毛细管电泳分析尿液中的安非他命类及恺他命类药物

毛细管电泳 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 尿液中的安非他命类及恺他命类药物 毛細管電泳分析尿液中的安非他命類及愷他命類藥物 Analysis Amphetamines and Ketamine in Blood and Urine by Capillary Electrophoresis with Photodiode Array Detection 背景介紹 在台灣,通常去吸食或販賣非法違禁藥物的人,通常不會只持有單純的一種藥物。而舉例來說,像是吸食甲基安非他命的人,在體內會代謝成結構相似的藥物[圖一],也就是所謂的安非他命及麻黃素,而因為麻黃素代謝出來之比例相當低,所以在本實驗就不多加探討。氯胺酮俗稱愷他命 (ketamine)。在近年來,吸食愷他命的比例有逐年增加的趨勢。在人體內愷他命會代謝成norketamine [圖二]。 根據文獻指出,此毛細管電泳方法,是相當不錯的且可以用來分析以下這些藥物。這些藥物包含amphetamine (A) , methamphetamine (MA) , methylenedioxy - amphetamine (MDA)及 methylenedioxy - methamphetamine (MDMA) 及methylenedioxy-ethyl-amphetamine (MDEA) ,從結構我們可以看出這些藥物都是結構相似之藥物,簡稱 amphetamine-type stimulants (ATS) [圖三],還有愷他命類ketamine (K),norketamine (NK)。而不管是在單一或混合的藥物分析,毛細管電泳都可以在十六分鐘做一個完整的分析。 1 CH3CH3CH3 CH22CHNHCH2CH2CHNHCH3CHNH2 OHMethamphetamine Amphetamine Norephedrine Deamination, p-hydroxylation and conjugation [圖一] 甲基安非他命在人體代謝途徑 ClClOO NHNH 3CHKetamine Norketamine [圖二]愷他命在人體代謝途徑 2 3,4-methylenedioxyamphetamine3,4-methylenedioxyamphetamineAmphetamineAmphetamine (MDA) (MDA) (A) (A) NH2NH2NHNH22OO 22CCHHCH3CH333CHCHOO 3,4-methylenedioxymethamphetamine 3,4-methylenedioxymethamphetamine Methamphetamine Methamphetamine (MA)(MA)(MDMA)(MDMA) HHHH CHCHNN33OON N CHCH33 HH22CC 33CHCHCHCH33OO methylenedioxyethylamphetamine methylenedioxyethylamphetamine (MDEA)(MDEA) 22HH55CC HH22CCNHNH22 CC22HH55 [圖三] ATS之結構 Capillary Electrophoresis (CE)原理 1. 帶電物質在電場作用下,以不同速度向電荷相反的方向移動之現象,稱 為電泳。樣品在電解液中泳動,根據物質之charge/mass比值差異來進行 分離。比值愈大,跑得愈快。 2. 受pH值、離子濃度、溫度、毛細管長度及電壓大小而影響分離效果。 種類 3 我們所使用的種類為CZE,使用的機型為Beckman Proteome Lab MDQ。 Detector 1. UV/Vis (UV) Detector 2. Photo Diode Array (PDA) Detector 3. Laser-induced Fluorescence (LIF) Detector 4. Mass Spectrometry (MS) 優點 1. 分離效率高 2. 分離速率快 3. 高靈敏度 4. 所耗用溶液少 5. 所產生廢液少 6. 只需微量檢體 4 試劑 1.濃度為1000μg/μL 之標準藥物 (A, MA, MDA, MDMA, MDEA, K and NK) 2. methanol/ water (1:1 v/v) 3. 0.1N NaOH 4. Tris [hydroxymethyl] aminomethane buffer (PH=3.5, conc.100mM) 5. 二次水 6. saturated K2CO3 8. Hexane/CH2Cl2 solution (3:1 v/v) 註,以上除有機溶劑外,其他材料皆須以0.22μm filter過濾即可使用,避免毛細管阻塞， 方法 在標準藥品中,將所需之濃度配製好後,取10μL的體積就可上機分析。而在生物檢體當中,必須先將檢體前處理,其萃取步驟如下述。 萃取步驟 在生物檢體中,所使用為尿液。須先以3000 rpm離心10分鐘後,取上清液用0.22μm filter過濾。取1 mL 添加完藥物的urine加入 20μL 過飽和的 K2CO3之目的為鹼化穩定pH值。均勻混合後加入 2 mL Hexane/CH2Cl2 solution (3:1 v/v) [1],利用vortex shaken 1分鐘,此步驟極為重要為萃取成功與否得關鍵點,後。放入離心機(轉速3500 rpm,15min),取上清液定量1.5 mL後轉到小玻璃試管後,以氮氣吹乾再用100 μL methanol/ water (1:1 v/v)回溶,就可上機分析 [圖四]。 5 CE Analysis時的條件 1. CE儀器: Beckman ProteomeLab PA 800 2. Detector : Photo Diode Array (PDA 190–600 nm) and detection at 200 nm. 3. Capillary Tubing: 50μm*50.2cm 4. Cartridge Temp: 20? 5. Sample storage Temp: 10? 6. Electropherogram scan range: 190~300 nm CE Time Program 的設定 1. Rinse-pressure 15.0 psi,3.0 min. Use Tris,hydroxymethyl,aminomethane buffer (pH=3.5) 2. Inject- pressure 1.0 psi,10.0 sec. 3. Separate-Voltage 20.0 KV,12.0 min. 4. Autozero 5. Stop data 6. Rinse-pressure 15.0 psi,2.0 min. Use 1N NaOH 7. Rinse-pressure 15.0 psi,2.0 min. Use D-D water 8. End Urine Drug-standard 200μl KCO 23 6 2mLHexane/CHCl 22 solution (3:1 v/v) 7