毕赤酵母表达系统实验手册(实验室版)

毕赤酵母表达系统实验手册(实验室版) 南方医科大学临床免疫研究中心实验方法学文件 文件编号: 毕赤酵母表达系统实验手册 撰稿 (一) 毕赤酵母表达原理(四号加粗仿宋_GB2312) 毕赤酵母表达系统经过近多年发展，已基本成为较完善的外源基因表达系统，具有 易于高密度发酵，表达基因稳定整合在宿主基因组中，能使产物有效分泌并适当糖基化，培养方便经济等特点。利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素C片段、基因工程抗体等多种外源基因，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模。毕赤酵母系统的广泛应用，主要有以下几个优点: 1、 具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子 之一; 2、 表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合; 3、 菌株易于进行高密度发酵，外源蛋白表达量高; 4、 毕赤酵母中存在过氧化物酶体，表达的蛋白贮存其中，可免受蛋白酶的降解， 而且减少对细胞的毒害作用。 毕赤酵母宿主菌常用的有GS115 和KM71 两种， 都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115 ，茵株具有AOX1基因,是Mut，即甲醇利用正常型;而 KM71 菌株的AOX1位点彼 ARG4 基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。 毕赤酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达，包括启动子、外源基因克隆位点、终止序列、筛选标记等。表达载体都是穿梭质粒，先在大肠杆菌复制扩增，然后被导入宿主酵母细胞。为使产物分泌胞外，表达载体还需带有信号肽序列。毕赤酵母表达系统有多种分泌型表达质粒，有许多蛋白在毕赤酵母得到了高效分泌表达。胞外表达需要在外源蛋白的N末端加上一段信号肽序列，引导重组蛋白进入分泌途径，可使蛋白蛋白质在分泌到胞外之后获得准确的构型。毕赤酵母对外源蛋白自身的信号序列识别能力差，在本试验中所使用 Ppic9K 质粒，其信号肽来自酿酒酵母的 α-交配因子(α-factor)，能很好的达到以上的要求。并且作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它还拥有一个特点是其具有 G418抗性标记基因，给我们筛选转化子的工作带来很大的便利。 Ppic9K质粒是作为新一代的毕赤酵母分泌表达质粒，它的主要特点简介如下: 南方医科大学临床免疫研究中心实验方法学文件 文件编号: 1、具强效可调控启动子AOX1(alcohol osidase，醇氧化酶); 2、G418抗性筛选标记基因，重组转化子可直接用G418进行筛选，即在YPD平板上生长的转化子中，100,都有外源基因的整合，大大简化了重组转化酵母的筛选过程。操作过程中，表达载体 Ppic9K的大肠杆菌转化子则用Ampicillin来筛选，经济而简便; 3、在表达载体AOX1 5’端启动子序列下游，有供外源基因插入的多克隆位点，多克隆位点下游有 A0X1 3’端终止序列; 4、分泌效率强的信号肽α-factor，Invitrogen 公司开发的毕赤酵母表达系统的系列产品作为目前被应用为最为广泛的酵母表达系统，其主要的优点有:醇氧化酶可调控的强启动子，能高密度发酵，重组蛋白表达量高。外源基因整合在酵母基因组上，可以稳定存在。同时，高效分泌表达质粒能将外源蛋白表达后，进行翻译后加工处理，将外源蛋白分泌到细胞外，不但提高表达蛋白的活性，而且，有利于产物的纯化。(正文小四号仿宋_GB2312) (二) 毕赤酵母表达试验步骤 1.1 毕赤酵母转化 1.1.1 菌体的准备: 1. 取保存GS115甘油菌种，于YPD平板中分离单菌落，30?培养2,3天; 2. 挑取酵母单菌落，接种至含有 5ml YPD 培养基的 50ml 三角瓶中，30?、250,300r/min培养过夜; 3. 取100-500µl的培养物接种至含有500ml YPD培养基的2L三角摇瓶中，30?、250,300r/min 培养过夜，至 OD600 达到 1.3,1.5; 4. 将细胞培养物于 4?，1500g 离心 5min，用 500ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬; 5. 按步骤4 离心，用250ml 的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬; 6. 按步骤4 离心，用20ml 的冰预冷的 1mol 的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬; 7. 按步骤4 离心，用 1ml 的冰预冷的 1mol 的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，终体积约为1.5ml; 8. 每支80µl分装，-80?冻存备用。 1.1.2 电转感受态 1. 将 5,20µg 的线性化 DNA 溶解在 5,10µl TE 溶液中，与 80µl 的上述步骤 7所得的感受态混匀，转至 0.2cm 冰预冷的电转化杯中; 南方医科大学临床免疫研究中心实验方法学文件 文件编号: 2. 将电转化杯冰浴5min; 3. 调节点击参数，电压 1.5kV;电容 25µF;电阻 200Ω。电击时间为 4,10msec，进行电击; 4. 电击完毕后，加入 1ml 1mol 冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至 1.5ml 的 EP 管中，30?水浴1h; 5. 将菌体悬液涂布于MD平板上，每 150,200µl 涂布一块平板; 6. 将平板置于 30?培养，直至单个菌落出现。 1.2 重组子的筛选 1. 用牙签挑取上述单菌落，同时划于MD板和G418 1.5mg/ml的平板中，30?放置24h; 2. 挑取G418 1.5mg/ml平板中生长较好，对应MD板上的单菌落，同时划于MD板和G418 ?放置24h; 3.0mg/ml的平板中，30 3. 挑取G418 3.0mg/ml平板中生长较好，对应MD板上的单菌落，同时划于MD板和G418 4.0mg/ml的平板中，30?放置24h; 1.3 重组蛋白诱导表达 1. 挑取G418 4.0mg/ml平板中生长较好，对应MD板上的单菌落，置于装有5ml YPD培养基的50ml摇瓶中，于30?，280 rpm培养至OD600 = 2,6 (16,18 h); 2. 部分保留菌种，取1ml于装有40ml BMGY培养基的250ml摇瓶中，280 rpm培养至OD600 = 2,6 (16,18 h); 3. 室温下1500,3000g离心5min，收集菌体，用15ml BMMY重悬菌体，所得的菌液置于250ml的摇瓶中，用封口纸封口，放置于30?，280 rpm的摇床上继续生长; 4. 每24h向培养基中添加100, 甲醇至终浓度为0.5,1.0%; 5. 按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5ml EP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体， 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取:0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h; 6. 对分泌表达，分离样品的上清液;对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80?C保存备用; 7. 用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。 (三) 试剂器材 南方医科大学临床免疫研究中心实验方法学文件 文件编号: 1. Trypton、Peptone、Yeast Extract、YNB W/O Amino acid、Argar、Dextrose(Glucose)、Sorbital、NaCl，Methanol 2. 天枰、PH计、摇床、磁力搅拌器，紫外分光光度计等 3. 各种母液的配制 3.1 1M 磷酸钾溶液(potassium phosphate buffer，pH6.0): 将 1mol/L 的 K2HPO4 溶液 132ml与 1mol/L的 KH2PO4溶液 868ml混匀，其 pH为 6.0，如需调节 pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH; 3.2 10% 甘油 (Glycerol): 将 100ml 甘油和 900ml 水混匀后，高压灭菌或过滤除菌，保存期为 1 年以上。 3.2 SOC培养基: Trypton l, Yeast Extract 0.5, NaCl 0.05, Glucose (1mol / L) 2% 121?高压灭菌 20min，冷却后，4?保存。 4. 毕赤酵母表达的培养基配制 4.1 LB(Luria,Bertani)培养基: Trypton l, Yeast Extract 0.5, NaCl l, PH 7.0 制作平板时加入 1.5,琼脂粉。121?高压灭菌 20min。可于室温保存。用于培养 Ppic9K 原核宿主菌DH5α或TG1时可加入 Ampicillin 25ug / ml; 4.2 LLB(Low Salt LB)培养基: Trypton l, Yeast Extract 0.5, NaCl 0.5, PH 7.0 制作平板时加入1.5,琼脂粉。 121?高压灭菌 20min。可于室温保存数月。用于培养 南方医科大学临床免疫研究中心实验方法学文件 文件编号: Ppic9K 原核宿主菌DH5α或TG1时可加入 Ampicillin 25ug / ml，可以 4?条件下保存 1,2 周。 YEPD): 4.3 YPD (又称 Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基) Peptone 2% Dextrose (glucose) 2% Yeast Extract 1% 液体 YPD培养基可常温保存;琼脂 YPD平板在 4?可保存几个月。 YPD G418 4.4 母液先用上述YPD液配成50mg/ml，稀释成1.5 mg/ml、 3.0 mg/ml 、4.0 mg/ml，同时制作平板备用。 4.5 MD平板制备 YNB 13.4% Dextrose (glucose) 2% 灭菌前，加入 1.5%的琼脂粉，4?可保存数月。 4.6 BMGY及BMMY配制 所用试剂 BMGY(800ml) BMMY(300ml) 蒸馏水 560ml 240ml Yeast Extract 8g 3g Trypton 16g 6g 1M磷酸缓冲液 80ml 30ml 10×甘油 80ml 10×YNB 80ml 30ml PH值 PH6.0-6.2 PH6.0-6.2 40ml每瓶 15ml每瓶 (四) 注意事项 4.1 信号肽识别位点的设计 南方医科大学临床免疫研究中心实验方法学文件 文件编号: 如果质粒 Ppic9K双酶切中丢失了 KEX2蛋白酶的酶切位点 Lys,Arg，应该在上游中，增加了编码Lys、Arg的密码子AAA、AGA，酵母细胞膜中的KEX2蛋白酶是α-factor信号肽的切割酶，它能有效识别酶切位点 Lys,Arg，通过对信号肽的切割使基因表达产物释放至胞外。 4.2 密码子的偏好性的原则 酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析外源基因表达的规律有重要意义,也为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据。 4.3 线性化及采用电转化的原因 Ppic9K-Gene电转整合入 GS115 的时候，因为需要比较高的转染率，我们对其用限制 Sal?或Bgl II进行线性化的处理。细菌内同源重组被认为是重组质粒构建过程性内切酶 的难点。因为未线性化的环状质粒之间发生同源重组的几率非常低，所以重组转移载体必须用特定的限制性内切酶进行线性化处理。这 种处理的目的: ?防止随机插入重组时质粒在功能区断开，造成目的基因表达失活; ?让同源重组以指定的方式发生。 4.4 构建分泌型表达载体的必要性 外源基因表达产物分泌到酵母细胞外，是表达外源基因的一种理想方式。相当一部分有药理学作用的蛋白质本身就是分泌蛋白质，在分泌过程中通过一系列细胞器，使蛋白质得以加工、修饰、折叠，形成与天然结构更为相似，具有高度生物活性的蛋白质(外源基因若以非分泌形式表达，不通过分泌途径，必然会失去一些对蛋白质进一步加工和修饰的机会，从而影响产物的空间结构和生物活性。毕赤酵母自身分泌内源性蛋白很少，诱导培养基皆由小分子物质组成，成分简单，这为分泌至培养基中的外源基因表达产物纯化提供了极大方便，使纯化工艺变的简单易行，有助于提高表达量 4.5 如何减少PCR反应中的引物二聚体 减少引物形成二聚体的可能性: 退火温度设置不对，导致引物与模板的结合率降低。 引物设计不好，很容易形成二聚体。 如果碰到这种情况，可以尝试从以下几个方面解决: ?设计引物的时候首先要熟悉引物设计的一般的原理，参考一些资料，积累经验。如果 南方医科大学临床免疫研究中心实验方法学文件 文件编号: 条件允许的话，可以用比较靠得住的引物设计软件验证我的引物，如果没问题，则进行下一步。 ?改变退火温度一般引物合成后厂家会提供其 Tm值，可以根据这个温度为基准来做温度实验。如果你设计的引物里头有酶切位点和保护碱基，则此方法不行，可以用比较靠得住的引物设计软件来计算你引物中与模板结合部分的 Tm 值，然后以此为基准做温度实验。也可以根据自己的实际操作经验来解决问题。