还原糖测定
实验二 食品中还原糖及总糖的测定 实验项目性质:基础验证实验
所属课程名称:生物化学
实验
计划
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学时:6学时
一、实验目的与要求
实验目的:
通过本实验的学习能够使学生掌握DNS比色测定糖浓度的基本
方法
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。通过本实验使学生进一步熟练掌握分光光度计及低速离心机等生化设备的使用。 实验要求:
1、了解掌握糖类相关知识，并熟练掌握分光光度计的使用方法。
2、三人一组，互相配合开展实验，动手完成实验，并记录并分实验中的实验现象、数据，必要时及时修改实验计划。
3、总结试验数据，在老师认定后，撰写实验报告。 二、实验原理
利用3，5,硝基水杨酸比色定糖法(DNS法)进行测定。3，5-二硝基水杨酸溶液与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和棕红色物质颜色深浅的程度成一定比例关系，可用于比色测定。操作简便，快速，杂质干扰较少。
还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(还原糖以葡萄糖含量计)。
还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm 波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。
三、实验主要仪器设备
1(恒温水浴
722型分光光度计 2(
四、实验方法、操作步骤
(一)葡萄糖标准曲线的制定
葡萄糖标准液的配制:准确称取100mg分析纯的无水葡萄糖(预先在105?干燥至恒重)，用少量蒸馏水
溶解后，定量转移到100mL容量瓶中，再定容到刻度，摇匀。浓度为l mg/mL。
取9支25mm×250mm的试管，分别按下
表
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加入试剂:
0 1 2 3 4 5 6 7 8 项目
葡萄糖标准液
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
(mL)
相当于葡萄糖
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
量(mg)
2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 蒸馏水(mL)
DNS试剂1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
(mL)
将各管溶液混合均匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即用冷水冷却到室温，再向每管加入21.5mL蒸馏水，摇匀。于540nm波长处测定吸光度。以葡萄糖mg数为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。
(二)还原糖待测样品的制备
可选取固体样品(马玲薯粉、小麦粉、方便面、饼干等)或液体样品(各种含糖饮料)进行测定，粉末状固体样品和液体样品可直接进行测定，非粉末固体样品可使用研钵研磨成粉末再进行测定。
固体样品:准确称取1g固体粉末样品，放在100mL烧杯中，先以少量水调成糊状，然后加50,60mL蒸馏水，于50?恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液(含沉淀)转移到离心管中，于4000r/min下
离心5min，沉淀可用20mL 蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，即为还原糖待测液。
液体样品:可直接测定或适当稀释。
(三) 总糖待测样品的制备(固体样品)
准确称取1g固体粉末样品，放入100mL 三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL 6mol/L HCl，置沸水浴中加热水解30min(水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查。取出1,2滴置于白瓷板上，加1滴碘一碘化钾溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色)。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用10% NaOH中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液转入100mL离心管4000r/min离心5min，取上清液10mL，移入另一100mL 容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。
(四)样品中糖含量的测定:取5支 25mm ×250mm试管分别按下表加入试剂:
空白 还原糖 总糖
项目
0 1 2 3 4 样品溶液(mL) 0 1.0 1.0 1.0 1.0 蒸馏水(mL) 2 1.0 1.0 1.0 1.0 DNS试剂(mL) 1.5 1.5. 1.5 1.5 1.5
加完试剂后，其余操作均与制作标准曲线时相同。测定后，取样品的吸光度的平均值在标准曲线上查出
相应的糖量。用下式计算出马玲薯粉(或红薯粉、小麦
粉)中还原糖与总糖的百分含量。
浙公网安备 33021202002483