动物细胞膜的分离纯化及其在病毒受体研究中的应用_cropped

动物细胞膜的分离纯化及其在病毒受体研究中的应用_cropped Ξ 动物细胞膜的分离纯化及其在病毒受体研究中的应用 ΞΞ12 1 ,2 黄 战文斌王向东12 ( ) 中国海洋大学水产学院 ,青岛 266003 ; 中国水产科学研究院黄海水产研究所 ,青岛 266071 摘 要 : 细胞膜是动物细胞与胞外环境之间的屏障 。病毒只有与细胞膜上的病毒受体特异性结合 ,才能进 入细胞 ,进而启动其增殖周期 。因此 ,病毒受体是病毒学研究的重要组成部分 。分离纯化病毒受体所在的细胞膜 作为病毒受体研究的实验材料 ,已经在许多病毒的研究中得到应用 ,并取得了很好的效果 。现就动物细胞膜的分 离纯化及其在病毒受体研究中的应用作一综述 。 关键词 : 病毒 受体 细胞膜 细胞膜微囊 Purif ied Animal Plasma Membranes Applied in Study of Virus Receptor 1 , 2 2 ΞΞ1 Wang XiangdongHuang J ieZhan Wenbin 1 ( College of Fisheries , Ocean University of China , Qingdao 266003 ; 2 )Yellow Sea Fisheries Research Institute , Qingdao 266071 Abstract : Animal cells are bounded by plasma membranes . As a f irst step in virus infection , viruses attach to specif ic receptors on the plasma membranes of cells ; Cellular receptors play an important role in virus pathogenesis . To study the receptors on the cells plasma membranes , plasma membranes vesicles were purif ied f rom susceptible cells . It was proved that the purif ied plasma membranes were usef ul tool f or receptor and virus studies . The method of preparation of plasma membranes and the applications of plasma mem2 branes were reviewed in this article Key words : Virus Receptor Cell membrane Cell membrane vesicles 细胞与细胞外部环境的物质交换 、能量交换和 1 细胞膜的分离纯化 ( 信号传递都是通过细胞膜完成的 。细胞膜 本文专 1. 1 细胞的破碎方法 ) 指细胞质膜的分离纯化在上世纪 70 年代研究的比 分离细胞膜的第一步需要将细胞破碎 。不同生 较多 , 许多学者采用不同的方法成功地将细胞膜分 物体或同一生物体的不同组织 , 其细胞破碎难易程 离纯化出来 。常用的分离纯化方法是通过物理或者 度不一 , 破碎方法也不完全相同 。动物组织细胞常 化学的方法使细胞膜破裂 , 然后分别除去细胞内含 用匀浆的方法破碎 , 其中匀浆方法包括旋刀式匀浆 [1 , 2 ] 物 , 从而得到纯化的细胞膜。 手动式匀浆和高压匀浆 。培养的动物细胞常用超 [5 ] 病毒侵染细胞首先要与细胞膜上的病毒受体发 声 、低渗裂解、冻融裂解 、去垢剂渗透和有机溶剂生特异性的结合才能启动其增殖周期 。鉴于这一 渗透等方法破碎 。 点 , 许多学者分离纯化细胞膜作为实验材料 , 研究病 细胞破碎时会释放各种蛋白水解酶 , 导致蛋白 [1 , 3 , 4 ] 毒与细胞膜的相互作用, 实验 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 : 分离纯化 质的降解 , 因此细胞膜的整个提取过程应该在低温 出的离体的细胞膜在许多与病毒有关的实验中可以 下进行 , 并加入相应的蛋白酶抑制剂和二价金属离 取代活体细胞 , 甚至优于活体细胞 。 子熬合剂 。具体选择用哪几种蛋白酶抑制剂则要根 ( ) Ξ 国家重点基础研究发展规划项目课题 G1999012002资助 ( ) 作者简介 :王向东 1979 2, 男 , 中国海洋大学在读硕士研究生 , 从事病毒分子生物学研究() ΞΞ 通讯作者 :黄 1965 2, 男 , 研究员 , 博士生导师 , 从事水产病害控制与分子生物学研究 。 E - mail : aqudis2000 @ysf ri . ac . cn 每一种膜组分都有其特有的成分 , 因此常用膜 1. 2 细胞膜的分离 组分的某种成分含量的多少来判断所提取细胞膜的 1. 2. 1 差速离心法纯度 , 其中膜上的酶作为膜标志应用最为广泛 。在 该方法首先破碎细胞 , 然后根据沉降系数不同 分离纯化细胞膜时通过测定细胞膜的标志酶的活 分步离心沉淀细胞内含物 , 最后将细胞膜沉淀 。常 性 , 与完全匀浆液比较 , 计算各种膜制剂的回收率和 纯化倍数以及其他膜污染的程度 。其中质膜的标志 用的方法是首先用 Dounce 氏匀浆器将组织在冰浴 酶是 5 2核苷酸酶和钠钾2A TP 酶 , 线粒体膜的标志酶 中匀浆 , 600 g 离心 10 min , 去除细胞核和未破碎的 是琥珀酸脱氢酶 、细胞色素氧化酶和胆碱脱氢酶 , 内 [18 ] 细胞 ; 然 后 8000 g 离 心 10 min , 沉 淀 线 粒 体 ; 最 后 质网膜的标志酶是葡萄糖 26 2磷酸酶。测定标志 [6 ] 100 000 g 离心 20 min 沉淀细胞膜。本实验室采用 酶活性来验证细胞膜的纯度在上世纪 60 年代就开 始使用 , 到目前仍是最方便 、最常用的方法 。电镜观 该方法提取南美白对虾鳃细胞膜效果较好 。 察虽然能清晰看到膜结构 , 但只能作为膜纯度判定 1. 2. 2 蔗糖密度梯度离心法 密度梯度离心是一种的辅助手段 。 分离纯化的常用方法 。蔗 2 离体细胞膜在病毒受体研究中的应用糖性质稳定 、价格便宜是制备密度梯度的首选介质 。 破裂的细胞膜会因为膜骨架的作用很快卷曲成 分离纯化细胞膜采用蔗糖密度梯度的方法效果较 ( 囊泡 状 , 称 之 为 细 胞 膜 微 囊 plasma membrane vesi2 好 , 该方法根据细胞膜与细胞内含物密度的不同 , 通 ) cle。这些细胞膜微囊形状规则 , 大小较均一 , 直径 过超速离心使其分布在不同的蔗糖密度梯度中 , 然 [3 ] 大约在 100 , 600 nm 之间。形 态 学 观 察 、生 化 和 后分别取出 。许多学者提取细胞膜时采用了该方 [7,9 ] 血清学实验证明 , 这些细胞膜微囊在蛋白质 、脂类组 法 , 并获得了较好的结果。但是大多情况下 , 细 成和酶活性方面与活体细胞的细胞膜几乎完全相 胞膜的分离纯化需要差速离心和蔗糖密度梯度离心 [13 , 19 ] 同。这说明细胞膜微囊在提取过程中受损并结合使用 。 1. 2. 3 两相分配法 两相分配法是根据细胞膜脂溶 性的特点 , 将破 , 其抗原性与活体细胞膜抗原具有高度一致性 。 不大 碎的细胞放入两相溶液 , 一相是聚乙二醇 , 一相是葡 而且细胞膜微囊便于储存 , 在 220 存放 3 个月其抗 [20 ] 聚糖 。实验结果表明质膜对富含聚乙二醇的一相具 原性不发生明显改变。需要注意的是 , 这些细胞 有很高的亲和力 , 而线粒体膜 、内质网膜 、液泡膜则 膜微囊不具备活体细胞膜所具备的吞噬作用和物质 [10,12 ] 主要存在于界面和富含葡聚糖的一相。运输功能 。因此 , 病毒只能与敏感细胞来源的细胞 膜微囊结合而不会被吞噬 , 这就解决了用培养细胞 1. 2. 4 化学诱导法 为避免机械破碎对细胞膜的破做结合实验时结合作用与内吞作用不易区分的问 坏 , 有报道用化 题 。 学诱导的方法得到了纯度高 、完整性好 , 而且能保证另外 , 分离纯化的细胞膜微囊不含有细胞质和 ( ) 细胞膜外表面 extrocytoplasmic surf ace , ES 和细胞膜 细胞核的组分 , 因此 , 从细胞膜微囊中分离病毒受体 ( ) 原生质表面 protoplasmic surf ace , PS 不发生颠倒的 相对容易 。这也是细胞膜微囊应用于病毒研究的优 [13 ] 细胞膜微囊。对于培养细胞 , 这种化学裂解法广 势所在 。 [ 1 , 14 ] 泛应用于巨噬细胞 、成肌细胞 、纤维原细胞、成 2. 1 病毒受体结合实验 为了研究病毒与细胞膜上[ 15 ] 神经细胞瘤细胞和神经胶质瘤细胞、小白鼠胚胎 [16 ][17 ] 的病毒受体的相互作 细胞和乳内细胞。从报道看 , 该方法操 作 方 用 , 经常需要培养相应的细胞 , 作为实验材料 。但便 、细胞膜微囊产率高 、细胞膜活性受影响小 , 是一 种可以广泛使用的方法 。需要注意的是 , 具体到某 是 , 这样的实验结果会因为不同批次培养细胞之间 作用将是不理想的 。 病毒结合 。这种情况 , 需要对 SDS2PAGE 或转印后 [ 24 ] ) (的受体蛋白进行复性, 但是有些失活是可逆 、可Nieper , 1997用差速离心的方法 , 从鸡胚胎纤 以恢复的 , 有些则是不可逆的 。如果通过复性仍不 维原细 胞 中 分 离 纯 化 了 细 胞 膜 , 然 后 用 一 种 类 似 ( ) 能使 受 体 蛋 白 恢 复 结 合 活 性 , VO PBA 法 就 不 能 采 EL ISA enzyme linked immunosorbent assay 的方法 , 将 ( 用 。 细胞膜包被到固相 支 持 物 上 , 与 IBDV 病 毒 infec2 ) 2. 3 层析法分离受体蛋白tious bursal disease virus孵育 , 然后用抗病毒的抗体和 病毒受体在细胞膜上含量较少 , 且大多是跨膜 二抗检测 。结果显示 , 细胞膜与病毒的结合存在特 成分 , 常与糖类 、脂类紧密结合 , 虽然能用灵敏的方 异性和可饱和性 , 这与用鸡胚胎纤维原培养细胞做 法检测到 , 但是分离纯化绝非易事 。层析是其中一 结 合 实 验 得 到 的 结 果 完 全 一 致 。 J ulen et al . , 个有效途径 , 离子交换层析 、凝胶过滤层析和亲和层 ( )在另他的实验中 , 用化学诱导的方法得到了 1993 析在病毒受体研究中都有成功的应用 。尤其是亲和 ( Vero cell 的细胞膜微囊 , 然后用 S FV Semliki Forest [25 , 26 ] , 是专一分离受体蛋白最有效的途径。当层析 ) virus病毒分别与培养的 Vero 细胞 、牛血清白蛋白 然 ,大多数的实验需要多种实验技术联合使用 , 例 和细胞膜微囊做结合实验 。实验结果显示 , Vero 细 ()联合使用离子交换层析和亲 如 , Tong et al . , 1995胞膜微囊和培养的 Vero 细胞与 S FV 的结合情况基 ( 和层析技术分离得到了一个参与 DHBV duck hep 本一致 , 而且两者之间存在竞争结合 。牛血清白蛋 ) atitis B virus病毒侵染宿主细胞的 170 kD 的细胞膜 白则不仅不能与 S FV 结合 , 也不能竞争细胞膜微囊 [13 , 20 ]( ) 蛋白 。 Karger and Mettenleiter , 1996 综 合 利 用 了 和培养细胞的结合 。 VO PBA 和 亲 和 层 析 技 术 , 确 认 并 分 离 得 到 了 能 与 上述实验证明 IBDV 和 S FV 与鸡胚胎纤维原细 ( ) PrV pseudorabies virus 病 毒 结 合 的 3 个 细 胞 膜 蛋 胞膜和 Vero 细胞膜微囊的结合是特异性的病毒与 [27 , 28 ] 白。受体之间的结合 。这也提示我们 , 物理方法和化学 受体蛋白大多是与细胞膜紧密结合的 , 因此在 方法得到的细胞膜或细胞膜微囊能够替代相应的活 分离受体蛋白时 , 需要先提取细胞膜 , 然后用去垢剂 体细胞进行与病毒的结合实验研究 , 尤其是在研究 破坏细胞膜 , 将受体蛋白溶脱下来 。去垢剂有离子 病毒的感染范围和组织嗜性时非常有用 。 型去垢剂 、非离子型去垢剂和两性去垢剂 3 种 。离 2. 2 VO PBA 法鉴定病毒受体 病毒铺覆蛋白印迹分 子型去垢剂能使蛋白质以单体的形式被分离 , 但蛋 ( 析 Virus overlay protein blot 白质都发生了高度变性 , 这类去垢剂主要有十二烷 ) assay , VO PBA 是 一 种 鉴 定 病 毒 受 体 的 常 用 方 法 。 ( ) 基硫酸钠 SDS 和脱氧胆酸钠 。非离子型去垢剂较 登革热病毒 、麻疹病毒 、狂犬病病毒 、伪狂犬病病毒 、 离子型去垢剂变性作用弱 , 对分离受体蛋白较为有 牛病毒性腹泻病病毒等病毒受体的鉴定都应用了 [ 21,23 ] 利 , 然而在这种去垢剂中蛋白容易发生聚集 。这类 VO PBA 分析的方法。它是将细胞膜蛋白进行 去垢 剂 主 要 有 Triton X2100 , Tween220 , N P240 等 SDS2PAGE 后 , 转印至硝酸纤维素膜上 , 然后与相应 两性去垢剂的变性作用更弱 , 主要有 CHA PS , 因为 病毒孵育 , 确定能与病毒结合的蛋白带 。也有学者 其两性的特点 , 常用在离子交换层析中 。Le Maire 不单独 提 取 细 胞 膜 做 电 泳 , 而 是 将 细 胞 总 蛋 白 做 ) (et al . , 2000综述了去垢剂与细胞膜的作用机理及 SDS2PAGE , 然后转印 , 与病毒孵育确定与病毒结合 [29 ] 去垢剂在细胞膜蛋白分离中的应用。这方面的的带 。但是细胞总蛋白种类繁多复杂 , 容易与病毒 文献报道很多 , 在此不再讲述 。 发生非特异性结合 , 因此 , 首先分离纯化细胞膜然后 [21 ] 3 结束语做 VO PBA 是很有必要的。 VO PBA 虽然在许多病毒受体的鉴定中得到应 细胞膜的分离纯化技术在上个世纪 6 、70 年代 就已发展成熟 , 现在采用的方法大多是在那时的方 用 , 但是如果病毒受体不是单一多肽 , 或者病毒受体 的活性与空间构想密切相关 , 那么 SDS2PAGE 过程 法基础上略作修改 , 并没有非常大的改进与飞跃 223,33. 细胞膜本身的一些特性 , 如膜组分 、膜骨架 、物质的 宋千里 , 等. 生物化学与生物物理进展 , 1962 , 6 :67 . 10 跨膜运输等 。作者在对这些方法作了简要回顾的同 B runette DM , Till J E. J . Membrane Biol , 1971 , 5 : 325,329. 11 ( ) 王育东 , 阎隆飞 , 植物学报 , 1989 , 31 6:432,440. 时 , 重点综述了分离纯化后的离体细胞膜在病毒受 12 J ulen R , Wiesmann UN , Koblet HJ . Virol Methods , 1993 , 42 , 147, 体研究中的应用 。这方面的研究相对较少 , 但是根 13 152. 据已有的报道看 , 分离纯化的细胞膜是一个研究病 Scott R E , Rosenthal J . Immunol , 1977 , 119 : 143,148. Yavin E , Zutra A . Biochim Biophys Acta , 1979 , 553 : 424,437. 14 毒受体的好材料 , 在某些方面这些离体的细胞膜完 15 Scott R E , Perkins RG , Zschunke MA , Hoerl BJ , Marcklein PB . J Cell 全可以替代活体细胞并优于活体细胞 。这给我们研 Sci , 1979 , 35 : 229,243. 16 究病毒受体提供了一个很好的方法和思路 。 Moldovan NI , Radu AN , Simionescu N . Exp Cell Res , 1987 , 170 :499, 510. 17 孙志贤. 现代生物化学理论与研究技术. 北京 : 军事医学科学出 参 考 文 献 版社 , 1995 , 300,301. Scott R E. Science , 1976 , 194 : 743,745. 1 18 Donnell M E , DeL uca GM . Blackall DP , 1995 , 187 : 111,119. Maeda T , B alakrishnan K , Mehdi SQ . Biochim Biophys , 1983 , 731 :115 2 Nieper H , Muller HJ . Virol Methods , 1998 , 72 : 153,162. ,120. ( ) S alas2Benito JS , Angel RMDJ . Virol , 1997 , 71 10: 7246,7252. 19 ( ) 郭爱珍 , 陆承帄. 病毒学报 , 2000 , 16 2: 155,157. 3 1997 , 63 : 167 , J Virol Methods , S ankaran D , L au L CL , Lee Ng M . 20 尹崇 , 余健秀 , 庞义 , 胡晓军 , 李朝飞 , 王立华. 中国病毒学 , 2002 , 173 . 21 () 17 1:66,68. 4 Bearzotti M , Bernard D , Annie L , Anne2Marie L . 1999 , J Virology , 22 () 丰艳 , 吴景兰 , 苏安英. 河南医科大学学报 , 1996 , 31 1:10,12. () 73:7703,7709. 23 () Pardoe IU , B urness A TJ . Virol Methods , 1980 , 1 5: 285,298. 5 Hoppe Seylers Z Physiol Chem , 1979 , B auer HC , Ferber E , Golecki J R . () Dalziel RD , et al . J Gen Virol , 1991 , 72 8: 1905,1991. () 360 9: 1343,50. () Tong S , Li J , Wands J R , J Virol , 1995 , 69 11: 7106,7112. 24 ( ) Karger A , Mettenleiter TCJ . Virol , 1996 , 70 4:2138,2145. 6 朱厚础 , 等译. 蛋白质纯化与鉴定实验指南. 北京 : 科学出版社 , 25 1999 , 198,199. le Maire M , Champeil P , Moller JV . Biochimical et Biophysical Acta , 26 2000 , 86,111. () Boland JD , Tweto. J Biochim Biophys Acta , 1980 , 600 3: 713,729. 7 27 De Wolf MJ , Hilderson HJ , L agrou AR , Dierick WS . Arch Int Physiol 8 28 () Biochim , 1978 , 86 1:37,52. 29 ( ) Chakravarthy B R , Spence MW , Clarke J T , Cook HW , 1985 , 812 1: 9 欢迎订阅 2005 年《中国园艺文摘》《、中国农业文摘 - 畜牧》 《中国园艺文摘》《、中国农业文摘 - 畜牧》是农业部主管 、中国农业科学院科技文献信息中心主办的国家级刊物 。它 荟萃了百余种国内外科技期刊 、报纸和网站等媒体的精华 , 每期国内外园艺行业的产业分析 、科技进展 、市场动态 、实用 技术等全面 、准确 、可靠的信息近 300 篇 。 双月刊 , 64 页 , 大 16 开 , 每期定价 10 元 , 全年共 60 元 。《中国园艺文摘》国内刊号 CN11 - 4921/ S , 邮发代号 80 - 273 。《中国农业文摘 - 畜牧》国内刊号 CN11 - 2331/ S , 邮发代号 80 - 222 。欢迎订阅 , 也可汇款订购 。 地 址 :北京中关村南大街 12 号《中国园艺文摘》《、中国农业文摘 - 畜牧》市场部 联系人 :赵薇 邮编 :100081 电 话 :010 - 68975040 传真 :010 - 62132806 http :/ / www . ch - yy . com http :/ / www . 86 ap. com http :/ / www . zgxq. net E - mail : zgyy @caas . net . cn E - mail : zhaowei @mail . caas . net . cn