青霉素影响甜菜夜蛾幼虫耐受几种苏云金杆菌晶体蛋白的能力

青霉素影响甜菜夜蛾幼虫耐受几种苏云金杆菌晶体蛋白的能力 青霉素影响甜菜夜蛾幼虫耐受几种苏云金 杆菌晶体蛋白的能力 主氢物镳如2011.37(6):112—114PlantProtection 青霉素影响甜菜夜蛾幼虫耐受几种苏云 金杆菌晶体蛋白的能力 陈瑞瑞,崔金杰.,李国清 (1.南京农业大学植物保护学院/教育部病虫害综合治理重点开放实验室,南京 210095; 2.中国农业科学院棉花研究所/棉花生物学国家重点实验室,安阳455000) 摘要本文评估了CrylAb,CrylBa和CrylCa蛋白对甜菜夜蛾2龄幼虫的毒力,其 LCso分别为0.4425, 0.6757/*g/cme和0.1502t*g/cm2,CrylBa毒力最低,其次是CrylAb,而CrylCa毒力最 高.青霉素影响幼虫对晶 体毒素的耐受能力;一次添加高剂量(500/*g/cm2)青霉素于饲料中显着提高幼虫 的耐受能力,以含低剂量(6Og/ cm2)青霉素的饲料饲养幼虫多代也能达到相似的效果. 关键词苏云金杆菌;晶体毒素;甜菜夜蛾;青霉素;毒力 中图分类号:S476.11文献标识码:ADOI:10.3969/j.issn.0529—1542.2011.06.021 PenicilliningestioninfluencestoxiceffectsofseveralCrytoxinsfrom BacillusthuringiensisonSpodopteraexigualarvae ChenRuirui,CuiJinjie,LiGuoqing (1.KeyLaboratoryofIntegratedManagementofCropDiseasesandPestsofMinistryofEduc ation,Collegeof PlantProtection,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China;2.ResearchInstit uteofCotton, ChineseAcademyofAgriculturalSciences~StateKeyLaboratoryofCottonBiology,Anyan g455000,China) AbstractToxicitiesofCrylAb,CrylBaandCrylCafromBacillusthuringiensistothe2nd-instarlarvaeofSpo— dopteraexiguawereevaluated.TheLC50valueswere0.4425/~g/cm2,0.6757/lg/cm2and0.1502tzg/cm2,respec— tively.CrylBawasleasttoxic,followedbyCrylAb,andCrylCawasmosttoxic.Penicillinaffectedlarvaltolerance tothe3Crytoxins.Attheconcentrationof500/*g/cm2,penicillinmixeddirectlywiththetoxinscouldsignificantly increaselarvaltolerance.Attheconcentrationof60/~g/cmz,however,penicillinshouldbefirstaddedalonetothe dietforthelarvaeforsevera1generationstoobtainsimilartolerance. KeywordsBacillusthuringiensis;Crytoxin;Spodopteraexigua;penicillin;toxicity 转苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)晶体毒 素(Crytoxin)基因的棉花品种在我国已大面积种植 多年.其应用提高了棉花的抗病虫能力,产量,质量 以及棉农的收入,减轻了环境污染,防止了农药中 毒.但近几年转基因棉花却受到甜菜夜蛾(Spo, dopteraexigua)越来越严重的为害l1].原因之一是 转入棉花品种的Cry毒素基因大都由crylAc基因 改造而来,其产物对甜菜夜蛾幼虫毒力差l2].国外 的研究结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,CrylAb,CrylBa和CrylCa对甜 菜夜蛾的毒力均显着高于CrylAc,是理想的替代毒 素.但由于甜菜夜蛾幼虫对Cry毒素的耐受能力常 受地理种群的影响E2-3],因此这3种晶体毒素对我国 甜菜夜蛾幼虫的毒力需重新评估. 此外,晶体毒素对鳞翅目害虫的毒力还受幼虫肠 道微生物种类的影响.若杀灭舞毒蛾(Lymantria dispar),小红蛱蝶(Vanessacardui),烟草天蛾 (Manducasexta),菜粉蝶(Pierisrapae)和烟芽夜 蛾(Heliothisvirescens)幼虫的中肠细菌,则其对Bt 制剂或晶体毒素的耐受能力显着提高_4].但同样 措施却降低了棉红铃虫(Pectinophoragossypiel一 收稿日期:2011一O9一l4修订日期:2011—10—11 基金项目:转基因生物新品种培育科技重大专项(2008X08011—002,2011ZX08011 —002) *通信作者E-mail:liguoqingO01234@yahoo.COIILcn 37卷第6期陈瑞瑞等:青霉素影响甜菜夜蛾幼虫耐受几种苏云金杆菌晶体蛋白的 能力?113? la)E和小菜蛾(Plutellaxylostella)[的耐受能力. 可见,中肠微生物是否影响幼虫耐受晶体毒素的能 力,不仅随虫种而不同,而且还随试验 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 和地理种 群而变化. 鉴于此,本文测定了我国甜菜夜蛾幼虫对 CrylAb,CrylBa和CrylCa的耐受能力以及青霉素 处理对耐受能力的影响,结果如下. 1材料与方法 1.1供试虫源 甜菜夜蛾幼虫于2009年秋采自江苏省南京市 东郊小白菜田.于养虫室内常规饲养至今.饲养条 件:温度(26?1)?,相对湿度70,8O,光周期L //D一14h//10h(光照时间为07:00~21:00).人 工饲料配方参考黄春露等E.老熟幼虫在剩余饲 料中化蛹后,统一剥蛹,在光学解剖镜下根据生殖 孔区分性别并分别保存于培养皿中.成虫羽化后, 约20对雌雄蛾放置于养虫笼内,并用医用纱布覆 盖笼口,任其交配并产卵.饲以5蔗糖水且每天 定时更换.每天收集产于纱布上的卵,用于继续饲 养或试验. 1.2试验方法 1.2.1晶体毒素和青霉素溶液的配制和稀释 苏云金杆菌晶体毒素共3种,即Cry1Ab, CrylBa和CrylCa,均为活化毒素,购于美国一龙公 司(EnvirologixInc.).取1mg晶体毒素 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品溶 解于5mLpH为10的磷酸盐缓冲液(PBS)中,终浓 度为0.2mg/mL.再进一步用pH为7.4的PBS 稀释,形成一系列浓度相差2倍的溶液. 纯品青霉素购置于Sigma公司.先用丙酮配制 成浓度为5mg/mL的母液,再于试验前进一步用 pH为7.4的PBS稀释,形成一系列浓度相差2倍 的溶液,随配随用. 1.2.2生物测定 在24孔细胞培养板中每孔加1n刚配好的甜 菜夜蛾饲料,振平冷凝.随后每孔加入溶液200, 其中晶体蛋白溶液和青霉素溶液各100L.若只 需加入一种待测物质,则以pH为7.4的PBS液补 充.对照加入pH为7.4的PBS液200p.L.待加 入溶液被饲料吸收,形成均匀药膜后用于试验. 将2龄初大小一致的试虫接人24孔细胞培养 板中,每孔1头,重复3次.放置于养虫室内饲喂 6d后检查结果.死亡试虫判断标准为:1)试虫用昆 虫针刺激后无自主反应;2)刺激后虽有正常自主反 应,但体重<7mg.… 1.2.3加入青霉素累代饲养幼虫 在人工饲料中加入一定量青霉素溶液,使最终 浓度为60ttg/cm.将未孵化卵块接入,累代饲养 试虫. 1.3数据分析 采用几率值分析法得到浓度对数与死亡率几率 值的回归线.计算LC.和95置信限.不同处理 间LCs.差异的显着性根据其95置信限是否重叠 判断. 2结果与分析 2.1摄食青霉素影响甜菜夜蛾幼虫对晶体毒素的 耐受性 甜菜夜蛾幼虫对3种晶体毒素的耐受能力不 同,对CrylBa最不敏感,LC5.最高;其次是CrylAb, LCso次高;而对Cry]Ca最敏感,LC5.最低.对3种 晶体毒素LC.的95置信限不重叠,表明幼虫对这 3种晶体毒素的耐受能力存在显着差异(表1). 单独饲喂只含青霉素的饲料时,浓度从30P-g/ cm到500t*g/cm均不引起幼虫的死亡.而饲料 中同时加入晶体毒素和青霉素后,相对毒力指数一 般大于1,表明青霉素的摄人增加了甜菜夜蛾幼虫 耐受晶体毒素的能力.耐受能力的提高幅度则与加 入青霉素的量相关.在测定的剂量范围内,加入量 越多,提高幅度越大(表1). J go.16 ? 望 0.08 O.OO 未饲喂饲喂1代饲喂3代 图1累代喂食青霉素对甜菜夜蛾 幼虫耐受CrylCa能力的影响 ? 114?艋扬饶妇2011 表1Bt晶体蛋白单独或与青霉素共同混合于人工饲料中对甜菜夜蛾2龄幼虫的毒 力 2.2含青霉素饲料累代饲养对甜菜夜蛾幼虫耐受 能力的影响 以含有青霉素的饲料饲养试虫1代后,其后代 幼虫对CrylCa的耐受能力略有提高,但根据置信区 间不重叠的标准判断,与对照试虫差异显着.以含 有青霉素的饲料继续累代饲养3代,对CrylCa的耐 受能力虽进一步增高,但增长幅度变小(图1). 3讨论 国外研究发现,晶体毒素的毒力受幼虫肠道微生 物种类的影响.但这种影响不仅随虫种不同,而且随 试验方法和地理种群变化,至今没有一致结论.同时 前人的研究方法还存在以下不足:1)清除肠道微生物 常采用加入抗生素的方法,且加入量太大,常达到500 /~g/g饲料.这影响了幼虫正常生理生化过程,间接 改变了幼虫对毒物的耐受能力L6].2)加入的抗生素 由青霉素,庆大霉素,利福霉素和链霉素混合而成,不 能判断到底是那些菌影响了幼虫的耐受能力. 为了弥补前人研究方法的不足,本文测定了青 霉素影响幼虫耐受能力的剂量效应.虽然在试验过 程中,青霉素不可避免地发生了部分降解,但试验结 果还是表明,500/~g/cm和250gg/cmz青霉素显 着提高幼虫对3种晶体毒素的耐受能力;当浓度进 一 步降低时,青霉素对幼虫耐受晶体毒素的能力影 响不大. 可见,抗生素与晶体毒素同时使用,在抗生素剂 量过高时影响幼虫正常生理生化,而在剂量过低时又 无明显诱导效果.为了克服这一矛盾,本文进一步测 定了添加低剂量青霉素于饲料中累代饲养幼虫对其 耐受能力的影响.结果表明,幼虫用含6Og/Gin2青 霉素的饲料饲养1代,能略微提高其对CrylCa的耐 受能力;连续饲养多代并不进一步提高其耐受能力. 可见,这一方法虽可克服抗生素与晶体毒素同时使用 方法的弊端,但能否应用于后续研究尚需进一步的试 验证实.同时,本文未能证实幼虫肠道微生物是否确 实受抗生素的影响,这也待后续试验证明. 参考文献 E1]郑霞林,王攀,王小平,等.转基因棉甜菜夜蛾的为害现状,暴 发成因及防治现状_J].植物保护,2010,36(3):34—38. 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