管理 按常规方法饲养管理。试验开始前或预试期进行必要的防疫注射和驱虫，试验期间执行严格的防疫消毒 措施 《全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观全国民用建筑工程设计技术措施》规划•建筑•景观软件质量保证措施下载工地伤害及预防措施下载关于贯彻落实的具体措施 。 5.试验期 根据药物的推荐使用时期而定。 6 .给药途径 按推荐的临床给药途径给药。null7.试验方法 饲喂试验组动物除使用试验药物外，其余各种条件均与空白对照组动物相同，饲料药物添加剂以等量递加法与饲料混合均匀并分期分批配制。 null试验时记录下列项目数据： (1)体重 试验开始时及开始后定期定时称个体重量，计算增重率。称重方法可采用：(1)早晨空腹增重；(2)增加称重次数，试验开始和结束的体重以连续三天空腹结果的平均值表示；(3)阶段称重：猪每月一次，肉鸡3、6周时各一次，蛋雏鸡和生长鸡6、14周各一次。 (2)饲料采食量 每天记录各组动物采食量，根据日增重计算饲料报酬。 (3)每天记录动物的健康状况异常现象及处理方法，对死亡动物进行剖检，对淘汰动物说明原因及时记录并立即计算饲料消耗。 null8.试验周期 生长肥育家畜2～4个月，肉鸡49～56 d。 9.结果评价 分别计算各组动物的阶段增重及总增重，必要时进行有关酮体指标的测定，饲料转化效率及经济效益，进行统计学比较。 10.饲料报酬公式 饲料报酬=饲料消耗量（kg）/增重（kg）四、治疗药物试验四、治疗药物试验 以预防、治疗为目的的药物均可谓治疗药物。适应于除抗微生物药、抗寄生虫药之外的所有治疗药物。 1.试验动物 尽可能用人工发病的动物。如用自然发病的动物，必须经临床诊断，确定为试验药物作用范围内的病畜(禽)，并逐头作好病历记录。 2.试验分组 (1)药物试验组：一般设高、中(推荐剂量)、低三个剂量组。 (2)阳性对照组：即发病不给药组(自然病的不设此组)。 (3)药物对照组：选择与试验药物具有可比性的同类或同效药物。 null 试验动物数量：大、中家畜不少于10头。 小家畜及家禽不少于30头（只）。 3.给药途径 按推荐的给药途径给药。 4.试验方法 治疗的话分别进行临床检查，除一般检查外，应进行必要的生化指标及其他检查。 5.结果评价 分治愈、显效、有效、无效进行统计，与对照组进行统计学比较。 一般可用2检验进行统计。null五、试验报告要求 为公正、科学地评价药品疗效，对试验报告内容做如下要求： 1.试验目的。 2.试验时间、地点。 3.试验动物应注明品种、品系、年龄。 4.试验用药品需注明药品名称、生产厂家、剂量、规格、含量、产品批号、推荐剂量及用法用量。null 5.用于人工感染的菌(毒、虫)种需注明菌(毒、虫)种来源，名称，菌液制备方法、攻毒方法、剂量。 6.试验数据，应有详细的试验原始记录并进行生物学统计。 7.归纳总结药品疗效、适应症、不良反应，防制措施，注意事项。 null 8.在实验临床试验期间，除试验药品外，对受试动物不得使用其它任何药品。 9.根据试验药品的应用范围，作用用途，每一种动物及每一种作用供试验动物总数不得低于有关管理办法规定的数量。 10.加盖试验单位公章。 第四章 兽药药物动力学试验第四章 兽药药物动力学试验 null 药物动力学试验是指对药物在体内随时间变化而发生的量变规律进行测定。药物动力学参数是评价兽药质量的重要指标之一，也是制定合理的用药方案包括剂量、疗程、给药途径、给药间隔、休药期等的理论和实践依据。一、主要内容一、主要内容 1.静脉注射给药的药动学特征 2.内服给药的药动学特征 3.肌肉(皮下)注射给药的药动学特征 4.其他给药途径（如透皮剂、气雾剂）的药动学特征 供内服给药的药物，需做静注和内服给药的药物动力学试验；供内服和注射的药物，则需增加肌内（或皮下）注射给药的药物动力学试验；其他给药途径的药物，则需做静注和其他给药途径的药物动力学试验。不能静注的药物，则可测定相对生物利用度。二、基本要求二、基本要求 1. 供试药品应与临床验证的药品一致，在试验前要对药品的质量进行测定，给药剂量、途径与临床一致。 2. 试验动物要求 动物：成年靶动物：　 数量：大家畜不少于6头 中家畜不少于8头 小家畜不少于10头 家禽不少于10只 3. 所用仪器、设备、血药浓度测定方法均应符合药动学要求。三、药药物动力学试验方法三、药药物动力学试验方法 1. 给药按试验设计要求进行单剂量给药方法，每头动物的给药剂量（一般按每kg体重计算）、途径、方法、部位、速度均应一直。 2. 采样 一般用血浆或血清，必要时也可采用尿液或其他样品。 （1）采血时间：在预试验的基础上确定采血时间，一般在给药前采空白血样一个，给药后吸收相、分布相、消除相均应至少采3个点；在峰时前后应有2～ 3个点，整个采血时间至少为3～5个半衰期。null 如某待测药物的峰时预试结果为1 h，半衰期约为3～4 h，则采血点可安排为：5、15、30、45、60、80 min和2、4、8、16、24 h。一般最后一个采血点的血药浓度应等于或在最低检测限以下。 （2）采血方法：一般采集静脉血液。 牛、马、羊可由颈静脉采集； 猪由前腔静脉或耳静脉采血； 鸡由翼下静脉或心脏采血； 家兔可由耳缘静脉或心脏采血。 （3）血样保存：血样采集后应置冰箱内，尽快分离血清或血浆。分离的血清或血浆应置－20 ℃以下冰箱保存待测，特殊药物应在特殊条件下保存。样品一般应在采集后1周内测定。null3.血药浓度检测方法 根据药物的性质和实验室条件，可选择简便、快速、灵敏度高、重复性好、特异性强的检测方法。 一般常用的有HPLC、GC、LC-GC联用法、GC-MS联用法、微生物学方法、放射免疫测定法（RIA）、ELISA等。 null注意事项： （1）应用HPLC、GC、LC-GC联用法、GC-MS联用法检测时，尽可能选用内标法。 注：内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除由于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。      内标法在色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。 null（2）标准曲线：至少5个浓度，最低浓度应为最低检限的2倍，设定标准曲线最高浓度时应考虑待测血药浓度在标准曲线的线性范围内。标准曲线的相关系数，化学法应至少在r应在0.9 900以上，其他方法应在0.9 500以上。null （3）回收率：设低、中、高3个浓度，低浓度应为最低检测限的2～4倍，平均回收率应在80%以上。 （4）精密度：低、中、高3个浓度，低浓度应为最低检测限的2～4倍。每批每个浓度至少4个样品品，至少4批。批内RSD在10%以下，批间20%以下。 （5）灵敏度：至少能检测出3～5个半衰期末的浓度，或能检测出峰浓度的1/10～1/20。null4.药-时数据的处理 （1）一般采用药物动力学房室模型的微机程序处理药-时数据，如目前多用MCP-PK程序（夏文江等，中国药理学报，1988，9（2）：188-192.）或用3p97药代动力学程序软件处理药-时数据 。 如有更好的的程序亦可采用，但要求能提供必须的基本参数。 （2）应按每头动物的药-时数据计算药物动力学参数，然后再求平均值，不能用药-时数据的平均值计算药物动力学参数。四、药动学试验申报 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 的具体要求四、药动学试验申报材料的具体要求 申报材料的药动学试验报告应包括如下内容： 1.试验动物的品种（或品系）、头数、体重（平均体重SD）、年龄和性别。 2.给药剂量、途径、方法，剂型浓度规格、药品来源和批号。 3.检测方法、仪器（型号、生产厂家）、检测条件；标准曲线、相关系数、回收率、变异系数（批内和批间）和最低检测限。null 4.用图表列出每头动物的血药浓度、药动学参数和色谱图。 5.要求提供的主要动力学参数为：消除半衰期（t1/2）、生物利用度（F）、峰浓度（Cmax）、达峰时（tmax）、表观分布容积（Vd）、药-时曲线下面积（AUC）、吸收半衰期（t1/2ka）和体清除率（CLB）。 6. 讨论与结论。根据药动学参数提出合理的给药方案：剂量（首次剂量、维持剂量）、途径、给药间隔时间、疗程等。附：药物动力学指定试验单位名单：附：药物动力学指定试验单位名单：中国农业大学 华南农业大学 华中农业大学 西北农业大学 南京农业大学 中国兽药监察所 解放军农牧大学（现并入吉林大学）第五章 兽药稳定性试验第五章 兽药稳定性试验null一、一般要求 稳定性试验的目的： 考察原料药或药物制剂在温度、湿度、光线的影响下随时间变化的规律，为兽药的生产、包装、贮存、运输条件提供科学依据，同时通过试验建立药品的有效期。 稳定性试验的基本要求是： 1.稳定性试验包括：影响因素试验、加速试验与长期试验。 影响因素试验 适用于原料药的考察，用一批原料药进行。 加速试验与长期试验 适用于原料药与药物制剂，要求用三批供试品进行。null 2.原料药供试品应是一定规模生产的，其合成工艺路线、方法、步骤应与大生产一致。 药物制剂的供试品应是一定规模生产的(如片剂至少在10 000～20 000片)，其处方和生产工艺应与大生产一致。 3.供试品的质量标准应与各项基础研究及临床验证所使用的供试品质量标准一致。 4.加速试验与长期试验所用供试品的容器和包装材料及包装应与上市产品一致。null 5.研究药物稳定性，要采用专属性强、准确、精密、灵敏的药物分析方法与降解产物检查方法，并对方法进行验证，以保证药物稳定性结果的可靠性。在稳定性试验中，应重视降解产物的检查。 根据实际情况，原料药一般做的比较少，制剂做的相对多一些，故此处主要对药物制剂稳定性研究方法作一简要介绍。 二、药物制剂的药物制剂稳定性试验二、药物制剂的药物制剂稳定性试验 药物制剂稳定性稳定性研究，首先应查阅原料药稳定性有关资料，特别了解温度、湿度、光线对原料药稳定性影响，在此基础上进行以下试验。(一)加速试验(一)加速试验 此项试验是在超常的条件下进行，其目的是通过加速药物制剂的化学或物理变化，预测药物制剂的稳定性，为新兽药申报生产、运输及存贮提供必要的资料。 供试品：要求三批，按市售包装。 试验条件：在温度40±2℃，相对湿度75%±5％的条件下放置6个月。 所用设备应能控制温度±2℃，相对湿度±5％，并能对真实温度与湿度进行监测。null 在试验期间每一个月取样一次，按稳定性重点考察项目检测，6个月资料可用于申报。 在上述条件下，如6个月内供试品经检测不符合制订的质量标准，则应在中间条件下即在温度30±2℃，相对湿度60±5％的情况下进行加速试验，时间仍为6个月。内服溶液剂可不要求相对湿度。 试验所用设备与原料药相同。 null 对温度特别敏感的药物制剂，预计只能在冰箱(4～8℃)内保存使用，此类药物制剂的加速试验，可在温度25±2℃，相对湿度60%±5％的条件下进行，时间为6个月。 乳剂、混悬剂、软膏剂、眼膏剂、气雾剂、浇泼剂、外用溶液剂宜直接采用温度30±2℃、相对湿度60±5％的条件下进行试验，其他要求与上述相同。 对于包装在半透性容器的药物制剂，如塑料袋装溶液，塑料瓶装滴眼剂等，则应在相对湿度20±2％的条件(可用CH3COOK•1.5H2O饱和溶液，25℃，相对湿度22．5％)下进行试验。null 光加速试验：其目的是为药物制剂包装贮存条件提供依据。 取供试品三批装入无色透明容器内，放置在光橱或其他适宜的光照仪器内，于照度4 500±500 Lx的条件下放置10 d，于5、 10 d定时取样，按稳定性重点考察项目进行检测，特别要注意供试品的外观变化。 试验用光橱与原料药相同，照度应该恒定，并用照度计进行监测，对于光不稳定的药物制剂，应采用遮光包装。(二)长期试验(二)长期试验 长期试验是在接近药品的实际贮存条件25±2℃进行，其目的是为制订药品的有效期提供依据。 供试品：三批，市售包装，在温度25±2℃。 条件：相对湿度60±5％条件下放置12个月。 取样：每3个月取样一次，分别于0、3、6、9、12个月，按稳定性重点考察项目进行检测。12个月的数据可用于申报，12个月以后，仍需继续考察，分别于18、24、36个月取样进行检测。将结果与0月比较以确定药品的有效期。若未取得足够数据(如只有18个月)，则应进行统计分析，以确定药品的有效期（具体参考药剂学教材）。null 如三批统计分析结果差别较小，则取其平均值为有效期限。若差别较大，则取其最短的月数为有效期。很稳定的药品，不作统计分析。 对温度特别敏感的药品，长期试验可在温度6 ℃土2℃的条件下放置12个月，按上述时间要求进行检测，12个月以后，仍需按规定继续考察，制订在低温贮存条件下的有效期。此种方式确定的药品有效期，在药品标签及说明书中均应指明在什么温度下保存，不得使用“室温”之类的名词。 三、稳定性重点考察项目三、稳定性重点考察项目 主要剂型见附表，表中未列入的剂型的考察项目，见药典附录有关剂型项下要求。 附表：原料药及药物制剂稳定性重点考察项目表 注：降解产物应说明分解产物数目的变化及量的变化。 注：降解产物应说明分解产物数目的变化及量的变化。第六章 药物制剂研究内容第六章 药物制剂研究内容null一、处方设计 根据拟定的剂型，设计处方，主药含量应给出。 二、 质量标准制订 根据不同剂型制订，例如注射液： 1.含量测定　　　2.性状　　　3.规格　 4.用法用量　　　5.贮存条件　6.有效期null三、制剂安全性试验　　 1.急性毒性试验——LD50 2.家兔股四头肌刺激性试验——供肌注的针剂 3.家兔滴眼法——滴眼、滴鼻、黏膜用药 4.皮肤刺激性——皮肤用药 5.过敏性试验——全身用过敏：豚鼠过敏 皮肤用过敏：家兔 6.降压试验——静脉给药 7.溶血性试验——静脉给药 8.热原检查——静脉给药null四、 药效学试验（以抗菌药为例） 1.体外抗菌试验：抑制试验，选用不同的菌种，设对照药物，测出MBC、MIC。 2.体内试验：试验组：低、中、高三个剂量 　　　　　　 阳性对照：发病不治疗 　　　　　 药物对照组：以同类药物作为对照 3.临床试验：根据不同药物的治疗范围，选择相应的试验（见临床试验部分）。五、病理模型的复制 五、病理模型的复制 免疫抑制模型：肾上腺皮质激素、环磷酸胺 免疫增强模型：卡介菌、棒状杆菌等 肾肝模型：CCl4（四氯化碳） 肾损模型