抗生素,亚硝基胍处理吸水链霉菌FC904原生质体对雷帕霉素产量 …

抗生素,亚硝基胍处理吸水链霉菌FC904原生质体对雷帕霉素产量 … 抗生素,亚硝基胍处理吸水链霉菌FC904原 生质体对雷帕霉素产量 … 福建医科大学1999年9月第33卷第3期289 termina1deoxynucleotideItransferasemediatedduTP—digoxigeninnickendlabelling (TUNEL)forA1andcorrelatedtheresultswithtumortype,clinica1stageandprognosis? ResultsAIexpressedin76.3~Acancertissues.Theexpressionwasassociatedwithtunlor clinicalstage(P<0.05),thelaterstage.thehigherexpressionofAI.AIalsoshowsnore一 1ationshipswithtissuedifferentiation(P>0.05),andsurvivaltime.Thestrengthofex— pressioninturuortissuealsoindicatesnostatisticalsignificancewithprognosis?Conclusion ExpressionofAIisrelatedtothebiologicbehaviorsofstomachcancer.TUNELassess— mentofAIexpressioninstomachcarcinoma/innormaltissuemightbeusefulfortailoring chemotherapyandpredictprognosis. Keywordstomachneoplasm;carcinoma;apoptosis (收稿:I999—06一O2修回:1999--07一I2) 卜 抗生素,亚硝基肛处理吸水链霉菌F0904 原生质体对雷帕霉素产量的影响?段了6flq 目的选择抗生索和化学诱变剂处理雷帕霉素产生菌的原生质体t筛选高产菌株. 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 分别用庆大霉索,丝裂霉索C,红霉素亚硝基胍处理吸水链霉菌 FC904(.hygro.~copicusFC904) 原生质体,比较它们对雷帕霉素产量的影响,并筛选高产菌株.结果庆丈霉紊的处 理效果较 好,从庆太霉索处理株中筛选刊商产菌株C14C14一I,其雷帕霉索的摇瓶发酵水平 (反相高效液相 色谱法测定)分别比原始株提高36t6o.结论用庆大霉索处理吸水链霉菌FC904原 生质 体是提高雷帕霉素产量的有效手段. 关键词呸查壁苎堕!琶自兰重,堡圭耍盐蘑变育种 雷帕霉素(rapamycin,RPM)是具有抗 真菌,抗肿瘤作用的新型强效免疫抑制剂,其 免疫抑制作用比环孢菌素A,FK506等强, 但对肾的毒性最低.吸水链霉菌(Strepto- myceshygroscopicus)FC904是福建省微生 物研究所从土壤样品中分离的能产生雷帕霉 索的吸水链霉菌,其发酵单位的高低直接关 系到生产成本用理化因素(包括抗生索)处 理产生菌的孢子或菌丝是诱变育种的常用方 法,本文则对产生菌的原生质体进行处理,并 1.福建医科大学傲生物学教研室(福州350004) 2.揠建省徽生物研究所(福州350007) 3.福建医科大学基因工程研究童(福州35000-t) 弛镀欲 通过筛选获得高产菌株. 1材料与方法 1.1菌株福建省微生物研究所保存,吸水 链霉菌(.hygroscop&us)FC904;白色念珠 菌(Candidaalbicans)C90. 1.2培养基菌丝生长培养基:葡萄糖,酵 母膏,蛋白胨,polypeptone等. 再生培养基R2YE见参考文献[1]. 孢子斜面培养基麦片,琼脂. 发酵培养基葡萄糖,麦片,酵母粉,蛋 白胨,黄豆粉,甘油,NaC1等. 生物检定培养基葡萄糖,蛋白胨. 290 1.3主要试剂及仪器硫酸庆大霉索,丝裂 霉索C,红霉素乳糖酸盐等抗生素.亚硝基胍 (NTG.FlukaInc.),原生质体缓冲液(P缓 冲液)_l.岛津LC一3A高教液相色谱仪 Fisher—lilly抑菌圈测量仪,旋转式摇瓶机. 1.4抗生素的最小抑菌浓度(MIC)测定 采用平板稀释法口]. 1.5原生质体的制备及再生见参考文献 E33.原生质体适当稀释后涂布于再生培养基 上,26?倒置培养10,1天. 1.6抗生素,NTG处理链霉菌FC904原生 质体抗生素和NTG溶液(以致死率95 的浓度)分别与原生质体液(1×10/m1)混 合t28C作用2,3h.NTG处理株需终止反 应,离心,弃上清液,原生质体沉淀用P缓冲 液洗涤两遍.吸取处理后的原生质体,适当稀 释,涂布于再生培养基,26?培养10,15天 挑取再生菌落接种于孢子斜面培养基,供发 酵. 1.7雷帕霉素F904的发酵及测定钩取 一 环诱变菌株的成熟孢子斜面培养物接种于 发酵培养基(30ml/250ml三角瓶),26c振 荡培养(200r/min)72h.每批发酵50~80 株,均设3个摇瓶链霉菌FC904为对照.发 酵液用甲醇抽提j,生物检测参见文献[5] 检定菌为白色念珠菌.同时用反相高效液相 色谱法(HPLC)测定发酵液中RPM的真实 含量采用外标法,波长277nm,色谱柱 YWG—C18,柱温40"(2,流动相甲醇:水=75 :25V/V,流速1ml/min.根据公式计算效 价: 搓量蝰亘担显拦量搓晶箍噩值墼 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品峰面积/进样量 2结果 2.1链霉菌FC904对抗生素的敏感度 链霉菌FC904对庆大霉素等氨基糖甙 类抗生素非常敏感(MIC0.1t~g/m1),其次 为丝裂霉素C(MIC10tzg/ml/,对利福平,氟 哌酸,四环素,氯霉素的MIC为5o,100gg/ mI,青霉索为1o.U/m1.对磺胺药及红霉索 不敏感(MIC分别为1000.15OOtzg/ml/根 据药敏实验结果选择庆大霉素,丝裂霉素C, 红霉素等作为菌种的处理药物. 2.2抗生暮,NrG的处理效果比较 以处理株的抑菌囤直径比对照株抑菌圈 直径>3.0mm为正变株.<3.Omlll为负变 株,其余的为不变株,从抗生素,NTG处理结 果( 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1)看出,红霉素的处理效果不明显不 变株达91.6N2'G处理效果较明显,不变 株为67.7.丝裂霉索C,庆大霉素处理后 不变株比例分别为71.6.80.7.所有变 异菌株中负变株均多于正变株.但以NTG 处理的负变株比例最高丝裂霉素C次之, 庆大霉素较低. 表1抗生素,NTG处理链霉菌FC904原生质体后 正负变抹的比侧() 23突变株的筛选 从363株庆大霉素处理株中筛选到25 株较高产量的菌株,摇瓶发酵水平比对照株 链霉菌FC904平均提高20,其中最低的提 高12,最高的为突变株C14,提高36设 菌株的菌落特征,孢子堆颜色及吸水时间都 与原始菌株链霉菌FC904有很大不同(表2, 图1).继续用庆大霉素处理C14原生质体, 获得另一高产突变株c14l,c14及C14-1 的摇瓶发酵水平见表3,图2从300株NTG 处理株中得到81株低效价菌株.平均摇瓶发 酵水平为对照株链霉菌FC904的67,最低 的突变株C75产量仅为对照菌株的35. 福建医科大学1999年g月第33卷第3期 表2突变株C14主要培养特征 *:颜色比较参照《色谱}(北京:科学出版杜) 表3突变株c]I,C14—1的摇瓶发酵水平() 连续5状测定结果平均值 29l 3讨论 抗生素的诱变作用虽然较温和,但是已 有不少育种工作者应用抗生索处理获得高产 菌株].原生质体设有细胞壁,可能对外界的 化学信号较完整的细胞更为敏感,有利于诱 变.本文采用庆大霉素直接处理链霉菌 FC904原生质体,提高雷帕霉素产量,简便有 效,对降低生产成本具有实际意义.至于变株 c14,C14—1的稳定性还有待进一步研究.在 抗生素筛选中常会出现产量低的代谢途径障 碍突变株或"零"变株,对这些变株再处理后 所得到的回复突变株往往产量比亲株高[1. 低产菌株C75,继续处理后,其产量是否能回 复抑或更低,有待于进一步研究. 雷帕霉素具有抗酵母样真菌的作用,其 抗菌机制与免疫抑制机制相似0,因此在筛 囤2链霉菌FC904及其突变株发酵液提取物的HPLC 峰谱 a:突变摊c75Ib:原始菌株链霉苗FC904Ic:突变株C14I d:突变株C14-1. 选中使用白色念珠菌Candida albicansC9'3为生物检定菌.由于产 生菌发酵液中还含有非雷帕霉素类 型抗真菌成分,因此,在采取生物检 测的同时,须应用HPLC进一步检 测RPM在发酵液中的真实含量. (图1见封三) 参考文献 1邓于新,唐纪良链霉茵遗传操作手册. 长沙:湖南科学技术出版杜,1988:168, 173 2车仲*?郑家齐,事家宏.诊断细茸学.香 港t黄河出版社.1992:57O,513 3强华,黄捷-暧水链霉菌FC9~4 (Streptomyces^…FC904)原 质体形成的影响因素福建医科大学学 报.1999}33:162 4ChengYR,FangA,DemainA1..Ef~ctof aminoacids0nrapamycinb[osyntb.esisby Streptomyce$groscopicu.月,Microbi- 292 0fBiotec,1995;43:1096 5KojimaI,ChcngYR-MobanV,etalCarbonSOUrCe nutritionrapamycinbiosynthesisinStreptom2mp~- gr~copicus.JMicrobiol,1995;i4{436 6陈代杰,朱宝泉.工业微生特茼种选育与发酵控制技术 IourmIofFujianMedkalUmversttyVol33Sep.,1999 上拇:上海科学技术文献出版社,1995:l47,170 7Sehga[SN.gapamune(S[notimus,Rapamycin):An overviewandmechanismofaction."17zerDrugs肘. 1995}17{660 EffectsontheProductionofRapamycinbytheTreatment ofProtoplastsofStreptomyceshygroscopicusFC904 withAntibioticsandNitrousGuanidine QiangHue1,HuangJie2,ChenYikai3,etal (1-DepartmentofMicrobiology,FullanMedicalUniversity,Fuzhou,350004 2-FeJlanInstituteofMicrobiology,Fu~ou,350007 3Labc~'atoryofGeneticEngineering,FuifanMedicalUniversity,Fuzhou,3500叫) ObjectiveToscreenhigher—producingstrainsbythetreatmentofprotoplastsofS.hy groscopicusFC904withantibioticsandnitrousguanidine(NTG).MethodsProtoplastsof S.hygroscopicusFC904weretreatedwithgentamicin,erythromycin.mitomyeinCorNTGre spectively.Effectsoftheseagentsonrapamycinproductionwerecomparedandthehigh yieldingstrainswerescreened.ResultsThetreatmentwithgentamicinhadabettereffect onimprovingtheproductionofrapamycin.HigherproducingstrainsC14andC14—1were obtainedfromthegentamicin-treatedstrainswiththeirRPMtiterofbroth(assayedby HPLC)increasedby36and60respectivelyascomparedwiththat'oftheoriginalstrain S-hygroscopicusFC904.ConclusionThetreatmentofS.hygroscopicusFC904protop]asts withgentamiciniseffectiveforimprovingtheproductionofrapamycin. KeywordsStreptomyceshygroscopicus;rapamycin;protoplast;mutationbreeding (收稿:1998—11-05修回:l999一O3—19) 《福建医科大学》编辑部启事 本刊编辑部现存有1990年以来出版的各期厦1990年以前出版的部分刊期(每 册均为2元);1994年以来出版的增刊(1994,1995年每册5元,1996~1999年每册10 元).有 需要者,请经邮局汇款,每册另加邮资I元,挂号邮资2元.编辑部地址:福州市变通 路88号 《福建医科大学》编辑部(邮编350004),电话:0591—3357293