L-精氨酸生物合成的代谢流量分析

微 生物学通报 M icrobiology tongbao@im．ac．cn L．精氨酸生物合成 MAR 2O，2008，35(3)：395~401 @ 2008 by Institute of Microbiology．CAS 的代谢流量 朱进伟 陈青山 张伟国 (江南大学_[业生物技术教育部重点实验室 无锡 214122) 分析 摘 要：建立并完善了谷氨酸棒杆菌 GWY020及其 2个逐步叠加不同遗传标记的突变株 HUI821 和 GU1089合成 L．精氨酸的中心代谢网络。分别测定了它们在特定培养时段(50 h～52 h)L一精氨酸 等代谢物的胞外浓度，由此计算这一时段这些代谢物在发酵液中积累(或消耗)的速率，分别作出 这 3株菌在拟稳态下的代谢流量分布图，进而研究育种过程中不同遗传标记的叠加对代谢网络中 L一精氨酸合成流量分布的影响。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明遗传标记的引入使流量分配发生了重大变化，节点处的 流量分配朝着有利于 L一精氨酸合成的方向改变。从代谢流量分析角度上，证明结构类似物抗性和 敏感性突变是代谢流导向和设计育种的有效手段，代谢流量分析将成为设计育种的提供新思路。 关键词：L一精氨酸，谷氨酸棒杆菌，代谢流量分析 M etabolic Flux Analysis of L-Arginine Fermentation in Corynebacterium glutamicum ZHU Jin—Wei CHEN Qing．Shan ZHANG Wei．Guo (The Key Laboratory oflndustrial Biotechnology，Ministry ofEducation，Jiangnan University，Wuxi 214122) Abstract：In this Paper，metabolic networks of the Corynebacterium glutamicum GWY020 and the two de— rivatives carrying additional mutations HUI821and GU1089 were established and modifled．The concentra． tions of extra．cellular metabolites were determined under sub—steady，state(50 h-52 h1 of the batch culture． The metabolic flux distribution maps of the three strains were obtained．compared and analyzed．These re— suits indicate that the introduction of analog supersensitive marker or analog resistant marker skew the metabolic flux towards the form ation of L—Arginine．This study revealed the usefulness of the metabolic flux analysis as a tool for verification of existing production strains．The analysis may play an important role in helping US to rationally re—design metabolism for further improvement of ferm entation process． Keywords：L—Arginine，Corynebacterium glutamicum．Metabolic flux an alysis L一精氨酸是合成蛋白质和肌酸的重要原料，是 人和动物体内的半必需氨基酸。由于L一精氨酸具有 众多生理功能，现已广泛应用于医药和食品等领 域。因此早在 20世纪 70年代国外就开始研究发酵 通讯作者 ：Tel：0510—85329312；函 ：zhangwg168@126．com 收稿日期：2007．07．12；接受日期：2007—09．06 法生产 L一精氨酸。日本在这方面的研究处于领先水 平，他们对黄色捧杆菌进行诱变，突变株产酸可达 40 g／L⋯。目前国内有少量采用水解法生产 L一精氨酸， 发酵法生产仅限于实验室水平，是我国药用氨基酸 维普资讯 http://www.cqvip.com 396 微 生物学通报 2008，Vo1．35，No．3 生产的“瓶颈”品种。目前我国 L一精氨酸产量在 30 g／L～40 g／Li 】 ， 但由于产酸水平不稳定等原因， 未能应用于工业化生产。 1991年 Bailey等正式提出代谢工程的概念， 利用代谢工程的原理研究、改进和拓展细胞的代谢 特性，已成为生物领域研究的热点之一。代谢流量 分析(metabolic flux analysis，MFA)[51是代谢工程中 用以指导遗传操作的重要工作，是代谢网络分析的 基本 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。这种分析方法根据胞内主要反应的化学 计量模型和胞内代谢产物的质量平衡来计算胞内的 代谢流量。它的基础是拟稳态假设：假设在产物形 成速率最快的阶段各种中间代谢物的胞内浓度变化 速率为 0。根据质量平衡由 n个中间代谢物即可得 到 n个关于速率的方程，通过测定胞外代谢产物的 浓度，计算未知途径的流量【6．8】，从而得到胞内代谢 流的分布模式。本文通过对菌种选育过程中所得到 的不同突变株发酵过程的研究，测定遗传标记不同 的 3株菌 GWY020及其突变株 HUI821和 GU1089 在 L一精氨酸形成阶段的相关代谢物的胞外浓度，得 到它们在 L一精氨酸形成阶段的代谢流量分布图，并 对它们的代谢流量分布进行比较和分析，研究了育 种过程中遗传标记的叠加对L一精氨酸合成网络中流 量分布的影响。目前很少有关于L一精氨酸合成代谢 流分析这方面的报道。 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1．1 菌株 谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) GWY020(SGr,AE )及其 突 变 株 HUI821(SGr,AEr， Suc ，D—Arg )和 GU1089(SG ，AE ，Suc ，D—Arg ，Pro )， 实验室筛选保藏。 1．2 培养基 1．2．1 基本培养基：葡萄糖 20 g／L，(NH4)2SO4 1．5 g／L，尿素 1．5 g／L，KH2PO4 1 g／L，MgSO4·7H20 0．5 g／L，FeSO4·7H20 0．02 g／L，MnSO4·4H20 0．02 g／L， 生物素 50 g，L，硫胺素 200 g，L，琼脂条 20 L， pH7．0，0．1 MPa压力下灭菌20 min。 1．2．2 完全培养基：葡萄糖 10 g／L，蛋白胨 10 g／L， 酵母膏 10 g／L，NaCI 5 g／L，琼脂条20 g／L，pH7．0， 0．1 MPa压力下灭菌 20 min。 1．2．3 种子培养基：玉米浆25 g／L，葡萄糖 25 g／L， http：／／journals．im．ac．cn／wswxtbcn (NH4)2504 5 g／L，KH2PO4 1 g／L，MgSO4·7H20 0．5 g／L， CaCO310 g／L，pH7．0，0．1 MPa压力下灭菌 20 min。 1．2．4 发酵培养基：葡萄糖 90 g／L，(NH4)2s0420 g／L， 玉米浆20 g／L，KH2PO4 1．5 g／L，MgSO4·7H20 0．5 g／L， 生物素80 g，L，CaCO3 30 g／L，pH7．0，0．07 MPa压力 下灭菌 7 min。 1．3 分析方法 1．3．1 还原糖测定：菲林试剂法 】。 1．3．2 pI-I测定：pHS一2C型精密数显酸度计测定。 1．3．3 菌浓测定参见文献【10】： 1．3．4 L．精氨酸含量测定：采用坂口改良法和氨基 酸自动分析仪。 1．3．5 有机酸测定：发酵液离心取上清液，用3％的活 性炭脱色，同时用终浓度 70％的乙醇沉淀蛋白质，再 离心取上清液，进样测定有机酸含量，柱条件为：色谱 仪：HPll00；色谱柱：ZORBAX SB Cl84．6mmxl50 mm； 流动相：0．1 moL／L磷酸二氢钾缓冲溶液+5％甲醇(磷 酸调pH至2．5)：流速：1 mIJmin；柱温：25℃；进样 量：5 L：检测器：紫外检测器；检测波长：210 nm。 1．3．6 氨基酸测定：氨基酸自动分析仪。 2 结果和讨论 2．1 L．精氨酸合成的化学计量式 分析 L一精氨酸的生物合成途径可知，首先， L一精氨酸的合成需要碳源，碳源由葡萄糖(Glc)提供， 然后葡萄糖经 EMP途径(部分葡萄糖经 HMP途径) 降解为 L一精氨酸合成所需的前体碳单位丙酮酸 (PYR)；氮源由谷氨酸(Glu)和 G【一酮戊二酸(G【一KG)通 过转氨基反应提供。假定葡萄糖经 EMP途径降解， 列出与L一精氨酸合成相关的主要代谢途径的总化学 计量关系如下： 磷酸转移酶系统(PTS)： 一 GIc+PEP+PYR+G6P=0 (1) EMP途径 ： 一 G6P+PEP+PYR+2NADH+2ATP=0 (2) L—Arg的合成： - 2Glu-2 PYR-2NH3一NADPH-2NAD +A唱+20卜 KG+5H2O+2NADH+2NADP =0 (3) 转氨酶： 一 NH3—0【一KG—NADPH+Glu=0 (4) 将上述反应式求和可初步得到L一精氨酸生物合 成的总化学计量式： 一 Glc一4NH3—2NAD~-3NADPH+Arg+5H20+ 维普资讯 http://www.cqvip.com 朱进伟等：L一精氨酸生物合成的代谢流量分析 397 2NADP +4NADH+2ATP=0 (5) 对于包括L．精氨酸在内的一般代谢产物的合成， 如果胞内存在转氢酶，由于转氢酶可逆催化 NADH 和 NADPH 之问氢的转移反应(NADPH+NAD= NADP+NADH)，可将 L．精氨酸合成总反应所净得 的 NADH转化为还原力 NADPH，则合成 L．精氨酸 就不再需要另外供应 NADPH，那么 L一精氨酸生物 合成的总化学计量式应为： 一 Glc—4NH3—3NADPH+A唱+5H20+2NADP + 2NAD +2ATP=0 (6) 如果胞内不存在转氢酶，即便是反应过程中能 够额外生成 NADH，它还是无法转化为还原力 NADPH，那么就需要由额外的葡萄糖经磷酸戊糖 (HMP)途径氧化以提供更多的还原力，HMP途径总 化学计量关系： - G6P+6COz+12NADPH=0 (7) 而由以上所得到的 L．精氨酸合成总反应可见， 如果不存在转氢酶，则还需要 1／4 mol的 Glc进入 HMP途径以提供还原力。(1)与(7)相加得： 一 Glc—PEP+PYR+6COz+12NADPH=0 (8) (8)乘以 1／4再与(5)相加得到在考虑辅因子同时 不存在转氢酶的条件下，L一精氨酸生物合成的总化 学计量式： 一 5Glc—PEP一16NH3—8NAD +PYR+4Arg+ 6CO2+20H20+1 6NADH+4NADP +8ATP=0 (9) 由式(9)可得出，每消耗 5／4 mol葡萄糖可以生 成 1 mol的 L一精氨酸，即L．精氨酸的最大化学计量 摩尔转化率为4／5=0．8 mol／mol。 2．2 L．精氨酸形成阶段各菌株的胞外代谢产物浓 度的测定 从L一精氨酸的生物合成的代谢网络(图2A)分析 可知，L一精氨酸的碳架物质、能量及还原力主要由葡 萄糖经中心代谢途径后提供，所以，本研究主要考 虑了与 L．精氨酸合成相关的途径，除 HMP途径(主 要用来提供还原力 NADPH)、EMP途径和 TCA环 所组成的中心代谢途径外，还包括甘氨酸、异亮氨 酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸及赖氨酸 的合成途径。同时，考虑了有机酸的合成途径，丙酮 酸(PYR)是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化而来的，为 了考察葡萄糖经EMP途径降解后，PEP和PYR在代 谢过程中的流量分配，所以考虑丙酮酸的代谢途径； 乳酸和乙酸在有机酸合成网络中与丙酮酸直接相关， 所以也对乳酸和乙酸的合成途径进行了考察。 将菌体接入种子培养基和发酵培养基进行发酵， 绘制出谷氨酸棒杆菌GWY020及其突变株的发酵过 程曲线，如图 1所示。由发酵过程曲线可知，发酵进 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 tfh) 8 — 6 4 在 0．8 0．6 Q 0．4Q 2O l6 l2 8 4 O O lO 2O 3O 4O 5O 6O 7O 8O 9O t(h) ◆残糖：◇OD；ApH；△L一精氨酸 ~Reducing sugar；◇OD；A Ph；△L—Arginine 图1 GWY020及其突变株的发酵过程曲线 Fig．1 Fermentation time courses of GU1089 and its mutants 行到50 h一60 h这一阶段的L．精氨酸的积累速率最 快，可以假设此阶段处于拟稳态，各种代谢物的胞 内积累速率为0t引。因此，分别测定发酵进行到 50 h 和 52 h的出发菌株及其突变株的胞外代谢产物浓 O 8 6 4 2 O 王A口磊一 一 ∞I1∞∞cl。I1 8 2 O 8 6 4 2 O l l O O O O O 2 O 8 6 4 2 O }{A口磊一 一 ∞I1∞暑ul。I1 qQ 2 O 8 6 4 2 O l l O O O O O 王A pu日一 一 ∞I1∞暑ul。I1 维普资讯 http://www.cqvip.com 398 微 生物学通报 2008，Vo1．35，No．3 度，研究它们在 L一精氨酸形成阶段的代谢流量分布 情况。 表 1列出了出发菌株GWY020及其突变株分别 发酵到 50h和 52h发酵液中的还原糖 、氨基酸和有 机酸等的胞外浓度。根据表 1所示数据，按下式计 算代谢产物积累速率，结果见表 2。 V=(C52一C5o)X 1 000／2MW 其中，V为底物消耗速率或代谢产物积累速率，单位 为 mmol／L．h；C5oh，C52h分别为发酵进行到 50 h 和52 h时代谢产物的胞外浓度；Mw 为对应代谢产 物的分子量。 2．3 L．精氨酸形成阶段各菌株的代谢流量分配的 计算 设 V1、V2、V3⋯⋯分别为图 2A所示途径的代 谢流量，假定 L一精氨酸形成阶段代谢处于拟稳态， 此时各种中间代谢产物的累积速率为 0，由质量平 衡得 ： V1= V2+V3+ V4+ V5+V6+V7+V8+V9+ V10+V11+Vl2+V13+VpYR 根据图 2A 中的数量关系可以计算出谷氨酸棒 注：括号内数字表示代谢产物的分子量。 Note：The moleculer weight of compounds mark in bracket． http：／／journals．im．ac．cn／wswxtbcn 维普资讯 http://www.cqvip.com 朱进伟等：L．精氨酸生物合成的代谢流量分析 399 注：表中所有代谢物的速率为 mmol／L·h，葡萄糖代谢速率为消耗速率。 Note：Unit of velocity of the exocelluar metabolites is mmol／L·h． ：Assuming that consuming velocity of the glucose is 1 00 mmol／L．h． 赖 丛 葡萄糖 3．磷 鲁油 甘氨酸 3．磷酸甘油酸— 兰_．甘氨酸 磷酸烯 丙酮酸 ．苯丙氨酸 I 异亮氨酸 v 乳酸 ===丑 乙酸 ＼ 丙氨酸 ．酮异戊酸 谷氨丞 氨酸 A、代谢流量计算网络圈 葡萄糖 3．磷酸 船 甘氨酸 3．磷酸 々自酸 §甘氨酸 177 894 磷酸烯醇式-丙酮酸 阿氨酸 ， ． f 谷氨酰胺 脯蠡酸精氨酸 B、GWY020fl~代谢流量分布图 图 2 代谢流量的计算 网络图和 GWY020的代谢流量 Fig．2 Calculation of metabolic flux map and metabolic flux distribution map of GW Y020 杆菌 GWY020及其突变株的代谢流量分布图，将葡 萄糖的消耗速率计为 100(表 2所示)，从而得到各菌 株的流量分布图，如图 2B和图3所示。 2．4 出发菌株GWY020与其突变株代谢流分析结 果比较 人们通常认为目的产物的产率偏低是由于相关 葡萄糖 l 66．308 3．磷 甘油酸— 甘氨酸 I65．218 葡萄糖 3．磷酸 籍i — 7 甘氨酸 l 84-544 磷酸烯醇式丙酮酸 上嗡 苯丙氨酸 A、HUI821的代谢流量分布图 B、GU1089的代谢流量分布图 图 3 HUI821和 GU1089的代谢流量分布图 Fig_3 M etabolic flux distribution maps of HUI821 and GU1089 酶系或酶级联反应限制了产物的合成能力。但有研 究结果表明，尽管产物的合成速率被特定产物合成 途径相匹配的全部酶活所控制着，但产物的最终产 量却是各种中间代谢物分支点处流量分配的综合结 果。在代谢网络中，将两个或多个不同途径的分支 汇合点称为节点。细胞内某种产物的产量与代谢物 http：／／journals．im．ac．cn／wswxtbcn 茶 ＼ 酸＼ 一 酸 l 目 l 寸／夕 酸 陷 氨 氨 亮 缬 ＼ ＼ ， ＼1 一 ～ 维普资讯 http://www.cqvip.com 微 生物学通报 2008，Vo1．35，No．3 的流量分配状况密切相关，这种流量分配在构成代 谢网络的所有可能的节点处均会涉及并产生不同程 度的影响。其中，对目的产物的形成具有重要影响 的节点称为主要节点。根据 L．精氨酸合成的代谢网 络，对影响 L．精氨酸合成的主要节点丙酮酸和谷氨 酸处的流量进行分析，研究出发菌株及突变株对节 点处的流量分配产生的变化以及对L．精氨酸合成的 影响。 2．4．1 丙酮酸节点处的流量分析：丙酮酸节点处的 流量分布比较复杂，它的流向比较多。从 3株菌的 流量分布图可看 到流入丙酮酸 的流量分别是 78．639、66．308和 85．013。分析出现这种情况的原 因主要是菌株 HUI821的耐高糖浓度的能力较出发 菌株 GWY020下降，而菌株 GU1089在定向选育中 提高了糖浓度，使菌株 GU1089的耐高糖浓度的能 力提高，使葡萄糖流向EMP途径的流量有所提高。 另外在丙酮酸节点处菌株 HUI821较出发菌株 GWY020流向亮氨酸和丙氨酸的流量减小幅度较 大。除出菌株自身的调节外，主要是在发酵过程中 向菌株 HUI821的培养基中加入了适量的氨基酸 (注：在计算氨基酸量已减去)，通过数次对比实验发 现添加适量的亮氨酸和丙氨酸，菌体就不用过量合 成，故其流量有不同程度的减少。 2．4．2 谷氨酸节点处的流量分析：谷氨酸是精氨酸 和合成的前提物质，是合成精氨酸 9步直链反应的 第一反应物，它的流量分配直接关系到积累精氨酸 的量。从图 3中可看出菌株HUI821和菌株 GU1089 流入谷氨酸的流量都有所增加，其原因是菌株 HUI821和菌株GU1089都分别以不同浓度的琥珀酸 (Suc)为唯一碳源进行定向选育。选育以琥珀酸(Suc) 为唯一碳源的突变株，可使其羧化支路加强而使草 酰乙酸的供应大幅度增加，从而提高谷氨酸对糖的 转化率，更多地积累 L．精氨酸的前提物谷氨酸。另 外，菌株 GU1089较出发菌株 GWY020的谷氨酸流 向 L．精氨酸流量变化较明显，其原因有二。一是菌 株 GU1089的L．精氨酸的前提物质谷氨酸流量增加， 势必 L．精氨酸的流量增加也有所增加：二是菌株 GU1089是 D．精氨酸抗性突变株。D．精氨酸可部分 解除精氨酸对乙酰谷氨酸激酶等关键酶的抑制和阻 遏，使精氨酸合成酶系的酶活性增强，从而使从谷 氨酸到精氨酸的代谢途径较为通畅。而株菌HUI821 较菌株 GU1089的谷氨酸流向 L．精氨酸流量变化也 http：／／joumals．im．ae．cn／wswxtbcn 显著，原因除了前面所讲的 L．精氨酸的前提物质谷 氨酸流量增加外，主要是株菌 HUI821还具备脯氨 酸敏感型(Pro )标记，当脯氨酸生成量达到突变株 HUI821对脯氨酸的敏感浓度时，谷氨酸流向脯氨酸 的途径将会大大的削弱，使谷氨酸由原来 3个主要 流出方向变成主要两个方向，进而 L．精氨酸的流量 有了显著的提高。 2．5 代谢育种策略 根据突变株 GU1089的代谢流量分布图，对该 菌下一步选育高产菌提出如下策略： 1) 副产有机酸、氨基酸的代谢流量仍较大， 在突变株 GU1089中占总流量的 54．4％，尤其是乳 酸、乙酸占有份额较大，可从遗传角度和发酵控制 方面使这些副产有机酸、氨基酸的生成较少，达到 代谢流迁移的目的，从而增大精氨酸合成前体物谷 氨酸的代谢流。 2) 通过选育结构类似物抗性突变株，进一步 解除精氨酸对关键酶乙酰谷氨酸激酶等关键酶的反 馈抑制和阻遏，增加从谷氨酸到精氨酸代谢途径的 通畅性，从而大量积累精氨酸。 3) 进一步提高EMP途径的通量，如抑制6．磷 酸葡萄糖脱氢酶活性从而达到削弱 HMP途径的目 的，选育耐高糖浓度的能力菌株。 4) 强化丙酮酸到Oc．酮戊二酸途径，可继续选 育以琥珀酸(Suc)为唯一碳源的突变株提高菌株对 CO2的固定能力，同时削弱Oc．酮戊二酸向琥珀酸的 进一步代谢，可考虑添加某些表面活性剂等达到削 弱此途径不影响Oc．酮戊二酸生成的目的。 3 结论 建立并完善了菌株 GWY020及其突变株合成 L．精氨酸的中心代谢网络。根据胞内主要反应的化 学计量模型和胞内代谢产物的质量平衡计算出了代 谢流量并对 3株菌的代谢流量主要变化节点进行了 相关的分析比较，结果表明遗传标记 SG 、AE 、 Sucg、D．Arg 和 Pro 的引入使流量分配发生了重大 变化，节点处的流量分配朝着有利于 L．精氨酸氨酸 合成的方向改变。菌株GWY020及其突变株HUI821 和 G u 1 0 8 9流 向 L．精氨 酸 的流 量分别 为 5．710 mmol／L·h、19．065 mmol／L．h和 38．75 mmol／L．h， 分别占总流量的7．26％、28．75％和44．56％。代谢流 量分布的变化趋势与L．精氨酸产量的变化趋势是互 维普资讯 http://www.cqvip.com 朱进伟等：L一精氨酸生物合成的代谢流量分析 401 相吻合的。在代谢流量分析的层面上，证明通过设 计育种结构类似物抗性突变和结构类似物敏性突变 定向引导代谢流量是微生物育种的一种有效手段。 参 考 文 献 [1】Hajime Y，Kazumi A，Kivoshi N．L—Arginine Production by Arginine Analog—resistant M utants of M icroorganisms． Agric Biol Chem，1981，45(4)：959—963． [2】路志强，龚建华，丁久元．L一精氨酸诱变育种的研究． 微生物学报，1988，28(2)：131—135． [3】王 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除了已有的微生物学、病毒学、基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程之外，基因组学、代谢工程、纳米 科学、生物炼制、生物质能等也逐步成为微生物学研究的热门领域。为了更加系统、集中地反映各个领域 的研究成果，以及该领域学科的热点难点问题，充分发挥 《微生物学通报》的学科引领和导向作用，促进学 科发展，为某个领域的科研人员提供一个交流的平台，《微生物学通报》编委会决定自2008年起，每年出版 一 定数量的专题刊。专题刊将系统地反映微生物学相关领域或新学科生长点的最新进展，及时介绍国内外微 生物相关前沿领域的突破性成果，以及面向国家和社会发展需要并具有重大应用前景的研究成果。真诚欢 迎本领域各学科的学术带头人，申请并组织专题刊。申请得到编委会批准后，申请人将被邀请担任本专题刊 的特约编辑，负责组织稿件、确定审稿专家，并撰写专题刊序言。 根据专刊工作 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 ，编辑部已开始接受 2008年度专题刊申请，现将有关事项通知如下： 1．专刊申请的有关规定附在通知的下面，请申请者仔细阅读： 2．提交形式：请到我刊主页(http：／／journals．im．ac．cn)的“下载专区”下载专题刊申请表；填写好之后，以 E．mail附件的形式发送到编辑部信箱：tongbao@im．ac．cn，并请在邮件主题中注明：“专题刊申请” 字样： 3．申请者如有疑问，请咨询编辑部，联系方式：邮箱 tongbao@im．ac．cn或电话 010-64807511。 微生物学通报》编辑部 2007年 8月 29 日 维普资讯 http://www.cqvip.com