聚乙烯醇生物降解研究进展

收稿日期:2007-07-17 基金项目:国家高技术研究发展 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 (863)资助项目(2003AA322050);江苏省高技术资助项目(BG2005016);新世纪优秀人才支持计划资助 项目 作者简介:张颖(1974-),女,贵州贵阳人,工学博士,讲师,主要研究方向为纺织生物技术;Email:yingzhang@jiangnan.edu.cn 通讯作者:陈坚(1962-),男,江苏无锡人,工学博士,教授,博导,主要从事工业生物技术及环境治理研究;Email:jchen@jiangnan.edu.cn 聚乙烯醇(PVA)是一种人工合成的水溶性高 分子化合物,在纺织、造纸、化工等行业有广泛的用 途,但是在自然环境中它很难被降解,是水体中的 难降解污染物之一,特别是在纺织工业废水中,据 估计,每年我国纺织工业排放的 PVA废水数以千 万吨计。随着人们对纺织工业清洁生产的关注,研 究者们考虑能否在退浆工艺中就实现对 PVA的生 物降解,即将 PVA降解酶运用于纺织工业的退浆 工艺。如果能在退浆工段就实现对 PVA的生物降 解,不仅能大大减少 PVA废水的排放,还能避免化 学退浆过程中高温和氧化造成的棉纤维损伤。实现 PVA降解酶工业化的前提是了解 PVA的生物降解 聚乙烯醇生物降解研究进展 张颖 1 堵国成 2 范雪荣 1 陈坚 2 (1江南大学纺织服装学院江南大学生态纺织教育部重点实验室,无锡 214122; 2江南大学生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 学院江南大学工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122) 摘 要: 聚乙烯醇(PVA)是一种在纺织和化工行业中广泛使用的难降解的高分子聚合物。随着人们对纺织工业清洁 生产的关注,如何在退浆工艺中就实现对PVA的生物降解、减少PVA废水的排放,并避免化学退浆过程中高温和氧化造成 的棉纤维损伤,是近年来纺织生物技术领域的研究热点。由于PVA降解菌种类不多、培养周期长,PVA降解酶酶活不高、提 取不容易等原因,使PVA的生化降解研究还局限在PVA降解菌的筛选、PVA降解酶的酶学性质研究等方面,PVA降解酶还 未在纺织工业上得到应用。本文综述了近年来国内外在PVA降解菌筛选、PVA降解酶提取及酶学性质、PVA生化降解机理 等方面的研究进展,并讨论了PVA生化降解研究中存在的问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 及发展方向。 关键词: 聚乙烯醇 生物降解 聚乙烯醇降解菌 聚乙烯醇降解酶 降解机理 ProgressinResearchofPVABiodegradation ZhangYing1 DuGuocheng2 FanXuerong1 ChenJian2 (1KeyLaboratoryofEco-Textiles(JiangnanUniversity),MinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi214122; 2KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,JiangnanUniversity,Wuxi214122) Abstract: Polyvinylalcohol(PVA)isoneofthehard-degradablepolymer,whichiswidelyusedinsuchaschemical industryandtextileindustry.Inrecentyears,thedevelopmentofclean-productionprocessfortextileindustryattracted greatinterestandtherefore,thebiodegradationofPVAatthedesizingstage,whichcouldgreatlyreducedischargeofPVA wastewaterandminimizedamageofcottonfiberinthedesizingprocess,becomesoneofthekeypointsintextile biotechnologyfield.Tillnow,theresearchaboutbiodegradationofPVA ismainlyfocusedonthescreeningofPVA- degradingmicroorganismsandthecharacteristicsofPVA-degradingenzymesfromobtainedstrains.PVA-degradingenzymes arestillnotapplicableinrealindustryprocessduetotheirlow activityandtheproducingstrainsofPVA-degrading enzymearelimitedandtheyoftengrow veryslowly.HeretherecentprogressinresearchofPVA biodegradation, includingscreeningofPVA-degradingstrains,purificationandcharacterizationofthePVA-degradingenzymesandthe mechanism ofPVAbiodegradation,isreviewed.TheproblemsandtrendsinthestudyofPVAbiodegradationarealso discussed. Keywords: Polyvinylalcohol(PVA) Bio-degradation PVA-degradingenzyme Degradationmechanism 生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论· 2007年第6期 生物技术通报Biotechnology Bulletin 2007年第6期 过程,获得具有降解 PVA能力的微生物。本文综述 了 PVA生物降解研究方面的进展。 1 PVA的微生物降解 Suzuki等于 1973年[1]以 PVA为惟一碳源得到 了第一株能够产生 PVA降解酶的细菌:Pseudomonas O-3。之后,其他研究者们也陆续发现了另外一些能 够降解 PVA的细菌。Watanabe等[2]筛选到能降解 PVA的 Pseudomonassp.,在前期研究中认为 Pseudo monassp.为纯培养物,而在研究 PVA降解机理时 又认为是 Pseudomonas属几株菌的一个混合培养体 系[3]。Sakazawa等[4]得到能够降解 PVA的共生细菌 Pseudomonassp.VM15C和PseudomonasputidaVM15A。 菌株 VM15C必须在其共生菌 VM15A提供生长因 子吡咯并喹啉醌(PQQ)的前提下才能降解 PVA。菌 株 VM15A不直接降解或利用 PVA,它利用菌株 VM15C降解 PVA所产生的代谢产物维持生长。 Hatanaka等[5]筛选到 Pseudomonassp.113P3。Kawag- oshi等得到的 Pseudomonasvesicularisvar.povalolyti- cusPH必须在添加酪氨酸、亮氨酸、半胱氨酸和硫 胺素的情况下才能降解 PVA[7]。 除了假单胞菌属外,Morti等[8]筛选到了能够降 解 PVA的芽胞杆菌 Bacillusmegaterium,Kim等[9]得 到了能够降解 PVA的 Sphingomonassp.SA3。Mori 等[10]从纺织厂的污水处理车间分离出来的细菌 BX1 和 GeotrichumfermentansWF9101可 以 协 同 降 解 PVA,其中 BX1把大分子的 PVA切割成小分子量 的 PVA低聚物,GeotrichumfermentansWF9101利用 这些 PVA低聚物进行生长。Matsumura等从日本的 河水中分离得到能降解 PVA的 Alcaligenesfaecalis KK314[11~12]。 通过研究发现,能够降解 PVA的微生物在自 然界中的分布并不广泛,一般仅存在于被 PVA污 染的环境中。在筛选过程中必须以 PVA作为筛选 培养基的惟一碳源,以形成一个 PVA胁迫的环境, 才能筛选到 PVA降解微生物。Tokiwa等[13]认为 PVA 氧化酶在作用过程中产生的对微生物有毒害作用 的 H2O2是造成目前为止筛选到的 PVA降解菌数量 不多的重要原因,Tokiwa等在筛选固体培养基中加 入过氧化氢酶以分解掉 H2O2,有针对性的筛选出能 够产生 PVA氧化酶的 SphingomonasstainTJ-7和待 鉴定的菌株 TK-2。 国内也有研究者进行了一些这方面的研究,王 银善等人[14]分离出 PVA降解共生菌,分别为 Pseudo monassp.SB1r和 Alcaligenessp.SB1s,菌株 SB1r为 菌株 SB1s降解 PVA提供生长因子,菌株 SB1r产生 的生长因子是什么物质目前为止没有研究清楚。廖 劲松等[15]将筛选到的能够降解 PVA的菌株进行了 原生质体融合,并将融合子菌株用于培养活性污 泥。李朝等[16]筛选到有降解 PVA能力的红球菌。 目前为止,研究者们得到的能够降解 PVA的 微生物基本上都是细菌,并且绝大部分是假单胞菌 属,除了PseudomonasO-3[1]和 Pseudomonasvesicularis var.povalolyticulPH[6],其余的细菌都不能单独彻底 降解初始培养基中的 PVA,PVA的不彻底降解造 成 PVA降解酶的提取困难,因为在提取过程中 PVA和蛋白会形成一种乳白色的凝胶状物质[14],使 PVA降解酶无法提取。并且这些细菌都存在培养周 期长,酶活低的问题。 Chiellini等[17]认为要靠单一微生物实现对 PVA 的彻底降解是非常困难的,只有通过驯化混合菌群 才能达到对这种高聚物的彻底降解,Chiellini等从 一个造纸厂污水处理污泥中得到一个混合细菌体 系,经过驯化后被用来研究对 PVA的降解特性[17]。 该混合体系降解 PVA的能力受 PVA聚合度的影响 不大,而受醇解度的影响很大;在 PVA聚合度相同 时,该混合体系降解高醇解度的 PVA有一个明显 的延滞期。Chiellini等从该混和体系中没有分离出 能够单独彻底降解 PVA的纯菌株[17],得到一株只 能利用低分子量 PVA进行生长的细菌,该细菌也 不能彻底降解其所能利用的低分子量的 PVA。 本研究室在前期的研究工作中首次报道了能 够降解 PVA的青霉[18]和能够降解 PVA的放线菌[19], 并对它们产生 PVA降解酶的发酵条件进行了初步 研究。 2 PVA降解酶 如前所述,如果能在退浆工段就实现对 PVA 的生物降解,不仅能大大减少 PVA废水的排放,还 能避免化学退浆过程中高温和氧化造成的棉纤维 损伤。在实际应用过程中,酶制剂比微生物制剂更 为方便和有效。因为 PVA降解微生物在降解 PVA 52 hp 高亮 hp 高亮 2007年第6期 时还需要有其他营养因素及氧的存在,而且降解速 度比较慢,很难在棉织品染整中应用。反之,酶制剂 的反应速度较快,只要满足有限的几个条件(如温 度、pH、离子强度等)就可以较快地降解 PVA。要达 到这一目的,需要生产大量的 PVA降解酶。因此, PVA降解酶的发酵法生产、提取、酶学性质及其应 用条件一直以来都是 PVA生物降解研究的重点之 一[1~6,10,12,14,20~23]。 目前已正式报道的 PVA降解酶主要包含三个 种类[20]:PVA氧化酶(仲醇氧化酶)(EC1.1.3.30)、PVA 脱氢酶(EC1.1.99.23)和氧化型 PVA水解酶(β-双 酮水解酶)(EC3.7.1.7)。近年还发现了专一性比较 强的降解低醇解度 PVA长链上残存乙酸酯键的 PVA酯酶[21]。目前已报道的 PVA降解酶及其产生 菌和研究者,如 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1所示。表 1中报道的大部分 PVA氧化酶是胞外酶,但膜结合 PVA氧化酶也是存 在的[4],而且生长细胞产生的这种 PVA氧化酶 95% 以上分布于细胞的外周质空间。 表 1 已有报道的 PVA降解酶及其产生菌和研究者 Suzuki等从 PseudomonasO-3[1]的发酵液中分离 出的是 PVA氧化酶和氧化型 PVA水解酶的混合 物。PseudomonasO-3产生的 PVA氧化酶可以将 PVA长链上的羟基氧化为羰基,此外还能够氧化一 些仲醇类物质,氧化反应中脱离下来的 H+和 O2结 合生成 H2O2。 Watanabe等[2]从 Pseudomonassp.的发酵液中得 到的 PVA降解酶在降解 PVA时产生 H2O2,H2O2生 成后一段时间 PVA溶液粘度才开始下降[22],研究 者推测 PVA长链上羟基的氧化和 PVA链的断裂不 是同时发生的,羟基被氧化成羰基的反应发生在 PVA链断裂之前。经过进一步的分离纯化,从初始 纯化出来的 PVA降解酶中得到了 PVA氧化酶和氧 化型 PVA水解酶[23]。但是 Watanabe等在初期和后 期研究报道中对 Pseudomonassp.是否纯培养物的 矛盾说明他们纯化出来的 PVA降解酶有可能不是 一种细菌产生的[2,3]。 Kawagoshi等[7]从 Pseudomonasvesicularisvar.po valolyticusPH的发酵液中纯化出了 PVA氧化酶, 并详细研究了该酶对醇类物质的氧化性。 Sakazawa等[4]得到 Pseudomonassp.VM15C产生 的 PVA脱氢酶是膜结合酶,能够催化 PVA长链上 的羟基进行脱氢氧化反应,以吩嗪甲基硫酸盐、吩 嗪乙基硫酸盐和 2,6-二氯酚靛酚为电子受体而不 象 PVA氧化酶一样以氧气作为电子受体。PVA脱 氢酶还能够催化仲醇的脱氢反应,对伯醇则无催化 活性。Shimao等还发现 PVA脱氢酶对 PVA的脱氢 氧化反应的进行伴随着细胞色素 c的减少,并在对 该酶展开基因工程研究过程中发现在可能编码该 酶的基因序列中有细胞色素 c的结合位点,由此推 测PVA的降解和呼吸传递链相关联[6]。Hatanaka等[5] 筛选到的 Pseudomonassp.113P3也产生以 PQQ为 辅酶的 PVA脱氢酶。Matsumura等从 Alcaligenes faecalisKK314中纯化出了依赖 PQQ的 PVA脱氢 酶[11,12],发现该酶同时具有 β-羟基酮醛缩酶的活性, 该酶作用 PVA类似物先形成 β-羟基酮类物质,β- 羟基酮类物质再被降解为甲基酮和醛,醛再被这个 酶进一步脱氢氧化生成羧酸,用脱辅基酶蛋白也可 以进行形成 β-羟基酮化合物的降解反应。 王银善等人[14]分离出的需要生长因子的菌株 Alcaligenessp.SB1s产生的是胞外的 PVA氧化酶, 与国外研究者的报道不同的是,需要辅酶的 PVA 张颖等:聚乙烯醇生物降解研究进展 53 生物技术通报Biotechnology Bulletin 2007年第6期 氧化酶还未见报道。 国内外研究者对 PVA降解酶的纯化分离已开 展了一定的工作,但是由于 PVA降解酶是一个酶 系,要几种不同的酶协同作用才能彻底降解 PVA, 在同一条件下同时提取这几种酶难度较大 [1~ 6,10,12,14,20,23],特别是一些膜上酶,由于纯化过程中要 制备胞膜,目前只进行了部分纯化[4~5,11,12],酶学性 质研究用的也不是纯酶。另外,PVA降解酶产生菌 培养周期长、酶活低,加上 PVA降解不彻底导致 PVA降解酶无法纯化,所以至今还没有关于发酵法 批量生产 PVA降解酶的报道。 3 PVA生物降解机理研究 迄今已报到的 PVA降解酶主要包含 3个种 类:PVA氧化酶、PVA脱氢酶、氧化型 PVA水解酶, 研究者们对这 3类酶的催化反应机理做了一定的 探索。 由于不同研究者所采用的菌种不同,研究涉及 的 PVA降解酶的组合种类也不相同 (一种组合是 PVA氧化酶与氧化型 PVA水解酶,另一种组合是 PVA脱氢酶与氧化型 PVA水解酶),因此对 PVA 降解酶催化降解 PVA的机理也存在不同的观点。 目前来说较为一致的看法是[25]:PVA须经两步酶催 化过程才得以降解,第一步由 PVA氧化酶在以 O2 为电子受体的条件下,或由 PVA脱氢酶以 PQQ为 电子受体的情况下,将 PVA脱氢氧化为酮基化合 物。对第二步的反应,一种观点认为 PVA被 PVA 氧化酶或 PVA脱氢酶催化氧化为氧化型 PVA以 后,再被氧化型 PVA水解酶催化裂解;而另一种观 点则认为氧化型 PVA的水解反应是自发进行的[24], 氧化型 PVA的自发水解主要是由于其分子结构的 不稳定性所造成的,而氧化型 PVA水解酶能加速 这种裂解反应。PVA生物降解可能存在的途径,如 图 1所示[25]。 但是以上结论不是直接以 PVA作为 PVA降解 酶的作用底物得到的,而是利用一些醇类化合物或 者类似乙烯醇的缩合物为酶的作用底物,根据实验 结果推论出来的[3],这可能是因为现有的 PVA均是 聚合度呈现正态分布的混合物,在降解过程中会造 成产物过于复杂不利于分析造成的,所以研究者们 只能用一些结构和 PVA类似的简单化合物来模拟 PVA的降解过程,PVA的实际降解过程是否如这 些研究者所假设的还有待进一步验证。 Sakai等[21]发现专门水解低醇解度 PVA长链上 乙酸酯键的酯酶,并认为在胞外被 PVA氧化酶和 氧化型 PVA水解酶切断的小分子量的 PVA会进入 微生物的细胞内,并在细胞内被进一步降解。 4 结论 从目前研究者们的研究结果来看,PVA降解菌 在大自然中并不是广泛存在的,并且单一菌株降解 PVA的效率很低,经过长时间的培养仍难以达到彻 底降解 PVA的目的[17]。目前为止仅有 Pseudomonas O-3[1]和 Pseudomonasvesicularisvar.povalolyticulPH[6] 能够单独基本降解它们各自筛选培养基中的 PVA。Watanabe等[2]报道他们的研究小组筛选到一 株能够单独彻底 1g/LPVA的 Pseudomonassp.,但 是在研究 PVA的降解机理时又说筛选到的是 Pseudomonas属几株菌的一个混合培养体系[3],前后 矛盾。有研究者认为要靠单一微生物实现对 PVA 的彻底降解是非常困难的,只有通过驯化混合菌群 才能达到对这种高聚物的彻底降解[17]。而 PVA的 不彻底降解会造成 PVA降解酶的提取困难,因为 在提取过程中 PVA和蛋白会形成一种乳白色的凝 胶状物质[14],使 PVA降解酶无法提取。共生细菌产 生的 PVA脱氢酶位于细胞膜上,提取不易,而且在 其降解 PVA过程中必须外加 PQQ,使用成本昂贵 [4,5,11,12],将其应用于纺织退浆未见报道。PVA降解 酶产生菌种类不多,并且培养周期长,酶活不高,再 加上提取不容易,这些都阻碍了 PVA降解酶在实 际生产上的运用。 因此,积极开展 PVA生物降解机制等方面的 研究将有助于 PVA降解高效菌的筛选和实现 PVA 图 1 PVA可能存在的生物降解途径[25] (下转第58页) 54 生物技术通报Biotechnology Bulletin 2007年第6期 (上接第54页) !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 降解酶在实际生产上的运用,对于减轻环境污染将 具有重大的意义。 参考 文献 1 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