浅论痘病毒克隆技术的探讨论文
浅论痘病毒克隆技术的探讨论文预读: 摘要:,材料与方法
下游引物,,下划线处分别为,,,,?和,,,?酶切位点.上述引物由大连宝生物工程有限公司合成.,基因的克隆与鉴定以绵羊痘病毒基因组,,,为
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,采用,,μ,体系进行,,,扩增.将纯化的,,,产物与,,,,克隆载体连接,并将连接产物转化至,,,α感受态细胞,挑取阳性克隆培养后小量制备质粒进行酶切鉴定,并测序.绵羊痘病毒,,蛋白的生物信息学分析将测序结果应用,,,，数据库,,,,,,,,,程序推导出相应的氨基酸序列,并应用,,,,,,服务器中法对,,,,,,蛋白和,,,,蛋白的核苷酸和氨基酸序列进行比对.二级结构、蛋白质柔性区域分析分别使用软件的法和法进行预测.蛋白中氨基末端和羧基末端,个功能域的三级结构使用,,，服务器进行预测.重组载体的构建及重组蛋白的诱导表达、纯化,,,重组载体和表达载体,,,,,,,,分别用酶切后,经琼脂糖凝胶电泳
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后用凝胶回收试剂盒回收目的条带,,,?连接过夜,并转化至,,,α感受态细胞.毒株绵羊痘病毒古浪株由中国农业科学院家畜疫病病原生物学国家重点实验室分子免疫与环境控制课题组分离、鉴定和保存.主要试剂,,？,,,聚合酶、载体、大肠杆菌菌株连接酶、限制性内切酶,,,,?和,,,?均购自大连宝生物工程有限公司;,,,,,,,,表达载体表达菌、,,,结合树脂和硝酸纤维素膜购自公司;氨苄青霉素、，,,,、弗氏佐剂和辣根过氧化物酶(,,,)标记的兔抗山羊，,,购自,,,,,公司;,,,标记的山羊抗小鼠，,,购自公司;化学发光底物购自公司;,光底片、显影及定影液均购自柯达公司;其他试剂均为进口分析纯.引物的设计与合成根据,,,,,,,中登录号为的基因组序列,利用软件设计了,对引物,预期扩增产物的大小为,,,,,.上游引物,,挑取阳性克隆培养后小量制备质粒进行酶切鉴定,并测序.将鉴定正确的重组载体转化至,,,,(,,,),,,,,感受态细胞,,,?振荡培养至时,加入，,,,至终浓度为,,,,,,,诱导培养离心,,,,,收集菌体,处理后进行检测.用裂解缓冲液重悬诱导表达的菌体,在冰浴条件下进行超声破碎(超声,,,停,,)至溶液澄清,离心,分别取上清和沉淀进行,,,,,,,,,分析重组蛋白,,,,,,的可溶性.重组蛋白使用,,,,,,,公司的,,,结合树脂进行纯化.重组蛋白鼠抗血清的制备及分析选取周龄的,,,,,;小鼠进行免疫:初次免疫时,用纯化后的重组蛋白,,,,,,与等量弗氏完全佐剂混合,经乳化后皮下多点注射;第,,天,用相同剂量的重组蛋白与弗氏不完全佐剂混合,乳化后加强免疫.二免后第,,天采血,分离血清,用纯化的重组蛋白,,,,,,包被,,，,,板,进行间接,,，,,试验,测定血清效价.
,,,,,,,,基因的序列分析与结构预测经测序分析
,,,,,,,基因全长,,,,,,编码,,,位氨基酸,分子质量约为.使用法分析,基因与,,,,,基因的核苷酸序列具有,,(,,的一致性,在氨基酸水平上具有,,(,,的一致性(,,(,,的相似性.从功能结构域的氨基酸序列分析蛋白的氨基酸末端序列与,,蛋白,,,,相比具有,,(,,的一致性(,,(,,的相似性),而羧基末端与,,,,相比具有,,(,,的一致性(,,(,,的相似性)使用法预测蛋白的二级结构,发现α,螺旋主要存在于位氨基酸;β,折叠主要分布于位氨基酸;利用法预测蛋白质柔性,结果表明较大的柔性区域分布于位氨基酸.根蛋白结构预测服务器,对,,,,,,蛋白的氨基末端和羧基末端,个潜在的功能结构域氨基酸序列进行蛋白三级结构的同源建模.构建的氨基酸区域分别为,,,,和,,,,,,,位氨基酸,参考模板分别为,,蛋白的,,,,,结合域和,,,的,,,,,结合域.序列一致性分别为,,(,,,和,,(,,,,,,值分别为,,,,和,(,,,,,,表明模型构建可靠.重组质粒的鉴定及重组蛋白的诱导表达与纯化经酶切鉴定(见图,)及测序鉴定,表明,,,重组载体构建正确.含有重组载体的,,,,(,,,),,,,,重组菌在浓度为,,,,,,,条件下诱导,,后,经
,电泳分析,显示在,,,,处表达出一条明显的条带,分子质量与预期大小一致.经可溶性分析,表明重组蛋白主要以可溶形式存在于菌体中,经,,,结合琼脂可纯化出目的条带重组蛋白,,,,,,鼠抗血清的制备分析用绵羊痘病毒
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阳性血清和制备的鼠抗血清对,,,,,,蛋白进行分析,结果显示所制备的鼠抗血清可以与重组蛋白发生反应.对制备的重组蛋白,,,,,,鼠抗血清进行间接,,，,,检测,其效价为.
,讨论
蛋白是痘苗病毒中重要的免疫逃避因子,主要由位于氨基酸末端的,,,,和羧基末端的,,,,两个关键的功能结构域组成.其中,,,蛋白的羧基末端能够通过其,,,,,结合域阻断病毒复制周期中产生的,,,,,,抑制了,,,,样受体、人视黄酸诱导基因,,，,样受体以及细胞内,,,和,,,等各类抗病毒信号通路和抗病毒分子的活性,病毒得以正常复制.目前,除了,,外,,,蛋白的同源蛋白在羊口疮病毒(,,,,)中已进行了较为深入的研究,结果显示在体外细胞试验中,,,,,,,蛋白取代,,,,蛋白后构建的重组病毒,,,,,,,,,与野生型,,致病性并无明显差别,但在动物试验中,的致病性显著降低.等报道,,,,基因组的第,,号开放阅读框编码,,,,蛋白的同源蛋白,表明,,,,可能编码类似,,,,蛋白的免疫逃避因子.,,,,主要引起感染绵羊全身皮肤(特别是身体无毛部分)出现典型的痘疮,造成家畜产奶量下降、体重减轻、流产率增加以及对肺炎和皮毛蝇蛆病的易感性增加,同时也会造成直接死亡.本试验中,笔者以绵羊痘病毒甘肃古浪株为模板克隆出绵羊痘病毒,,,同源基因,基因全长,,,,,,编码,,,个氨基酸.经过序列比对,,,,,,,蛋白与,,,,蛋白核苷酸序列的一致性达到,,(,,,而氨基酸序列一致性为,,(,,(相似性为,,(,,).从功能结构域角度分析,,,,,,,蛋白与,,,,蛋白,,,,的一致性只有,,(,,(相似性为,,(,,);而,,,,一致性虽然高达,,(,,(相似性为,,(,,),但在决定,,,,,结合活性的和,,,,氨基酸残基中,第,,,位氨基酸残基中,?,的突变可能使其,,,,,结合活性大大降低,推测,,,,,,蛋白对干扰素的抑制效应将会减弱.在本研究中,以,,,,,,,,为载体,表达出大小为,,,,左右的重组蛋白.利用纯化后的重组蛋白免疫,,,,,;小鼠获得鼠抗血清,经间接,,，,,测定效价
为.利用制备的抗体能够分析,,,,在感染细胞后,,蛋白的表达情况以及对,,,等抗病毒分子的影响,为阐明羊痘病毒的致病机理奠定了基础.
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